专利名称：人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种将人类羊膜上皮细胞体外同丝素蛋白支架构建复合体的方法。
背景技术：
中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后的治疗和功能重建仍是当今生物医学界一大难题，传统观念认为，损伤后神经元以及轴突几乎无自发再生能力，从而阻碍了 CNS的自身修复功能。Aguayo等在20世纪80年代研究发现，CNS轴突是可以再生的，只是中枢神经微环境不利于其再生，因此必须进行有效的外部干预来激发残留的神经元或进行细胞移植替代，诱导受损神经轴突再生，恢复神经冲动在损伤部位的传递，最终达到功能恢复。以往研究者利用羊膜组织对损伤的神经进行物理性“桥接”使其能够继续生长修复，近年来，研究发现AECs许多新特征，其中尤以AECs对神经系统的作用最为引人瞩目其与神经组织良好的整合性，分泌神经营养因子及免疫耐受性使得AECs在治疗CNS疾病中得到了很好的应用。AECs移植修复CNS损伤的策略主要包括补充失去的神经元以及改善损伤部位微环境两个方面。AECs可 填充损伤部位充当细胞桥，引导再生性出芽，同时抑制胶质细胞的过度增生，其自分泌神经营养因子可以改善损伤部位的微环境，进一步刺激残存神经元与轴突的再生。蚕丝由丝素和丝胶两种蛋白组成，用胰酶去除丝胶后可制成为丝素蛋白支架。丝素蛋白是一种具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料，具有理想的三维空间构型，为细胞的停泊、生长、繁衍、新陈代谢、新组织形成提供支持。该支架的降解产物不对细胞繁殖产生不利的影响；其降解速度与细胞的增殖速度相匹配；具有一定的柔韧性，使之既能同机体组织紧密贴合，又不会对机体组织造成机械损伤等。近年来，丝素蛋白这种天然高分子纤维蛋白已广泛应用于组织工程研究。本研究将羊膜细胞同丝素蛋白构建成复合体的体外细胞培养体系，观察细 胞生长增殖过程，为组织工程最终应用于临床提供前期准备。
发明内容
本发明应用体外细胞培养技术构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体。具体的方法步骤包括S1:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约l_2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入O. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分钟，用PBS液IOOml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，IOOOrpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的RPMI1640的培养皿中，于37°C含5%C02的培养箱内培养。
S2 :原代细胞的纯化对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(I)在培养液中加Λ Ara-C,作用浓度为10_6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养Id。(3)再次向培养皿中加入Ara-C，作用浓度为10_7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养Id。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，O. 25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/min离心5min，弃上清后全培养基继续培养。S3 :原代细胞的鉴定取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为lX106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4° C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。S4 :羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为I X 106/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI 1640全培养基，令细胞完全浸没，2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。S5 :扫描电镜观察第十天取出支架复合物标本放入2. 5%戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞的生长情况。本发明将具有多分化潜能的羊膜上皮细胞同具有着良好生物相容性和生物降解性的丝素蛋白支架构建复合体，这种空间立体化培养的结果是明显促进了细胞的增殖、分泌，该发明为组织工程学应用于中枢神经系统损伤的修复作好了准备。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的体外构建人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法步骤流程图。
具体实施例方式主要实验仪器倒置相差显微镜CK-40型(日本Olympus)、荧光显微镜BX-51型(日本Olympus)、数字成像系统DP-50 (日本01ympus)、C02培养箱(SPXCorporation)、流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)、离心机TDL-5 (上海安产科学仪器厂)、恒温冷冻切片机CM1900型(德国Leica)、培养皿、培养板(美国Corning公司)、超净工作台(苏州苏净安泰公司)、深低温冰箱 MDF-382E (SANYO Corporation)、紫外分光光度计(北京欧普特)。主要材料试剂RPMI1640(Gibco公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国Sigma公司)，青霉素、链霉素(Gibco/BRL),EDTA(Sigma)，焦油紫(上海凯试科技)，PE或FITC标记的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、⑶49d、HLA-DR单克隆抗体(美国BD公司)，N2辅助因子(上海索莱宝公司)，bFGF、EGF (上海欣百诺生物科技公司)，L-Glutamine (美国Invitrogen), mIGF (以色列ProSpec-Tany公司)，甲状腺素(美国Magical Scientifi c，LLC. )，RT-PCR试剂盒和Galc、MBP检测试剂盒(Promega 公司)，Trizol 试剂(美国 Invitrogen),鼠抗人 GFAP IgG 单抗(Santa Cruz), 抗人MAP IgG单抗(Transduction Laboratories),鼠抗人NFIgG单抗(Sigma),鼠抗人GalcIgG单抗(Sigma),鼠抗人MBP IgG单抗(Cymbus), ant1-neuN (北京博奥森生物技术)，丝素蛋白支架(由苏州大学材料工程学院提供)，H0echst33342 (Sigma公司)，HRP(Boster),TMB 显示剂(AMRESC0 分装)，鼠抗人 Vimentin IgG 单抗(Santa Cruz)，鼠抗人 CK19 IgG 单抗(上海信然生物)。所述人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体构建的方法包括如下步骤S1:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约l_2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入O. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分钟，用PBS液IOOml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，IOOOrpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的RPMI1640的培养皿中，于37°C含5%C02的培养箱内培养。S2 :原代细胞的纯化对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(I)在培养液中加Λ Ara-C,作用浓度为10_6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养Id。(3)再次向培养皿中加入Ara-C，作用浓度为10_7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养Id。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，O. 25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/min离心5min，弃上清后全培养基继续培养。S3 :原代细胞的鉴定取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为lX106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4° C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。S4 :羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为I X 106/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI 1640全培养基，令细胞完全浸没， 2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。S5 :扫描电镜观察第十天取出支架复合物标本放入2. 5%戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞的生长情况。实验结果及分析如下1.原代细胞焦油紫染色结果显示，从形态学分析，细胞有较大胞核，核仁明显，胞体多为圆形或多边形，贴壁培养的细胞相互联接，FCM检测的AECs同样表达⑶29、⑶44、⑶71，各自的表达率分别为95. 44%，18. 32%和15. 11%，而不表达造血细胞的表面标志⑶34和⑶45,HLA-DR亦为阴性；同时其不表达⑶49d。免疫荧光染色结果显示，羊膜上皮细胞同时表达间充质细胞标志波形蛋白和上皮细胞标志CK19。(图2)2.使用倒置显微镜及扫描电镜观察种植在支架上的细胞，1-2天细胞即完全贴壁，培养3-5天时细胞生长增殖活跃，细胞伸出细长突起，沿支架不断向前迁移延伸，渐渐相连成片分布在支架网眼内。一周时支架网眼充满细胞，扫描电镜见细胞伸出尾足与支架紧密贴附，适度伸展，形态多样，从胞体伸出2-5个突起，相邻细胞突起首尾相接或连成细胞链，平行或缠绕于支架上，有些细胞链悬空架在连根蚕丝之间，在某些胞体上和支架上可见基质样分泌物。2周左右三维支架开始崩解，细胞包埋，形成片状、有一定弹性的羊膜细胞-丝素蛋白复合体，此时AECs在支架上的形态同平面培养比较，进行扫描电镜观察可发现细胞形态较平面培养圆润，细胞间可见伪足伸出，表面微绒毛丰富。(图3)本项发明涉及组织工程技术修复CNS损伤领域，组织工程一词最早由1987年美国科学基金会提出，具体来说，组织工程是将组织细胞粘附在一种生物相容性良好、并可在人体内逐步被降解吸收的支架材料上，并提供营养使之扩增，在体外形成细胞-生物材料复合物，然后将这种复合物植入机体内，在支架材料逐步被人体吸收的同时,细胞不断增殖并分泌基质，最终形成具有与原来特殊功能和形态相应的组织器官，从而达到修复创伤和重建功能的目的。丝素蛋白是蚕丝中的主要成分，它以反平行折叠链构象件为基础，形成直径约IOnm的微纤维，无数微纤维组成直径大约I μ m的细纤维再沿纵轴排列成直径10-18 μ m的单纤维即丝素蛋白纤维，研究证明该纤维不会引起T细胞调节的体内应答，可以支持细胞粘附、分化和组织形成，对细胞具有良好的吸附作用，并能维持正常形态和功能，是立体培养的天然支架。细胞只有在立体环境中培养才能保证正常形态及功能，选择合适生物材料作为生长和三维支架是组织工程研究的重点。Dal等将三维网膜丝素蛋白支架植入大鼠皮下6个月后，被上皮、血管等新生组织填充，伴随少量巨噬细胞和极个别多核巨细胞，但无T细胞免疫反应发生，也无纤维化生成。通过免疫组化证实有血管内皮细胞特异表达产物、血管性假血友病因子存在，显示其具有良好的生物相容性以及引导了网状连接组织生成，同时有血管生成，保证了网状连接组织的生存和持久力。本研究构建的羊膜细胞与丝素蛋白复合体，无论在体外实验抑或动物体内实验中均体现了细胞在材料表面具有足够的吸附能力，材料具备的良好生物相容性基本保证了细胞在材料孔径之间的立体化生长，更加符合其生理化生存需求。再加上具备一定的力学强度，支持了细胞的分化增殖。支架材料为CNS提供了更为有利的再生环境。实验同时证实了丝素蛋白支架能以适当的生物降解速率进行降解，在新生组织再生的同时可逐步被吸收和降解直至消失，这一特性也是理想的组织工程支架材料所必需的。
本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其包括如下步骤51:羊膜上皮细胞的分离培养取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15X15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1-2_左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0. 25%胰酶和EDTA各15ml，37°C消化7_8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的 RPMI1640的培养皿中，于37°C含5%C02的培养箱内培养。52:原代细胞的纯化对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，(I)在培养液中加入 Ara-C,作用浓度为10_6mol/L，作用时间为36h。(2)更换新鲜培养基继续培养Id。(3)再次向培养皿中加入Ara-C，作用浓度为10_7mol/L，作用时间为12h。(4)更换新鲜培养基继续培养Id。(5)弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，0. 25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/ min离心5min,弃上清后全培养基继续培养。53:原代细胞的鉴定取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为IX 106/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、 CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE,置 4。C 孵育 30min, PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。54:羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为IX 106/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI1640全培养基，令细胞完全浸没，2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。55:扫描电镜观察第十天取出支架复合物标本放入2. 5%戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞的生长情况。
2.如权利要求1所述的体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其中所述步骤3为明确原代细胞的性质，除了对纯化后的细胞进行流式细胞仪检测，同时取少量细胞进行特异性细胞表面标记物免疫荧光染色测定及应用焦油紫染色观察细胞形态。
3.如权利要求1所述的体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其中所述步骤4所用的丝素蛋白支架系苏州大学材料学院提供，丝素蛋白来源于蚕丝，是一种具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料，具有理想的三维空间构型，为细胞的停泊、生长、繁衍、新陈代谢、新组织的形成提供支持。该支架的降解产物不对细胞繁殖产生不利影响，其降解速度与细胞的增殖速度相匹配，并具有一定的柔韧性，使之既能通机体组织合并贴合，又不会对机体组织造成机械损伤。
全文摘要
本发明提出一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其步骤包括羊膜上皮细胞的分离培养；原代细胞的纯化；原代细胞的鉴定；羊膜细胞接种到丝素蛋白支架上进行空间培养；扫描电镜观察结果。本发明的体外将羊膜细胞同丝素蛋白支架构建复合体的方法，先采用人类剖宫产后废弃的羊膜作为材料，获取羊膜上皮细胞进行体外培养，并在一定条件下进行细胞纯化，将纯化后的细胞同丝素蛋白支架构建组织工程材料，为细胞营造良好的空间生长环境，这项发明为不久的将来临床应用羊膜来源的细胞移植治疗中枢神经系统各种创伤性疾病的功能修复提供了新的思路。
文档编号C12N5/073GK103045535SQ20121050553
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月2日 优先权日2012年12月2日
发明者徐杰, 房文峰, 朱爱华 申请人:吴卫江