一种可自产氧气的蛋白复合支架及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种可自产氧气的蛋白复合支架组成材料包括生物蛋白、明胶和自产氧物，其中，所述明胶和生物蛋白的质量比为（0.5-5）:10，所述自产氧物和生物蛋白的质量比为（1-50）:10。本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架复合了生物蛋白、明胶和自产氧物，物理强度要优于利用单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料，同时明胶成份对自产氧物构成一定的包裹作用，使得本发明提供的蛋白复合支架能够恒速且高水平的释放氧气，从而可令复合其上的种子细胞长期存活并促进材料植入后微血管的长入，更适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
【专利说明】一种可自产氧气的蛋白复合支架及其制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种一种蛋白复合支架，尤其涉及一种可以用于尿道修复重建的可自产氧气的蛋白复合支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002]由于各种原因所导致的复杂性尿道疾病历来是泌尿外科临床治疗中的一个难题。虽然多种自体组织作为替代材料已经在尿道修复重建中获得理想的效果，但相比而言组织工程技术没有前者“牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损”的固有缺陷，因而更可作为未来尿道重建发展的主要方向。现有国内外文献报道中对于各种组织工程材料或者材料-种子细胞复合体在尿道修复重建中的研究已逐渐从实验室向临床拓展。其中不乏有小范围实际尿道疾病临床治疗的案例，并且获得另人满意的初步疗效。
[0003]但是相对于种子细胞研究的日趋完善，在尿道组织工程修复重建中选择何种支架材料最为理想却始终未能达成共识。目前在尿道的组织工程研究中主要采用两大类支架:天然脱细胞胶原基质(SIS、BAMG、脱细胞真皮基质等)和人工合成材料(聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物)。前者虽然制备方便，适合商品化的生产，但由于多取材于异种乃至异体生物组织，因而在生物安全性方面一直受到部分学者质疑，很难被所有患者所接受。同时其在空间结构，生物力学特性以及促进微血管和细胞渗透方面也同时存在着固有缺陷。后者虽然将生物安全性方面的风险降到了最低，但支架在降解过程中的代谢产物对周围的细胞以及微环境会造成不可避免的负面影响，另外人工合成类支架因缺乏相应的生长因子，在促进种子细胞黏附，增殖方面也有着先天的不足。
[0004]基于上述背景，目前在该研究领域，利用蛋白质进行相关生物支架材料的构建正受到越来越多的研究者的关注。现有报道中，利用丝素蛋白、人发角蛋白进行生物蛋白支架构建的报道已经有成功的案例。但制备完成的Keratieine-丝素蛋白复合支架如同其它合成的尿道组织工程修复材料一样会拥有一定的厚度，而支架材料的厚度势必会对微血管的长入、氧气以及营养补给起到限制作用。而这一问题也是导致利用组织工程材料进行尿道重建术后出现狭窄复发的主要原因之一。因而在利用制备的材料进行种子细胞复合和个体回植之前还需要对其进行进一步的修饰加工。以往的研究报道中多将支架材料与血管源性生长因子(VEGF)或者血管生发相关细胞(内皮细胞、内皮祖细胞)相结合，以促进支架材料的血管化，保证其上的种子细胞的增殖，乃至复合材料回植体内后的长期存活。但是该类方法操作相对复杂，成本较高，不适合大面积组织材料的修饰，因而在距离临床应用方面还有很长的距离。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服上述不足，提供一种可自产氧气的蛋白复合支架，随着支架材料的降解逐步且接近恒速的从内部向外释放氧气，从而可令复合其上的种子细胞长期存活并促进材料植入后微血管的长入。
[0006]本发明的第一个方面是提供一种可自产氧气的蛋白复合支架，所述蛋白复合支架的组成材料包括生物蛋白、明胶和自产氧物。
[0007]优选地，所述明胶和和生物蛋白的质量比为(0.5-5): 10，更优选为(0.7-4.5):10,更优选为(0.85-4):10，更优选为(1-3):10，例如 1.5:10、2:10、2.2:10 或 2.5:10。
[0008]优选地，所述自产氧物和生物蛋白的质量比为(1-50): 10，更优选为(2-40):10,更优选为(4-30): 10，更优选为(5-25):10，例如 5.5:10、10:10、12:10、15:10 或 20:10。
[0009]其中，所述自产氧物优选为过氧化钙、过碳酸钠、过碳酸钾、过氧化硫脲等中的一种或几种的混合物，更优选为过氧化钙。
[0010]其中，所述生物蛋白选自角蛋白和丝素蛋白中的一种或两种。
[0011 ] 进一步优选地，所述角蛋白为还原型人发角蛋白。
[0012]本发明的第二个方面是提供一种上述可自产氧气的蛋白复合支架的制备方法，包括以下步骤:
[0013]步骤I，制备生物蛋白溶液，控制生物蛋白溶液中生物蛋白的浓度为0.05-0.2g/mL ；
[0014]步骤2，将明胶加入到生物蛋白溶液中，待明胶完全溶解后，加入自产氧物，溶解完全，其中，所述明胶和生物蛋白的质量比为(0.5-5): 10，所述自产氧物和生物蛋白的质量比为(1-50):10 ；
[0015]步骤3，将步骤2得到的混合溶液密封静置，直至凝胶化，敞口自蒸发，得到蛋白复合支架。
[0016]步骤I中，生物蛋白溶液中生物蛋白的浓度优选为0.06-0.17g/mL,更优选为0.07-0.15g/mL,更优选为 0.08-0.13g/mL,更优选为 0.09-0.llg/mL,例如 0.lg/mL 或0.105g/mL。
[0017]步骤I中，所述生物蛋白优选地选自角蛋白和丝素蛋白中的一种或两种。
[0018]进一步优选地，所述角蛋白为还原型人发角蛋白，制备方法如下:将人头发置于提取液中，50-150°C (优选为70-130°C，更优选为80-120°C，更优选为100-110°C )下浸泡10-60min (优选为15_50min,更优选为25_35min),过滤,将滤液透析,浓缩,得到还原型人发角蛋白，其中，人头发的质量与提取液的体积的比为(0.5-4g): (5-20mL)。
[0019]进一步优选地，人头发的质量与提取液的体积的比为(l_3g): (8_15mL)，更优选为(1.5-2g): (10-12mL)。
[0020]优选地，所述提取液为尿素、十二烷基硫酸钠、Na2S2O5的混合水溶液。
[0021]进一步优选地，所述提取液中，每10mL水中，含有30_70g(优选为35_60g，更优选为45-50g)尿素、40-80g (优选为45-70g，更优选为50_60g)十二烷基硫酸钠、80_120g (优选为 88-110g，更优选为 92-100g) Na2S205。
[0022]所述丝素蛋白的制备方法如下:将脱胶蚕丝溶于MX溶液中，过滤，将滤液透析，浓缩，得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属(例如L1、Na、K等)，X为卤素(例如F、Cl、Br、I
O
[0023]步骤2中，所述明胶和和生物蛋白的质量比优选为(0.7-4.5): 10，更优选为(0.85-4):10，更优选为(1-3):10，例如 1.5:10,2:10,2.2:10 或 2.5:10。
[0024]步骤2中，所述自产氧物和生物蛋白的质量比优选为(1-50):10,更优选为(2-40): 10，更优选为(4-30): 10，更优选为(5-25):10，例如 5.5:10、10:10、12:10、15:10或 20:10。
[0025]步骤2中，所述自产氧物优选为过氧化钙、过碳酸钠、过碳酸钾、过氧化硫脲等中的一种或几种的混合物，更优选为过氧化钙。
[0026]优选地，步骤3中，凝胶化后，敞口自蒸发8_16h(优选为10_14h，更优选为ll_12h)后，倒入无水酒精0.5-2h (优选为0.8-1.5h，更优选为1-1.2h)后取出得到蛋白复合支架。
[0027]本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架复合了生物蛋白、明胶和自产氧物，物理强度要优于利用单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料，同时明胶成份对自产氧物构成一定的包裹作用，使得本发明提供的蛋白复合支架能够恒速且高水平的释放氧气，从而可令复合其上的种子细胞长期存活并促进材料植入后微血管的长入，更适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架的HE染色图；
[0029]图2为本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架的扫描电镜图:可见明胶包被自产氧物；
[0030]图3为本发明提供的可自产氧气的蛋白复合支架的扫描电镜图:可见支架表面呈现多孔样结构。
【具体实施方式】
[0031]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的描述，以更好地理解本发明。
[0032]实施例1
[0033]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0034]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0035]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S205)中，浸没后在100°C油浴加热30min。
[0036]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0037]5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.lg/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0038]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0039]7、取上述得到的还原型人发角蛋白溶液15ml，将其融合搅拌并加热至37°C，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.02g/mL。待明胶完全溶解后，加入过氧化钙，控制混合液中过氧化钙的浓度为0.2g/mL,高速搅拌30s后置入方型模具中。
[0040]8、混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精Ih后取出，得到蛋白复合支架。
[0041]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料。其HE染色提示该材料一肃木素染色阳性膜状物，表面富有多孔样结构(图1所示)。扫描电镜显示材料表面可见明胶包被过氧化钙(图2所示)，并可见支架材料呈现多孔样结构(图3所示)。
[0042]经释氧能力检测，该材料可在体外持续释氧时间超过两周，其中每平方厘米该类材料能够使8ml中性溶液的氧含量在两周内保证在10mmHg以上。
[0043]实施例2
[0044]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0045]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0046]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S205)中，浸没后在100°C油浴加热30min。
[0047]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0048]5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.lg/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0049]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0050]7、将10g溴化锂溶于60ml水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0051]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝1g溶液溴化锂水溶液中，5h后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0052]9、透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天换水一次。
[0053]10、完成透析后将透析带置于20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，浓缩6h，调节至丝素蛋白的浓度为0.lg/mL，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-30kD左右，说明得到丝素蛋白。
[0054]11、将得到的丝素蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0055]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比4:6进行混合。
[0056]13、取步骤12得到的混合液15ml，将其融合搅拌并加热至37°C，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.02g/mL。待明胶完全溶解后，加入过氧化钙，控制混合液中过氧化钙的浓度为0.2g/mL,高速搅拌30s后置入方型模具中。
[0057]14、混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精Ih后取出，得到蛋白复合支架。
[0058]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料。其HE染色提示该材料一肃木素染色阳性膜状物，表面富有多孔样结构。扫描电镜显示材料表面可见明胶包被过氧化钙，并可见支架材料呈现多孔样结构。
[0059]经释氧能力检测，该材料可在体外持续释氧时间超过两周，其中每平方厘米该类材料能够使8ml中性溶液的氧含量在两周内保证在10mmHg以上。
[0060]实施例3
[0061]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0062]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0063]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S205)中，浸没后在100°C油浴加热30min。
[0064]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0065]5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.lg/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0066]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0067]7、将10g溴化锂溶于60ml水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0068]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝1g溶液溴化锂水溶液中，5h后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0069]9、透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天换水一次。
[0070]10、完成透析后将透析带置于20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，浓缩6h，调节至丝素蛋白的浓度为0.lg/mL，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-30kD左右，说明得到丝素蛋白。
[0071]11、将得到的丝素蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0072]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比4:6进行混合。
[0073]13、取步骤12得到的混合液15ml，将其融合搅拌并加热至37°C，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.02g/mL。待明胶完全溶解后，加入过氧化钙，控制混合液中过氧化钙的浓度为0.05g/mL，高速搅拌30s后置入方型模具中。
[0074]14、混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精Ih后取出，得到蛋白复合支架。
[0075]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料。其HE染色提示该材料一肃木素染色阳性膜状物，表面富有多孔样结构。扫描电镜显示材料表面可见明胶包被过氧化钙，并可见支架材料呈现多孔样结构。
[0076]经释氧能力检测，该材料可在体外持续释氧时间维持在一周左右，其中每平方厘米该类材料能够使8ml中性溶液的氧含量在一周内保证在10mmHg以上。
[0077]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1.一种可自产氧气的蛋白复合支架，其特征在于，组成材料包括生物蛋白、明胶和自产氧物，其中，所述明胶和生物蛋白的质量比为(0.5-5): 10，所述自产氧物和生物蛋白的质量比为(1-50):10ο
2.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述明胶和生物蛋白的质量比为(1-3):10ο
3.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述自产氧物和生物蛋白的质量比为(5-25):10ο
4.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述自产氧物为过氧化钙、过碳酸钠、过碳酸钾、过氧化硫脲中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述生物蛋白选自角蛋白和丝素蛋白中的一种或两种。
6.根据权利要求4所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述角蛋白为还原型人发角蛋白。
7.—种如权利要求1所述的用于尿道修复重建的蛋白复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1，制备生物蛋白溶液，控制生物蛋白溶液中生物蛋白的浓度为0.05-0.2g/mL ；步骤2，将明胶加入到生物蛋白溶液中，待明胶完全溶解后，加入自产氧物，溶解完全，其中，所述明胶和生物蛋白的质量比为(0.5-5):10，所述自产氧物和生物蛋白的质量比为(1-50):10 ； 步骤3，将步骤2得到的混合溶液密封静置，直至凝胶化，敞口自蒸发，得到蛋白复合支架。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述生物蛋白选自角蛋白和丝素蛋白中的一种或两种。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述角蛋白为还原型人发角蛋白，制备方法如下: 将人头发置于提取液中，50-150°C下浸泡10-60min，过滤，将滤液透析，浓缩，得到还原型人发角蛋白，其中，人头发的质量与提取液的体积的比为(0.5-4g): (5-20mL)，所述提取液为尿素、十二烷基硫酸钠、Na2S2O5的混合水溶液，其中，每10mL水中，含有30_70g尿素、40-80g 十二烷基硫酸钠、80-120gNa2S205。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白的制备方法如下: 将脱胶蚕丝溶于MX溶液中，过滤，将滤液透析，浓缩，得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属，X为卤素。
【文档编号】A61L27/22GK104288834SQ201310476340
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】冯超, 李喆, 徐月敏, 吕向国 申请人:上海市第六人民医院