一种含有明胶的蛋白复合支架及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种含有明胶的蛋白复合支架，所述蛋白复合支架的组成材料包括丝素蛋白、角蛋白和明胶。所述丝素蛋白和角蛋白的质量比优选为（1-10）:（1-10），所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比优选为（0.1-5）:10。本发明提供的含有明胶的蛋白复合支架复合了角蛋白、丝素蛋白、明胶，物理强度要优于利用单纯丝素蛋白溶液和单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料，更适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
【专利说明】一种含有明胶的蛋白复合支架及其制备方法
【技术领域】
[0001〕 本发明涉及一种一种蛋白复合支架，尤其涉及一种可以用于尿道修复重建的含有明胶的蛋白复合支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002]由于各种原因所导致的复杂性尿道疾病历来是泌尿外科临床治疗中的一个难题。虽然多种自体组织作为替代材料已经在尿道修复重建中获得理想的效果，但相比而言组织工程技术没有前者“牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损”的固有缺陷，因而更可作为未来尿道重建发展的主要方向。现有国内外文献报道中对于各种组织工程材料或者材料-种子细胞复合体在尿道修复重建中的研究已逐渐从实验室向临床拓展。其中不乏有小范围实际尿道疾病临床治疗的案例，并且获得另人满意的初步疗效。
[0003]但是相对于种子细胞研究的日趋完善，在尿道组织工程修复重建中选择何种支架材料最为理想却始终未能达成共识。目前在尿道的组织工程研究中主要采用两大类支架:天然脱细胞胶原基质8八16、脱细胞真皮基质等)和人工合成材料(聚乙醇酸、聚乳酸丨聚乙醇酸共聚物前者虽然制备方便，适合商品化的生产，但由于多取材于异种乃至异体生物组织，因而在生物安全性方面一直受到部分学者质疑，很难被所有患者所接受。同时其在空间结构，生物力学特性以及促进微血管和细胞渗透方面也同时存在着固有缺陷。后者虽然将生物安全性方面的风险降到了最低，但支架在降解过程中的代谢产物对周围的细胞以及微环境会造成不可避免的负面影响，另外人工合成类支架因缺乏相应的生长因子，在促进种子细胞黏附，增殖方面也有着先天的不足。
[0004]基于上述背景，目前在该研究领域，利用蛋白质进行相关生物支架材料的构建正受到越来越多的研究者的关注。现有报道中，利用丝素蛋白、人发角蛋白进行生物蛋白支架构建的报道已经有成功的案例。但现有方法所构建出的单纯蛋白支架材料的力学特性仍无法与上述天然脱细胞胶原基质以及人工合成的支架材料相比拟。如果要将上述蛋白质材料的力学性能进行进一步强化，目前多采用静电纺丝的方法来进行操作。这种操作技术对设备要求较高，同时涉及到蛋白质溶液的高度浓缩，其操作亦较繁琐。
[0005]相比而言国外的相关研究中也已提出将多种蛋白进行混合，可利用不同蛋白质因空间结构的不同而导致力学性质不同的特点来进行最终制备材料的力学强化。虽然现有报道中已有利用人发还原型角蛋白与丝素蛋白结合构建支架材料的报道，但其合适的浓度配比仍没有进行深入探究。同时两种混合蛋白所制得的材料虽然在力学性能上较单一蛋白支架有所改进，但仍与天然脱细胞基质支架存在一定的差距。
[0006]针对上述问题，以往曾采用化学交联剂如吉尼平，或者光交联方法对支架材料进行进一步的力学改性。但化学交联法所涉及的交联剂可能对材料后续的体内植入以及其表面的细胞种植带来一定的负面影响。而光交联法较长的处理时间又可能对蛋白质的稳定性带来一定的影响。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服上述不足，提供一种含有明胶的蛋白复合支架，其物理特性较现有单纯蛋白质支架材料更为优异，从而适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
[0008]本发明的第一个方面是提供一种可以用于尿道修复重建的含有明胶的蛋白复合支架，所述蛋白复合支架的组成材料包括丝素蛋白、角蛋白和明胶。
[0009]优选地，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为(1-10): (1-10),^^^^(1.5-9):(1.5-9),更优选为(2-8): (2-8),更优选为(3-7): (3-7),例如 3:7、4:6、5:5、6:4 或 7:3。
[0010]优选地，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.1-5):10，更优选为(0.5-4): 10，更优选为(0.8-3.5):10，例如 1.5:10,2:10,2.5:10 ^2.8:10。
[0011]其中，所述角蛋白优选为还原型人发角蛋白。
[0012]本发明的第二个方面是提供一种上述含有明胶的蛋白复合支架的制备方法，包括以下步骤:
[0013]步骤1，将角蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制丝素蛋白和角蛋白的质量比为(1-10): (1-10),且蛋白混合液中角蛋白与丝素蛋白的总浓度为0.05-0.2^/1111,；
[0014]步骤2，将明胶加入到蛋白混合液中，待明胶完全溶解后，将混合溶液液密封静置，直至凝胶化，敞口自蒸发，得到蛋白复合支架，其中，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.1-5):10。
[0015]步骤1中，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比优选为(1.5-9): (1.5-9),更优选为(2-8): (2-8),^^^^(3-7): (3-7),^^3:7,4:6,5:5,6:4^7:30
[0016]步骤1中，蛋白混合液中角蛋白与丝素蛋白的总浓度优选为0.06-0.匕更优选为0.07-0.158/?[，更优选为0.08-0.[，更优选为0.09-0.[，例如0.匕/此或
0.105^/1111。
[0017]步骤2中，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比优选为(0.5-4):10，更优选为(0.8-3.5):10,^^^^(1-3):10，例如 1.5:10,2:10,2.5:10 或 2.8:10
[0018]步骤1中，所述角蛋白优选为还原型人发角蛋白，制备方法如下:将人头发置于提取液中，50-1501 (优选为70-1301，更优选为80-1201，更优选为100-1100下浸泡10-60111111 (优选为15-50111111，更优选为25-35111111)，过滤，将滤液透析，浓缩，得到还原型人发角蛋白，其中，人头发的质量与提取液的体积的比为(0.5-?): (5-201111).
[0019]进一步优选地，人头发的质量与提取液的体积的比为(1-30: (8-154),更优选为(1.5-20: (10-121111)0
[0020]优选地，所述提取液为尿素、十二烷基硫酸钠、^！23205的混合水溶液。
[0021]进一步优选地，所述提取液中，每100111[水中，含有30-708(优选为35-608，更优选为45-500尿素、40-808 (优选为45-708，更优选为50-600十二烷基硫酸钠、80-1208 (优选为 88-1108，更优选为 92-1008)^123205。
[0022]步骤1中，所述丝素蛋白的制备方法如下:将脱胶蚕丝溶于IX溶液中，过滤，将滤液透析，浓缩，得到纯化的丝素蛋白，其中，I为碱金属(例如[1、版1、尺等),X为卤素(例如？、01、8『、I等兄
[0023]优选地，步骤2中，凝胶化后，敞口自蒸发8-1611(优选为10-1处，更优选为11-1210后，倒入无水酒精0.5-21！(优选为0.8-1.51！，更优选为1-1.210后取出得到蛋白复合支架。
[0024]本发明提供的含有明胶的蛋白复合支架复合了角蛋白、丝素蛋白、明胶，物理强度要优于利用单纯丝素蛋白溶液和单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料，更适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明提供的含有明胶的蛋白复合支架的册染色图。
【具体实施方式】
[0026]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的描述，以更好地理解本发明。
[0027]实施例1
[0028]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0029]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0030]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸钠30^95.045^--^^)中，浸没后在100【油浴加热30111111。
[0031]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0032]5、完成透析后将透析带置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.18/11^后，行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-601^0左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0033]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0034]7、将1008溴化锂溶于601111水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0035]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝108溶液溴化锂水溶液中，5卜后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0036]9、透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1被％的似23205，每天换水一次。
[0037]10、完成透析后将透析带置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，浓缩6卜，调节至丝素蛋白的浓度为0.4/111匕行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-301^0左右，说明得到丝素蛋白。
[0038]11、将得到的丝素蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0039]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比5:5进行混合。
[0040]13.取步骤12得到的混合液15“，将其融合搅拌并加热至371，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.018/1^。高速搅拌308后置入方型模具中。
[0041]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置121！小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白复合支架。
[0042]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其册染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物(图1所示
[0043]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率45.49%，弹性模量0.11%。
[0044]实施例2
[0045]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0046]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0047]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸钠30^95.045^--^^)中，浸没后在100【油浴加热30111111。
[0048]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0049]5、完成透析后将透析带置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.18/11^后，行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-601^0左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0050]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0051]7、将1008溴化锂溶于601111水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0052]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝108溶液溴化锂水溶液中，5卜后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0053]9、透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1被％的似23205，每天换水一次。
[0054]10、完成透析后将透析带置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，浓缩6卜，调节至丝素蛋白的浓度为0.4/111匕行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-301^0左右，说明得到丝素蛋白。
[0055]11、将得到的丝素蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0056]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比5:5进行混合。
[0057]13.取步骤12得到的混合液15“，将其融合搅拌并加热至371，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.028/1^。高速搅拌308后置入方型模具中。
[0058]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置121！小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白复合支架。
[0059]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其册染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物。
[0060]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率55.29%，弹性模量0.1171%。
[0061]实施例3
[0062]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0063]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0064]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.58/1001比例加入提取液(每100001水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸钠30^95.045^--^^)中，浸没后在100【油浴加热30111111。
[0065]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0066]5、完成透析后将透析带置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.18/11^后，行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-601^0左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0067]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0068]7、将1008溴化锂溶于601111水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0069]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝108溶液溴化锂水溶液中，5卜后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0070]9、透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1被％的似23205，每天换水一次。
[0071]10、完成透析后将透析带置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，浓缩6卜，调节至丝素蛋白的浓度为0.4/111匕行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-301^0左右，说明得到丝素蛋白。
[0072]11、将得到的丝素蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0073]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比5:5进行混合。
[0074]13.取步骤12得到的混合液15“，将其融合搅拌并加热至371，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.038/11^。高速搅拌308后置入方型模具中。
[0075]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12卜小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白复合支架。
[0076]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其册染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物。
[0077]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率11.27%，弹性模量0.051%。
[0078]实施例4
[0079]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0080]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0081]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸钠30^95.045^--^^)中，浸没后在100【油浴加热30111111。
[0082]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0083]5、完成透析后将透析带置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.18/11^后，行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-601^0左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0084]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0085]7、将1008溴化锂溶于601111水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0086]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝108溶液溴化锂水溶液中，5卜后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0087]9、透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1被％的似23205，每天换水一次。
[0088]10、完成透析后将透析带置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，浓缩6卜，调节至丝素蛋白的浓度为0.4/111匕行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-301^0左右，说明得到丝素蛋白。
[0089]11、将得到的丝素蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0090]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比3:7进行混合。
[0091〕 13.取步骤12得到的混合液15“，将其融合搅拌并加热至371，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.028/1^。高速搅拌308后置入方型模具中。
[0092]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置121！小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白复合支架。
[0093]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其册染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物。
[0094]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率42.06%，弹性模量0.091%。
[0095]实施例5
[0096]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0097]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0098]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸钠30^95.045^--^^)中，浸没后在100【油浴加热30111111。
[0099]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1^1:% 的他23205。
[0100]5、完成透析后将透析带置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.18/11^后，行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-601^0左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0101]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0102]7、将1008溴化锂溶于6(^1水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0103]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝108溶液溴化锂水溶液中，5卜后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0104]9、透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1被％的似23205，每天换水一次。
[0105]10、完成透析后将透析带置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，浓缩6卜，调节至丝素蛋白的浓度为0.4/111匕行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-301^0左右，说明得到丝素蛋白。
[0106]11、将得到的丝素蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0107]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比4:6进行混合。
[0108]13.取步骤12得到的混合液15“，将其融合搅拌并加热至371，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.028/1^。高速搅拌308后置入方型模具中。
[0109]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置121！小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12匕倒入酒精111后取出，得到蛋白复合支架。
[0110]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其册染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物。
[0111]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率39.31%，弹性模量0.1461%。
[0112]实施例6
[0113]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0114]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0115]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.58/101111比例加入提取液(每100(^1水中，溶解480.48尿素、57.6768十二烷基硫酸钠30^95.045^--^^)中，浸没后在100【油浴加热30111111。
[0116]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5(1，透析袋周围水溶液中含有
0.1^1:% 的他23205。
[0117]5、完成透析后将透析带置于20被%？2以分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.18/11^后，行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-601^0左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0118]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0119]7、将1008溴化锂溶于6(^1水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0120]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝108溶液溴化锂水溶液中，5卜后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0121]9、透析5(1，透析袋周围水溶液中含有0.1被％的似23205，每天换水一次。
[0122]10、完成透析后将透析带置于20被%？% (分子量20000)水溶液中，浓缩6卜，调节至丝素蛋白的浓度为0.4/111匕行303蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-301^0左右，说明得到丝素蛋白。
[0123]11、将得到的丝素蛋白溶液在41环境下予以保存。
[0124]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比6:4进行混合。
[0125]13.取步骤12得到的混合液15“，将其融合搅拌并加热至371，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.028/1^。高速搅拌308后置入方型模具中。
[0126]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置121！小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精Ih后取出，得到蛋白复合支架。
[0127]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其HE染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物(图1所示)。
[0128]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率52.43%，弹性模量0.202Mpa。
[0129]实施例7
[0130]1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
[0131]2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
[0132]3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S205)中，浸没后在100°C油浴加热30min。
[0133]4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0134]5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.lg/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
[0135]6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0136]7、将10g溴化锂溶于60ml水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60。。。
[0137]8、将自市场上购置的脱胶蚕丝1g溶液溴化锂水溶液中，5h后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
[0138]9、透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天换水一次。
[0139]10、完成透析后将透析带置于20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，浓缩6h，调节至丝素蛋白的浓度为0.lg/mL，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-30kD左右，说明得到丝素蛋白。
[0140]11、将得到的丝素蛋白溶液在4°C环境下予以保存。
[0141]12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比7:3进行混合。
[0142]13.取步骤12得到的混合液15ml，将其融合搅拌并加热至37°C，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.02g/mL。高速搅拌30s后置入方型模具中。
[0143]14.混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精Ih后取出，得到蛋白复合支架。
[0144]最终获取材料大体外观为褐色半透明膜状材料，其HE染色提示该材料一伊红染色阳性膜状物。
[0145]经力学拉伸检测，该材料的最大伸长率39.81%，弹性模量0.148Mpa。
[0146]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1.一种含有明胶的蛋白复合支架，其特征在于，组成材料包括丝素蛋白、角蛋白和明胶。
2.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为(1-10): (1-10)。
3.根据权利要求2所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为(3-7): (3-7)。
4.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.1-5):10ο
5.根据权利要求4所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(1-3): 10ο
6.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述角蛋白为还原型人发角蛋白。
7.—种如权利要求1-6中任意一项所述的含有明胶的蛋白复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:步骤1，将角蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制丝素蛋白和角蛋白的质量比为(1-10): (1-10)，且蛋白混合液中角蛋白与丝素蛋白的总浓度为0.05-0.2g/mL; 步骤2，将明胶加入到蛋白混合液中，待明胶完全溶解后，将混合溶液液密封静置，直至凝胶化，敞口自蒸发，得到蛋白复合支架，其中，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.1-5):10ο
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述角蛋白为还原型人发角蛋白，制备方法如下: 将人头发置于提取液中，50-150°C下浸泡10-60min，过滤，将滤液透析，浓缩，得到还原型人发角蛋白，其中，人头发的质量与提取液的体积的比为(0.5-4g): (5-20mL)。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述提取液为尿素、十二烷基硫酸钠、Na2S205的混合水溶液，其中，每lOOmL水中，含有30_70g尿素、40_80g十二烷基硫酸钠、80-120gNa2S205o
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白的制备方法如下: 将脱胶蚕丝溶于MX溶液中，过滤，将滤液透析，浓缩，得到纯化的丝素蛋白，其中，Μ为碱金属，X为卤素。
【文档编号】A61L27/22GK104307038SQ201310476339
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】冯超, 李喆, 徐月敏, 吕向国 申请人:上海市第六人民医院