专利名称：：鹿茸胶原的分离纯化制备方法
技术领域：
：本发明属于生物制品
技术领域：
，具体涉及一种顺次采用中性、酸性缓冲液，通过乙醇浸提、回流提取等技术相结合制备鹿茸胶原的分离纯化方法。
背景技术：
：20世纪60年代以前，常把蛋白质称之为朊，因此把胶原称之为胶朊，意谓胶性的蛋白质。60年代废了朊，称为蛋白质，也就有了胶原之称。有人把胶原蛋白称作水解胶原或水解明胶。在此把水解胶原称作胶原蛋白，是想与胶原有所区别，不要把胶原与胶原蛋白混为一谈。在《胶原蛋白》(化学工业出版社，2001年)一书中，对胶原、明胶和胶原蛋白作了初步的界定，把原本不太明晰或不太引人注意的概念明确了。最近，李国英等的研究工作(李国英等.胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异。四川大学学报(工程科学版)，2005，37(4):54~58)从三者的性能上进一步确认了他们之间的差异。胶原是指动物组织器官中存在的一类蛋白质，在提取、分离时，随着方法和条件不同，可以产生胶原、明胶和胶原蛋白三种产物。能被称为胶原的，必须是三螺旋结构没有改变的那类蛋白质，还保留有生物活性。明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物，与胶原一样，由18种氨基酸组成，但己失去了生物活性。胶原变成明胶有三种可能性①三股螺旋体完全松开，成为三条互不联结的盘曲的肽链，他们的组成和相对分子质量各不相同；②一条肽链完全松开，而另外两条肽链之间的共价键全部断开，但仍有氢键联结；③三条肽链松开后仍有少量氢键联结在一起。广泛的意义上说，明胶也属于胶原蛋白，只是明胶的分子量比胶原蛋白高一些，而且明胶的肽链之间还有少量氢键。从结构上讲，胶原是具有共价键连接三股a-肽链的蛋白质，明胶是共价键基本被打断、只剩次级键的蛋白质，而胶原蛋白已是基本上不被共价键和次级键束缚、比较自由的a-肽链或是明胶分子的片断。从性能上讲，胶原能形成膜，膜具有较好的柔韧性、弹性和强度。在模拟生理条件下，胶原溶液放置25min,从其相关吸光度的变化可以观察到胶原分子之间能再度相互连接形成纤维，导致吸光度上升；而胶原的变性产物明胶和降解产物胶原蛋白则不具有这样的性质。明胶和胶原蛋白的三螺旋结构都被破坏，这种破坏是不可逆的，因而丧失了再纤维性。明胶溶液能形成凝胶，加热则液化，降到30'C以下又会成凝胶；明胶也能成膜，但明胶膜较脆，强度比胶原膜差；胶原蛋白不能成膜。细胞生长实验证明，胶原蛋白与明胶一样不具有促进细胞生长的性质，不具生物活性。国外对胶原类物质提取的研究始于上个世纪40年代，我国对胶原类物质提取的研究更早。但目前实用的提取方法多涉及用酶水解的方法。因此提取出的物质胶原蛋白与明胶相混，而不是胶原。且多不具备生物活性，或者是将非胶原类物质的生物活性，当作是胶原的生物活性。
发明内容本发明的目的是提供一种高效的鹿茸胶原的制备方法，其是将鹿茸匀浆液先后经中性、酸性缓冲液、乙醇溶液反复浸提后，再经回流提取，及透析、冻干，从而获得相对鲜鹿茸，收率约为10~15%的鹿茸胶原。经过细胞实验证明，该胶原对大鼠成骨细胞具有增殖作用。本发明所述的制备方法包括如下步骤①鹿茸前处理取新鲜鹿茸，剥皮，去肉，分成8"0cm长的小段，1~4°C悬挂静止2436h，将血控净，切成0.5~1cm"j、块，14'C蒸馏水洗至无血色；②去除水溶性蛋白高速组织捣碎机匀浆鹿茸，加匀桨液体积1.52倍的含1~3mMP-巯基乙醇和1~3mMEDTA的15~25mMpH7.5~8.3的Tris-HCl缓冲液(或pH7.5~8.3的NaH2P04-Na2HP04缓冲液)，搅拌，l-4。C浸提24~36h，4000~5000rpm离心30~50min得上清液和沉淀，沉淀再加其体积1~1.5倍的上述缓冲液，搅拌，14。C浸提24~36h，4000~5000rpm离心3050min，得去除水溶性蛋白的除杂沉淀；合并浸提上清液可用于制备水溶性鹿茸蛋白；③胶原的提取取上述步骤获得的除杂沉淀，用10~15mM、pH7.1-7.5Tris-HCl缓冲液洗净，再加沉淀体积1~1.5倍的含1~3mMP-巯基乙醇和1~3mMEDTA的20~30mMpH3.1~3.5HOAc-NaOAc缓冲液，搅拌，14。C浸提48~72h，4000~5000rpm离心30~50min，弃上清；沉淀用10~15mMpH7.1-7.5Tris-HCl缓冲液洗净，加沉淀体积1.5-2倍体积的65%~70%乙醇04。C浸提36~48h，60~65°C回流提取48~72h;④回收乙醇50~55°C、60~65rpm旋转蒸发回收乙醇，提取液置于截流分子量范围8~15kDa的透析袋中，对蒸馏水透析24~36h，-20°。预冻24~48h，-50~-55°(:冻干，即得鹿茸胶原。本发明具有的优点在于鹿茸胶原的提取工艺较已有的胶原提取方法，简便，易行；而且，相对鲜鹿茸，收率高，纯度高，且可用于放大生产的特点。中间过程还可以得到能够用于提取鹿茸水溶性蛋白的总提取物，效率较高。所得样品在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳中，鹿茸胶原的分子量分布集中在两部分，一部分在IOOkDa-200kDa之间，为两条分子量相近的蛋白带；另一部分在200kDa以上；活性实验表明，鹿茸胶原具有促进细胞生长的作用，仍然保持有生物活性。证明我们的提取方法没有破坏胶原的天然构象。图l:实施例1制备的鹿茸胶原的SDSPAGE电泳图2:实施例1制备的鹿茸水溶性蛋白的SDSPAGE电泳图。如图1所示，右侧，鹿茸胶原；左侧，高分子量标准蛋白，从上到下依次是200kDa，105kDa，79kDa，51kDa，31kDa。如图2所示，M为分子量标准蛋白，自上而下分子量依次为97KD，66KD，43KD，31KD，20KD，14KD;DAP为鹿驾水溶性总蛋白。具体实施例方式实施例1:①鹿茸前处理取新鲜鹿茸3.0kg，剥皮，去肉，分成8cm长小段，4i:悬挂静止24h，将血控净，切成lcm"j、块，4'C蒸馏水洗至无血色。②去除水溶性蛋白高速组织捣碎机匀浆，得鹿茸匀浆液1.5L，再加入3.0L含1mM卩-巯基乙醇和1mMEDTA的20mMpH8.0Tris-HCl缓冲液，搅拌，4°C浸提24h，4500rpm离心30min，得沉淀2.5L，再加3L的上述缓冲液，搅拌，4'C浸提24h，4500rpm离心30min，得去除水溶性蛋白的除杂沉淀2.5L。合并两次浸提上清液，用0.45tim水系滤膜抽滤后，将上清用100%硫酸铵沉淀，4'C静置过夜，所得沉淀加9L、20mMpH7.4Tris-HCl缓冲液复性，4'C透析(6000~8000Da)过夜，透析保留液-2(TC预冻24h，-55°(:冻干，得到水溶性鹿茸总蛋白约3g;③胶原的提取取去除水溶性总蛋白的除杂沉淀2.5L，用5L、10mM、pH7.4的Tris-HCl缓冲液洗净后，再加3.5L含1mMp-巯基乙醇和1mMEDTA的20mMpH3.3HOAc-NaOAc缓冲液，搅拌，4。C浸提48h，4500rpm离心30min，弃上清，得沉淀2.5L;用10mMpH7.4Tris-HCl缓冲液洗净，加4.5L70%乙醇4。C浸提48h，60'C回流提取56h;回收乙醇5(TC，60rpm旋转蒸发回收乙醇，提取液置于截流分子量范围8~15kDa的透析袋中，对蒸馏水透析24h，透析保留液于-2(TC预冻24h，再于-55'C冻干，即得鹿茸胶原0.3kg，分子量分布范围在10万以上。表I:本例所得鹿茸胶原的氨基酸组成分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注由吉林大学测试中心，采用安捷伦公司IIOO系列高效液相进行氨基酸含量测定。由表1可见在20种常见氨基酸中，甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量(质量比)最高，其中甘氨酸含量几乎占了1/3，为32.24%，脯氨酸、丙氨酸和羟脯氨酸含量分别为12.64%、10.78%和10.20%;组氨酸和酪氨酸含量较低，没有检测出胱氨酸；与文献(蒋挺大主编，胶原与胶原蛋白[M]，北京化学工业出版社，2006.1)报道的胶原氨基酸特点相符，说明鹿茸醇提物主要为胶原类物质。在胶原的提取、分离过程中，由于方法和条件不同，会产生胶原、明胶和胶原蛋白三种产物，它们在结构和性能上存在较大的差别。能被称为胶原的，必须是其三螺旋结构没有改变的那类蛋白质，相对分子质量大约为30万，分布很窄；明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的水解产物，相对分子质量从几千到io万，分布很宽；胶原蛋白是胶原或明胶剧烈水解产物，为多肽混合物，相对分子质量从几千到几万，分子量分布也很宽。通过SDS-PAGE电泳方法，我们采用醇提方法制备的蛋白质的分子量分布范围在10万以上(见图l)。至今已发现19种不同类型胶原，这些胶原在组织内的分布具有一定特异性，皮肤和骨组织中主要为I型胶原。各型胶原都含有羟脯氨酸和羟赖氨酸，各型胶原的羟脯氨酸和脯氨酸的比值不同，I型胶原为0.70.8。我们提取的鹿茸胶原的这一比值为0.8，由此可以看出，醇提鹿茸胶原应为I型胶原。这一结果与文献报道(蒋挺大主编，胶原与胶原蛋白[M]，北京化学工业出版社，2006.1)—致。I型胶原主要是由3条al(I)链组成，即al(1)3，也有部分I型胶原是由两条al(I)链和一条a2(I)链组成，即al(1)2a2(1)。每条肽链有1000个左右氨基酸残基，相对分子质量100kDa左右，al的分子量略大于a2。因胶原分子氨基酸组成中缺乏半胱氨酸，因此，每条链之间不可能像其它蛋白那样以二硫键相联，而是通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联。因此，胶原在SDS-PAGE电泳中，不会因p—巯基乙醇(打开蛋白质中的二硫键，使蛋白质解聚)的存在而被解聚成单链，检测到分子量应为300kDa左右。但在本实验中可以看到，在100kDa—200kDa之间，存在两条分子量相近的蛋白带，应为I型胶原的al(I)链和a2(I)链。这可能是因为在进行SDS-PAGE电泳时，为使蛋白链尽可能伸展并与SDS充分结合，对样品采用了沸水加热的办法，此步骤可能造成了胶原的部分水解；也可能是在胶原提取过程中，发生了部分水解。一旦胶原发生水解，在SDS-PAGE电泳中便会出现相应的蛋白带。值得注意的是，不管由于哪种原因造成了胶原水解，这种水解都应是比较温和的。这是因为从电泳结果上看，并未出现分子量小于100kDa的蛋白带，表明水解仅造成al(I)链和a2(I)链的释放，而每条单链本身并未被水解，结构都很完整。另外，鹿驾胶原al(I)链和a2(I)链的分子量略大于文献报道，可能是由于组织来源不同而造成的。权利要求1、鹿茸胶原的分离纯化制备方法，其步骤如下①去除水溶性蛋白高速组织捣碎机匀浆鹿茸，加匀浆液体积1.5～2倍的含1～3mMβ-巯基乙醇和1～3mMEDTA的15～25mMpH7.5～8.3的Tris-HCl缓冲液或pH7.5～8.3的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液，搅拌、浸提、离心得上清液和沉淀，沉淀再加其体积1～1.5倍的上述缓冲液，搅拌，浸提、离心得去除水溶性蛋白的除杂沉淀；②胶原的提取取上述步骤获得的除杂沉淀洗净，再加沉淀体积1～1.5倍的含1～3mMβ-巯基乙醇和1～3mMEDTA的20～30mMpH3.1～3.5HOAc-NaOAc缓冲液，搅拌，1～4℃浸提48～72h，4000～5000rpm离心30～50min，弃上清；沉淀洗净后加沉淀体积1.5～2倍体积的65％～70％乙醇0～4℃浸提36～48h，60～65℃回流提取48～72h；③回收乙醇50～55℃、60～65rpm旋转蒸发回收乙醇，提取液经透析、预冻、冻干后即得鹿茸胶原。2、如权利要求1所述的鹿茸胶原的分离纯化制备方法，其特征在于鹿茸处理后使用，其是将新鲜鹿茸剥皮，去肉，分成810cm长的小段，14'C悬挂静止2436h，将血控净，切成0.5~1cm"j、块，14。C蒸馏水洗至无血色。3、如权利要求1所述的鹿茸胶原的分离纯化制备方法，其特征在于步骤①是于14。C浸提24~36h，于4000~5000rpm离心30~50min。4、如权利要求1所述的鹿茸胶原的分离纯化制备方法，其特征在于步骤②除杂沉淀是用10~15mM、pH7.17.5Tris-HCl缓冲液洗净。5、如权利要求1所述的鹿茸胶原的分离纯化制备方法，其特征在于步骤③所得提取液是置于截流分子量范围8~15kDa的透析袋中，对蒸馏水透析24~36h，-20'。预冻24~4811，-50~-551:冻干得鹿茸胶原。全文摘要本发明涉及一种分离提取鹿茸胶原的方法，具体步骤是将鹿茸用Tris-HCl缓冲液匀浆液浸提后，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲液洗净，加HOAc-NaOAc缓冲液，搅拌，浸提，离心，沉淀用Tris-HCl缓冲液洗净，加70％乙醇4℃浸提48h，60℃回流提取48h后，旋转蒸发回收乙醇，提取液置于截流分子量范围8～15kDa的透析袋中，对蒸馏水透析24h，-20℃预冻24h，冻干，即得含量约为70％的鹿茸胶原。本发明的鹿茸胶原的提取工艺较已有的胶原提取方法，简便，易行，活性实验表明，鹿茸胶原具有促进细胞生长的作用，仍然保持有生物活性。证明我们的提取方法没有破坏胶原的天然构象。文档编号C07K14/435GK101182358SQ20071019354公开日2008年5月21日申请日期2007年12月12日优先权日2007年12月12日发明者巍张,歌惠,李红艳,李银清,雨赵申请人:长春中医药大学