专利名称：一种杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡的制作方法
技术领域：
本实用新型属于生物工程领域，具体涉及一种杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡。
背景技术：
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，在芽孢形成时产生的具有高度特异性杀虫活性的晶体蛋白，称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal protein, ICPs)。ICP常以原毒素形式存在，当昆虫取食ICP后,在昆虫消化道内，在中肠消化酶的作用下，原毒素被活化即降解成具有毒性的多肽，活化的毒素分子与昆虫中肠上皮细胞上的特异受体结合，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，使昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡。目前，Bt杀虫蛋白基因已成为植物基因工程及转基因育种应用中最广泛、最具有潜力和应用前景的抗虫基因。其 中，Cry杀虫蛋白对鳞翅目等多种害虫具有毒杀作用，因此被广泛用于转基因植物。例如，Cry2A蛋白能用于杀虫实验及转基因植物的抗虫防护。转基因作物的飞速发展在带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题，越来越多的国家要求对转基因产品进行检测以实行标识制度。免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金标记技术是免疫层析快速诊断的核心技术，它以胶体金作为示踪标记物应用于抗原抗体反应，其实质是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。目前，将现有的免疫胶体金技术应用到检测转基因产品的外源蛋白中，仍然存在许多问题，例如，特异性差，灵敏度不高，成本高，因此，本领域技术人员亟需对现有免疫胶体金技术进行改进，研制特异性强，灵敏度高、稳定性好、重复性好的检测转基因产品中外源蛋白的新方法。
发明内容本实用新型的目的是设计一种杀虫晶体蛋白BT_Cry2A胶体金免疫层析速测卡，该速测卡特异性强，灵敏度高，并且，操作简便、快速、准确，适用于转基因产品中BT-Cry2A蛋白的现场快速检测以及安全性评价。为达到上述目的，本实用新型的技术方案如下一种杀虫晶体蛋白BT_Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其包括卡壳和卡壳内的试纸条，其中，所述试纸条包括底板、粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫。进一步，所述卡壳上设有加样孔和观察窗。所述加样孔设于对应所述样品垫上方壳体，所述观察窗设于对应所述反应膜上方壳体。所述样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫之间设有l_2mm的重叠区。又,所述金标垫包被杀虫蛋白BT-Cry2A多克隆抗体_胶体金结合物。所述反应膜上设有包被杀虫蛋白BT-Cry2A多克隆抗体的检测线和包被羊抗兔IgG的质控线；所述检测线和所述质控线间隔0. 5-1. Ocm0所述底板为PVC(聚氯乙烯)板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫由滤纸制成。·本实用新型胶体金免疫层析速测卡的使用(I)待测样品前处理若待测样品为水和植物组织提取液等液体物质时，可直接取50iU样品检测。若待检样品为植物叶片、茎干、种子等样品时，则需要将样品进行预处理，即将样品磨碎，加入样品处理液(5mM PBS pH 7.4)摇匀，静置后取上清50 检测。(2)检测将所取样品滴入加样孔内，室温下作用5-10min，然后观察结果。(3)检测结果分析阳性质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有Cry2A蛋白存在。阴性检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有Cry2A蛋白存在。失效如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明试纸条失效。本实用新型的有益效果I.本实用新型特异性强，灵敏度高。2.操作方法简便快速，检测时间短。本实用新型不需要使用其他特殊仪器、设备，只要将待测样品滴入加样孔内，加样后10分钟内即可从观察窗观察到结果，检测方法简便，适合现场快速检测。3.本实用新型使用抗Cry2A的多克隆抗体，成本低，并且稳定性和重复性好，可以用于检测不同样品，应用范围广。
图I为本实用新型一实施例试纸条的结构示意图；图2为本实用新型一实施例试纸条的侧面结构示意图；图3为本实用新型一实施例卡壳的结构示意图；图4为本实用新型一实施例的检测结果呈阳性示意图；图5为本实用新型一实施例的检测结果呈阴性示意图；图6为本实用新型一实施例的检测结果失效示意图之一；图7为本实用新型一实施例的检测结果失效示意图之二。
具体实施方式
[0032]以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。参见图I-图7，本实用新型的一种杀虫晶体蛋白BT_Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其包括卡壳I和卡壳内的试纸条2，其中，所述试纸条2包括底板3、粘着在底板3上依次相连的样品垫4、金标垫5、反应膜6和吸水垫7。进一步，所述卡壳I上设有加样孔8和观察窗9，所述加样孔8设于对应所述样品垫4上方壳体,所述观察窗9设于对应所述反应膜6上方壳体。所述依次相连的样品垫4、金标垫5、反应膜6和吸水垫7之间设有l_2mm的重叠区。又,所述金标垫5包被杀虫蛋白BT_Cry2A多克隆抗体_胶体金结合物。所述反应膜6上设有包被杀虫蛋白BT_Cry2A多克隆抗体的检测线61和包被羊抗兔IgG的质控线62,所述检测线61和所述质控线62间隔0. 5cm。所述底板3为PVC板，所述反应膜6为硝酸纤维素膜。所述样品垫4由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫7由滤纸制成。本实施例胶体金免疫层析速测卡的使用(I)待测样品前处理若待测样品为水和植物组织提取液等液体物质时，可直接取50iU样品检测。若待检样品为植物叶片、茎干、种子等样品时，则需要将样品进行预处理，即将样品磨碎，加入样品处理液(5mM PBS pH 7. 4)摇匀，静置后取上清50 检测。(2)检测将所取样品滴入加样孔8内，室温下作用5-10min，然后从观察窗9观察结果。(3)检测结果分析阳性检测线61、质控线62均呈现红色条带，说明样本中有Cry2A蛋白存在，如图4所示。阴性检测线61不出现红色条带，质控线62呈现红色条带，说明样本中没有Cry2A蛋白存在，如图5所示。失效如果仅有检测线61出现红色条带或检测线61、质控线62均不出现红色条带，说明试纸条失效，如图6、图7所示。
权利要求1.一种杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，包括卡壳和卡壳内的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板、粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫。
2.根据权利要求I所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述卡壳上设有加样孔和观察窗；所述加样孔设于对应所述样品垫上方壳体，所述观察窗设于对应所述反应膜上方壳体。
3.根据权利要求I所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫之间设有l_2mm的重叠区。
4.根据权利要求I所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述金标垫包被杀虫蛋白BT-Cry2A多克隆抗体-胶体金结合物。
5.根据权利要求I所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述反应膜上设有包被杀虫蛋白BT-Cry2A多克隆抗体的检测线和包被羊抗兔IgG的质控线。
6.根据权利要求5所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述检测线和所述质控线间隔O. 5-1. Ocm0
7.根据权利要求I所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述底板为PVC板，所述反应膜为硝酸纤维素膜。
8.根据权利要求I所述的杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，其特征在于，所述样品垫由玻璃纤维膜或滤纸制成，所述吸水垫由滤纸制成。
专利摘要一种杀虫晶体蛋白BT-Cry2A胶体金免疫层析速测卡，包括卡壳和卡壳内的试纸条，所述试纸条包括底板、粘着在底板上依次相连的样品垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述卡壳上开有加样孔和观察窗；所述加样孔设于对应所述样品垫上方壳体，所述观察窗设于对应所述反应膜上方壳体，本实用新型的胶体金免疫层析速测卡特异性强，灵敏度高，并且操作简便、快速、准确，适用于转基因产品中BT-Cry2A蛋白的现场快速检测以及安全性评价。
文档编号G01N33/68GK202583213SQ201220149540
公开日2012年12月5日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者唐雪明, 赵凯, 杨奇, 吴潇, 王金斌, 何建华, 蒋玮, 陈建中, 陈大超 申请人:上海市农业科学院