在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法

专利名称：在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法
背景技术：
发明领域本发明涉及在缺乏酶的黑曲霉(Aspergillus niger)突变菌株中生产异源生物物质的方法、获得缺乏酶的黑曲霉突变菌株的方法、以及缺乏酶的黑曲霉突变菌株。
相关技术的说明黑曲霉分泌大量的葡糖淀粉酶。然而，具有蛋白表达和分泌增加的所需要性状的黑曲霉宿主未必具有用于成功发酵的最合乎需要的特性。由于需要在回收和纯化令人感兴趣的生物物质期间移出分泌的多重酶或可能伴随生物物质共同纯化该酶，因此发酵未必是最佳的。
Boel等人，1984，EMBO J.31097-1102，1581-1585，公开了对黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的克隆。Fowler等人，1990，Curr.Genet.18537-545公开了黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)基因的缺失。
Korman等人，1990，Curr.Genet.17203-217公开了来自黑曲霉泡盛曲霉(awamori)变体的2个α-淀粉酶基因(amyA和amyB)的克隆、表征鉴定和表达。美国专利号5,252,726公开了来自黑曲霉的2个全长中性α-淀粉酶基因的克隆。
美国专利号5,252,726公开了来自黑曲霉的部分酸稳定的α-淀粉酶基因(asa)的克隆。
Pedersen等人，2000，Metabolic Engineering 234-41，和WO 00/50576公开了在生产葡糖淀粉酶的黑曲霉菌株中编码草酰乙酸水解酶(EC 3.7.1.1)的草酰乙酸水解酶(oah)基因的断裂，其中所得到的菌株不能生产草酸。
WO 01/68864公开了prtT-断裂的黑曲霉菌株缺乏蛋白酶，表明宿主菌株中prtT表达的缺失可能导致对蛋白水解敏感的可回收蛋白的水平增加。
本发明的目的是提供改善的黑曲霉宿主，其兼备表达商品化的大量生物物质的能力而缺乏生产可能使令人感兴趣的生物物质的回收和下游加工过程复杂化的酶。
发明概述本发明涉及生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变株，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，以及(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。
本发明也涉及缺乏酶的黑曲霉突变菌株和生产缺乏酶的黑曲霉突变菌株的方法。
附图简述

图1显示pJRoy10的限制图谱。
图2显示pMBin01+的限制图谱。
图3显示pJRoy17的限制图谱。
图4.显示pSMO127的限制图谱。
图5.显示pMBin05的限制图谱。
图6.显示pMBin04+的限制图谱。
图7显示pMBin09的限制图谱。
图8显示pMBin10的限制图谱。
图9显示pMBin02的限制图谱。
图10显示pMBin03的限制图谱。
图11显示pMBin08的限制图谱。
图12显示prtT缺失对蛋白酶活性的影响。
图13显示prtT缺失对南极洲假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B活性的影响。
图14显示黑曲霉普通宿主菌株MBin114、MBin118和MBin120中Scytalidium thermophilum过氧化氢酶生产的比较。
发明详述本发明涉及生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变株，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因变体(modification)的一种或多种第二核苷酸序列，和(ii)当在相同条件下培养时，与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。
本发明的优点是消除或减少异源生物物质的黑曲霉发酵液体培养基简单化下游过程中的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。
术语″淀粉葡萄糖苷酶″在此定义为糊精6-α-D-葡聚糖水解酶活性，其催化1，4-连接的α-D-葡萄糖残基和末端1，4-连接的α-D-葡萄糖残基链中分支点的1，6-α-D-糖苷连接的内水解。为了本发明的目的，根据Fagershom和Kalkkinen，1995，Biotechnol.Appl.Biochem.21223-231描述的方法确定葡糖淀粉酶活性，其中利用葡萄糖氧化酶测定试剂盒(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在pH4，25℃测量由葡糖淀粉酶从0.1M麦芽三糖产生的葡萄糖。1个单位的葡糖淀粉酶活性定义为在25℃，pH4每分钟产生1.0μmol的葡萄糖。
术语“α-淀粉酶活性”在此定义为1，4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶活性，其催化具有3个以上α-1，4-连接的葡萄糖单元的多糖在存在水时内水解为麦芽低聚糖。
术语″酸稳定的α-淀粉酶活性″在此定义为在酸性pH范围中具有最佳活性的α-淀粉酶活性。为了本发明，利用4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-maltoheptaside作为底物，利用Sigma Chemical Co.试剂盒577在pH4.0测定酸稳定的α-淀粉酶活性。
术语″中性α-淀粉酶活性″在此定义为在中性pH范围中具有最佳活性的α-淀粉酶活性。为了本发明，利用4，6-亚乙基(G7)-p-硝基苯基(G1)-α-D-maltoheptaside作为底物，利用Sigma Chemical Co.试剂盒577，在pH7.0测定中性α-淀粉酶活性。
术语″草酸水解酶″在此定义为在存在水时催化草酰乙酸转化为草酸和乙酸酯的酶活性。分类该酶为属于EC 3.7.1.1。为了本发明，根据在本文实施例小节中描述的方法测定草酰乙酸水解酶活性。1个单位的草酰乙酸水解酶活性定义为在30℃，pH7.5每分钟产生1.0μmol的草酸。
术语“变体”在此定义为在基因或为其转录或翻译所需要的调控元件中导入、取代、或除去一个或多个核苷酸，以及基因断裂、基因转换、基因缺失、或glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的随机或特异的诱变。glaA基因和asa、amyA、amyB、prtT、和/或oah基因的缺失可以是部分或全部的。变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的表达的降低或消除。
在优选的方面，变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的失活。在另一个优选的方面，变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、和oah的基因的表达降低。在另一个优选的方面，变体导致glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT、或oah的基因的表达降低、消除、或其组合。
在优选的方面，突变包括glaA和asa的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA和amyA的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA和amyB的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA和oah的改变。
在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、和amyA的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、和amyB的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、和amyB的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyB、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyB、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、prtT、和oah的改变。
在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、和amyB的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyB、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、prtT、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、amyB、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyB、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、prtT、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、amyB、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyB、prtT、和oah的改变。
在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、amyB、和prtT的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyB、prtT、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、amyA、amyB、prtT、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、amyB、和oah的改变。在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、prtT、和oah的改变。
在另一个优选的方面，突变包括glaA、asa、amyA、amyB、prtT、和oah的改变。
术语“缺乏”(deficient)在此定义为当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，黑曲霉突变菌株没有产生可检测的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶，或备选的，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，优选产生减少25％，更优选减少至少50％，更优选减少至少75％，以及最优选减少至少95％的葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶。可利用在此所描述的或本领域已知的方法测定由本发明黑曲霉突变菌株产生的酶的水平。
在本发明的方法中，亲本黑曲霉菌株可以是野生型黑曲霉菌株或其突变株。可以理解术语“黑曲霉”也包括黑曲霉的品种(参见，例如，Robert A.Samsom和John I.Pitt，编辑，Integration of Modern Taxonomic Methods forPenicillium and Aspergillus Classification，Harwood Academic Publishers，荷兰)。在优选的方面，亲本黑曲霉菌株是黑曲霉DSM 12665。
可利用本领域公知的方法，例如插入、断裂、替代或缺失，通过减少或消除glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因的表达构建缺乏酶的黑曲霉突变菌株。待改变或失活的基因部分可以是例如编码区或为表达编码区所需要的调控元件。这种基因调节或调控序列的实例可以是启动子序列或其功能部分，即足够影响基因表达的部分。可能用于改变的其它调控序列包括但不限于，前导序列、前肽序列、信号序列、转录终止子、和转录活化子。
可通过基因缺失技术构建黑曲霉突变菌株来消除或减少glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因的表达。基因缺失技术能够部分或完全除去基因，由此消除其表达。在这种方法中，基因的缺失可利用已经构建的、连续包含基因侧翼的5′和3′区的质粒而伴随有同源重组。
也可通过在基因或为其转录或翻译所需要的调控元件中导入、取代、和/或除去一个或多个核苷酸来构建黑曲霉突变菌株。例如，可插入或除去核苷酸以使得导入终止密码子，除掉起始密码子，或产生开放阅读框的读框移位。根据本领域已知的方法这种改变可伴随有定点诱变或PCR产生的诱变。参见例如，Botstein和Shortle，1985，Science 2294719；Lo等人，1985，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 812285；Higuchi等人，1988，Nucleic Acids Research 167351；Shimada，1996，Meth.Mol.Biol.57157；Ho等人，1989，Gene 7761；Horton等人，1989，Gene 7761；以及Sarkar和Sommer，1990，Bio Techniques 8404。
也可通过基因断裂技术，通过将包含与基因同源的核酸片段的整合型质粒插入令人感兴趣的基因来构建黑曲霉突变菌株，其可能产生同源性区域的重复并且在复制区域之间结合载体DNA。如果插入的载体分隔了基因的启动子和编码区或打断编码序列以产生无功能的基因产物，这种基因断裂可消除基因表达。断裂构建体可以只是伴有与基因5’和3’区域同源的可选择的标记基因。可选择的标记物能够鉴定包含断裂基因的转化体。
也可通过基因转换的方法(参见例如，Iglesias和Trautner，1983，Molecular General Genetics 18973-76)构建黑曲霉突变菌株。例如，在基因转换方法中，体外诱变处理相应于基因的核苷酸序列以产生有缺陷的核苷酸序列，然后将其转化入亲本黑曲霉菌株以产生有缺陷的基因。通过同源重组，有缺陷的核苷酸序列替代内源的基因。所需要的是有缺陷的基因或基因片段也包括可用于选择包含有缺陷基因的转化体的标记物。
也可通过已建立的反义技术，利用与基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列(Parish和Stoker，1997，FEMS Microbiology Letters 154151-157)来构建黑曲霉突变菌株。更具体地说，可通过导入与该基因核苷酸序列互补的核苷酸序列来减少或消除经黑曲霉菌株的基因表达，其可在菌株中转录并能够与菌株中产生的mRNA杂交。在容许互补的反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，因此减少或消除了翻译蛋白的数量。
可通过随机或特异的诱变，利用本领域公知的方法来进一步构建黑曲霉突变菌株，包括但不限于化学物诱变作用(参见例如，Hopwood，TheIsolation of Mutants in Methods in Microbiology(J.R.Norris and D.W.Ribbons，eds.)第363-433页，Academic Press，纽约，1970)和转位(参见例如，Youngman等人，1983，Proc.Natl.Acad Sci.USA 802305-2309)。可通过使亲本菌株经受诱变并且筛选其中基因表达已经减少或消除的突变菌株来进行基因的改变。可进行特异或随机的诱变，例如使用合适的物理或化学诱变处理试剂，使用合适的寡核苷酸，或使DNA序列经受PCR产生的诱变。此外，可使用这些诱变处理方法的任何组合进行诱变。
适于本目的的物理或化学诱变处理试剂的实例包括紫外(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)O-甲羟胺、亚硝酸、乙基甲烷磺酸盐(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、和核苷酸类似物。当使用这种试剂时，一般通过在存在所选择的诱变处理试剂时在适宜条件下培养待诱变处理的亲本进行诱变，以及选择显示出基因表达减少或没有表达的突变株。
在优选的方面，glaA包括与SEQ ID NO1具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％，以及最优选至少95％同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，glaA包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。在另一个最优选的方面，glaA由SEQ ID NO1的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，glaA包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO1杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，asa包括与SEQ ID NO3具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％，以及最优选至少95％同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，asa包括SEQ ID NO3的核苷酸序列。在另一个最优选的方面，asa由SEQ ID NO3的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，asa包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO3杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，amyA包括与SEQ ID NO5具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％，以及最优选至少95％同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，amyA包括SEQ ID NO5的核苷酸序列。在另一个最优选的方面，amyA由SEQ ID NO5的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，amyA包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO5杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，amyB包括与SEQ ID NO7具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％，以及最优选至少95％同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，amyB包括SEQ ID NO7的核苷酸序列。在另一个最优选的方面，amyB由SEQ ID NO7的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，amyB包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO7杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，oah包括与SEQ ID NO9具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％，以及最优选至少95％同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，oah包括SEQ ID NO9的核苷酸序列。在另一个最优选的方面，oah由SEQ ID NO9的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，oah包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO9杂交的核苷酸序列。
在优选的方面，prtT包括与SEQ ID NO11具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，最优选至少90％，以及最优选至少95％同一性的核苷酸序列。在最优选的方面，prtT包括SEQ ID NO11的核苷酸序列。在另一个最优选的方面，prtT由SEQ ID NO11的核苷酸序列组成。
在另一个优选的方面，prtT包括在极低严谨条件，优选低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中等-高严谨条件，更优选高严谨条件，以及最优选极高严谨条件下与SEQ ID NO11杂交的核苷酸序列。
为了本发明，通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和Lipman，1983，Proceedings of the National Academy of Science USA 80726-730)，利用具有同一性表的LASERGENETMMEGALIGNTM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，和下列多个序列对比参数缺口罚分10和缺口长度罚分10来确定2个核苷酸序列之间的同一性程度。成对序列对比参数是Ktuple＝3，缺口罚分＝3，和windows＝20。
在此公开的核苷酸序列或其亚序列，以及其氨基酸序列或其片段可用来设计核酸探针以从不同属或种的菌株，根据本领域公知的方法鉴定和克隆编码涉及透明质酸生物合成的酶的DNA。特别地，这种探针可用于与基因组或令人感兴趣的属或种的cDNA，按照标准的Southern印迹方法杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。这种探针可以是比全部序列相当短的，但应该是至少15，优选至少25，以及更优选是至少35个核苷酸长度。也可使用更长的探针。可使用DNA和RNA探针。一般标记探针用于检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。
因此，可筛选从这种其它的生物体制备的基因组DNA或cDNA文库的与如上所述的探针杂交，并且编码透明质酸生物合成途径中的酶的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其它分离技术分离来自这种其它生物体的基因组或其它的DNA。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移并固定到硝化纤维素或其它合适的载体材料上。为了鉴定与在此公开的核苷酸序列或其亚序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用载体材料。为了本发明的目的，杂交表明核酸序列与相应于在此公开的核苷酸序列、其互补链、或其亚序列的标记核酸探针在极低至极高的严谨条件下杂交。可利用X光胶片检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针，定义极低至极高的严谨条件为在42℃，在5×SSPE，3％ SDS，200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA，以及对于极低和低严谨为25％甲酰胺、对于中等和中等-高严谨为35％甲酰胺、或对于高和极高严谨为50％甲酰胺中，按照标准的Southern印迹方法进行预杂交和杂交。
对于至少100个核苷酸长度的长探针，最后利用2×SSC，0.2％ SDS洗涤载体材料3次，每次15分钟，优选在45℃(极低严谨)、更优选至少在50℃(低严谨)、更优选至少在55℃(中等严谨)、更优选至少在60℃(中等-高严谨)、更优选至少在65℃(高严谨)、以及最优选70℃(极高严谨)进行洗涤。
对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的短探针，严谨状态定义为在低于利用根据Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 481390)的算法计算的Tm大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％ NP-40，1×Denhardt′s溶液，1mM焦磷酸钠，1mM一元磷酸钠，0.1mM ATP，和每ml 0.2mg的酵母RNA中，按照标准的Southern印迹方法进行预杂交、杂交、和杂交后洗涤。
对于大约15个核苷酸至大约70个核苷酸长度的短探针，在6×SSC加0.1％ SDS中洗涤载体材料15分钟一次，利用6×SSC在低于计算的Tm5℃至10℃洗涤两次，每次15分钟。
可从产生酶以改变所选择的黑曲霉菌株中相应基因的其它微生物来源使用与在此所描述的、涉及生产令人感兴趣的酶的核苷酸序列同源或互补的核苷酸序列。
在优选的方面，未用可选择的标记物标记涉及在黑曲霉突变菌株中酶生产的基因变体。
除去可选择的标记基因可伴随有在反选择(counter-selection)的培养基上培养突变株。其中可选择的标记基因包含侧接其5′和3′末端的重复，该重复可当突变菌株经受反选择时便于通过同源重组使可选择的标记基因环化突出(looping out of)。也可通过将包括有缺陷基因的5′和3′区，但缺乏可选择标记基因的核酸片段导入突变菌株，然后在反选择培养基上选择经同源重组，而除去可选择的标记基因。通过同源重组，用缺乏可选择标记基因的核酸片段替换包含可选择标记基因的有缺陷基因。也可使用本领域已知的其它方法。
可以理解本发明的方法不限于为获得黑曲霉突变菌株的特定顺序。可将涉及酶生产的基因变体在构建用于生产生物物质的菌株的任何步骤导入亲本。优选在导入编码异源生物物质的基因前已经使得黑曲霉突变菌株成为缺乏酶的。
在本发明进一步的方面，黑曲霉菌株的突变株可包含附加的改变，例如可编码对生产，回收或应用特定生物物质有害的物质的其它基因的缺失或断裂。
在优选的方面，黑曲霉菌株进一步包括变体，例如编码蛋白质分解活性的一个或多个基因的断裂或缺失。在更优选的方面，蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、和液泡蛋白酶。
在另一个优选的方面，黑曲霉菌株进一步包括变体，例如一个或多个基因的断裂或缺失，其中该基因编码选自下列的酶糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶，酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、α-1，6-转葡糖苷酶、α-1，6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、和木聚糖酶。
在本发明的方法中，当在相同的生产条件下培养时黑曲霉突变菌株优选生产与相应的亲本黑曲霉菌株至少相同数量的生物物质。在更优选的方面，当在相同的生产条件下培养时该突变菌株比相应的亲本黑曲霉菌株生产至少多出25％，优选至少多出50％，更优选至少多出75％，以及最优选地至少多出100％的生物物质。
在适于利用该领域已知的方法生产异源生物物质的营养培养基中培养黑曲霉突变菌株。例如，可通过摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中、在合适的培养基和在容许生物物质表达和/或分离的条件下进行小规模的或大规模的发酵(包括连续、分批、分批饲养、或固态发酵)而培养菌株。在包括碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中利用本领域已知的方法进行培养。可从商业供应商获得合适的培养基或可根据公开的组合物(例如，美国典型培养物保藏中心的目录)制备合适的培养基。可从培养基直接回收分泌的生物物质。如果生物物质不是分泌的，可从细胞裂解物获得该生物物质。
可利用本领域已知的特异于该生物物质的方法检测生物物质。这些检测方法可包括使用特异的抗体、高效液相色谱法、毛细管色谱法、酶产物的形成、酶底物的消失、或SDS-PAGE。例如酶活性测定可用来测定该酶的活性。用于测定酶活性的方法是本领域已知用于许多酶的方法(参见例如，D.Schomburg和M.Salzmann(编辑)，Enzyme Handbook，Springer-Verlag，纽约，1990)。
可通过本领域已知的方法分离所得到的生物物质。例如，可通过传统方法从培养基分离令人感兴趣的多肽，包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可通过本领域已知的多种方法进一步纯化本发明的分离多肽，包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲合的、疏水性的、色谱聚焦、和大小排阻)、电泳方法(例如预备性的等电聚焦(IEF)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、或提取(参见例如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCH Publishers，纽约，1989)。可通过例如提取、沉淀、或差异溶解度、或本领域已知的任何方法从培养基分离令人感兴趣的代谢产物。然后可利用适于代谢产物的方法进一步纯化分离的代谢产物。
异源的生物物质可以是任何生物聚合物或代谢产物。可通过单个基因或组成生物合成或代谢途径的一系列基因编码该生物物质。因此，术语“编码异源生物物质的第一核苷酸序列”可理解为包括涉及该生物物质生产的一个或多个基因。术语″异源生物物质″在此定义为对宿主菌株不是天然的生物物质；其中已经产生结构改变以改变该天然生物物质的天然生物物质，例如天然多肽的蛋白质序列；或由于通过例如强启动子的重组DNA技术，核苷酸序列或宿主菌株的操作其表达定量改变的天然生物物质。
在本发明的方法中，生物聚合物可以是任何生物聚合物。术语“生物聚合物”在此定义为相同、相似或不同亚基(单体)的链(或聚合物)。该生物聚合物可以是，但不限于核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)、或多糖。
在优选的方面，生物聚合物是多肽。多肽可以是具有令人感兴趣的生物活性的任何多肽。术语“多肽”在此不是意味着是指特定长度的编码产物，因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”也包括两个或多个多肽组合形成编码的产物。多肽也包括杂合多肽，其包括从至少2个不同多肽获得的部分或全部多肽序列的组合，其中一个或多个多肽可能与黑曲霉菌株是异源的。多肽进一步包括上述多肽和杂合多肽的天然存在的等位的和工程化的变体。
优选地，异源的多肽是抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、和转录因子。
在优选的方面，异源的多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。在更优选的方面，多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、α-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶，α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
在另一个优选的方面，生物聚合物是胶原或白明胶(gelatin)。
在优选的方面，生物聚合物是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不限于粘多糖或包含氮的多糖。在更优选的方面，多糖是透明质酸。“透明质酸”在此定义为非硫酸化的氨基多糖，其由通过交替的β-1，4和β-1，3糖苷键连接在一起的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单位组成。透明质酸(hyaluronic acid)亦称透明质酸(hyaluronan)，透明质酸(hyaluronate)，或HA。在另一个更优选的方面，多糖是壳多糖。在另一个更优选的方面，多糖是肝素。
在本发明的方法中，代谢产物可以是任何代谢产物。代谢产物可经一个或多个基因编码。术语“代谢产物”包括初级和次级代谢产物。初级代谢产物是菌株的原始或总代谢产物，其是关于例如能量代谢、生长和结构。次级代谢产物是次级代谢的产物(参见例如，R.B.Herbert，The Biosynthesis ofSecondary Metabolites，Chapman and Hall，纽约，1981)。
初级代谢产物可以是但不限于，氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酸酯、或维生素。
次级代谢产物可以是但不限于，生物碱、香豆素、类黄酮(flavonoid)、聚酮化合物(polyketide)、奎宁、类固醇、肽、或萜烯。在优选的方面，次级代谢产物是抗生素、拒食剂(antifeedant)、诱引剂(attractant)、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂、或灭鼠剂(rodenticide)。
在本发明的方法中，黑曲霉菌株的突变株是重组菌株，包括编码异源生物物质，例如多肽的核苷酸序列，其可有利地用于重组生产该生物物质。优选用包括编码异源生物物质的核苷酸序列的载体转化菌株，然后将载体整合到染色体中。“转化”是指将包括核苷酸序列的载体导入宿主菌株以使得该载体保持为染色体的整合部分或作为染色体外自我复制的载体。一般认为整合是有利的，因为核苷酸序列更可能稳定地维持在该菌株中。可通过同源重组，非同源重组、或转位使载体整合到染色体中。
可从任何原核的、真核的、或其它来源，例如原生细菌获得编码异源生物物质的核苷酸序列。为了本发明的目的，术语如在此使用的与给定来源相关的″获得自″(obtained from)是指通过该来源或通过其中已经插入来自该来源基因的菌株而生产生物物质。
在本发明的方法中，黑曲霉菌株的突变株也可用于黑曲霉菌株中天然生物物质的重组生产。可通过重组方式生产天然的生物物质，例如将编码生物物质的基因置于不同启动子的控制下以增强该物质的表达，使用例如信号序列促进其运输到菌株外部，或增加编码由黑曲霉菌株正常生产的生物物质基因的拷贝数。因此，本发明在术语“异源生物物质”的范围内也包括这种天然生物物质的重组生产，其达到的程度是这种表达包括使用黑曲霉菌株的非天然遗传元件，或使用已经操作的天然元件以不是通常存在于宿主菌株的方式发挥功能。
用于分离或克隆编码生物物质的核苷酸序列的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备、或其组合。例如可利用公知的聚合酶链式反应(PCR)影响从这种基因组DNA克隆核苷酸序列。参见例如，Innis等人，1990，PCR Protocols A Guide to Methods and Application，Academic Press，纽约。克隆方法可包括切下和分离包括编码生物物质的核苷酸序列的所需要核酸片段，将该片段插入到载体分子中，以及将重组载体整合到黑曲霉菌株中，其中可复制该核苷酸序列的多个拷贝或克隆。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成的、合成的起源、或其任何组合。
在本发明的方法中，生物物质也可以是融合的多肽，其中另一个多肽融合在多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码多肽的核苷酸序列(或其部分)与编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合而生产融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列以使得它们在读框内，并且融合多肽的表达是在相同启动子和终止子的调控之下。
在此定义″核酸构建体″为单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或已经对其进行改变而包含以不会另外存在于自然界的方式组合和毗邻的核酸节段。当核酸构建体包含为表达编码序列所需的所有调控序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。术语“编码序列”在此定义为当置于下列提及的调控序列的控制下转录成为mRNA并且转换为令人感兴趣的生物物质。一般通过开放阅读框确定编码序列的边界，其通常从ATG起始密码子或备选的起始密码子，例如GTG和TTG开始。编码序列可包括但不限于，DNA、cDNA和重组的核苷酸序列。
可以多种方式操作编码生物物质的分离核苷酸序列以保证生物物质表达。在将核苷酸序列插入到载体中之前，根据表达载体或黑曲霉宿主菌株对核苷酸序列的操作可能是合乎需要的或必须的。利用克隆方法来改变核苷酸序列的技术是本领域公知的。
将包括编码生物物质的核苷酸序列的核酸构建体可操作地与能够指导编码序列在本发明的突变黑曲霉菌株中，在与调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列连接。
术语“调控序列”在此定义为包括对核苷酸序列的编码序列的表达必须或有利的所有组分。各个调控序列可以是天然的或与编码生物物质的核苷酸序列是外源的。这种调控序列包括但不限于，前导序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少调控序列包括启动子和转录及翻译终止信号。对调控序列可提供接头以便导入便于连接调控序列和编码生物物质的核苷酸序列编码区的特异限制酶切位点。
调控序列可以是适当的启动子序列，其由用于表达核苷酸序列的黑曲霉菌株识别。启动子序列包含介导生物物质表达的转录调控序列。启动子可以是在突变黑曲霉菌株中显示转录活性的任何核酸序列，并且可从编码胞外或胞内生物物质的、与黑曲霉菌株同源或异源的基因获得。
用于在本发明的方法中指导核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下列基因获得的启动子米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusariumvenenatum Quinn (WO 00/56900)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶IV、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的启动子的杂合体)；以及其突变的、截短的、和杂合的启动子。特别优选的启动子是葡糖淀粉酶、TAKAα-淀粉酶、和NA2-tpi启动子。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由黑曲霉菌株识别以终止转录的序列。将终止子序列可操作地与编码异源生物物质的核苷酸序列的3’末端连接。在黑曲霉菌株中有功能的任何终止子都可用于本发明。
优选的终止子是从编码米曲霉TAKAα-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得的。
调控序列也可以是合适的前导序列，mRNA的非翻译区，其对于经黑曲霉菌株的翻译是很重要的。将前导序列可操作地与编码异源生物物质的核苷酸序列的5’末端连接。在黑曲霉菌株中有功能的任何前导序列都可用于本发明。
优选的前导序列是从编码米曲霉TAKAα-淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因获得的。
调控序列也可以是多聚腺苷酸序列，是可操作地与核苷酸序列的3’末端连接的序列，并且当其转录时，受到黑曲霉菌株识别而作为向转录的mRNA加入多聚腺苷残基的信号。在黑曲霉菌株中有功能的任何多聚腺苷酸序列都可用于本发明。
优选的多聚腺苷酸序列是从编码米曲霉TAKAα-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸合酶、和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因获得的。
调控序列也可以是编码与异源多肽氨基末端连接的氨基酸序列的信号肽编码区，并且指导编码的多肽进入菌株的分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5’末端可固有地包含在翻译阅读框中天然连接编码分泌多肽的编码区节段的信号肽编码区。备选地，编码序列的5’末端可包含与编码序列外源的信号肽编码区。外源的信号肽编码区可能是当编码序列通常不包含信号肽编码区时所必需的。备选地，外源的信号肽编码区可简单地替代天然的信号肽编码区以获得分泌增强的多肽。然而，任何指导表达异源多肽进入黑曲霉菌株分泌途径的信号肽编码区可用于本发明。
用于黑曲霉宿主菌株的有效信号肽编码区是从米曲霉TAKAα-淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖α-淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶、和Humicola lanuginosa脂肪酶基因获得的信号肽编码区。
调控序列也可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽称为原酶或原多肽(或有时称为酶原)。前多肽一般是非活化的并且可通过前肽的催化或自催化切割而从前多肽转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可从米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶基因、或嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶基因(WO 95/33836)获得。
其中信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端，前肽区紧接位于多肽的氨基末端而信号肽区紧接位于前肽区域的氨基末端。
核酸构建体也可包括编码一个或多个有利于指导异源生物物质表达的因子的一个或多个核苷酸序列，例如转录活化子(例如，反式作用因子)、伴侣分子、和加工蛋白酶。在黑曲霉菌株中有功能的任何因子都可用于本发明。编码一种或多种这些因子的核酸不是必须与编码异源生物物质的核苷酸序列串联的。
也可能需要加入容许调节异源生物物质相对于黑曲霉菌株生长而表达的调控序列。调节系统的实例是应答化学或物理刺激，包括存在调控化合物时导致打开或关闭基因表达的调节系统。TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作调控序列。调控序列的其它实例是容许基因增殖的序列，例如随重金属扩增的金属硫蛋白基因。这样的话，编码异源生物物质的核苷酸序列将可操作地与调控序列连接。
在本发明的方法中，包括核苷酸序列、启动子、及转录和翻译终止信号的重组表达载体可用于重组生产多肽或其它的生物物质。可将如上所述的多种核酸和调控序列连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制酶切位点以容许在这些位点插入或取代编码多肽或生物物质的核苷酸序列。备选地，可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在表达载体的产生中，编码序列位于载体中以便编码序列与用于表达的适当调控序列可操作地连接，并可能分泌。
重组表达载体可以是任何载体，其可便利地经受重组DNA方法而实现核酸序列的表达。载体的选择一般取决于载体与其中将导入该载体的黑曲霉菌株的相容性。载体可以是线性的或封闭的环状质粒。载体可以是自我复制载体，即以染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒，染色体外的元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何用于确保自我复制的方式。备选地，载体可以是当被导入黑曲霉菌株时，整合到基因组中并与其已经整合进入的染色体一起复制的载体。此外，载体系统可以是单个载体或质粒，或两个或多个载体或质粒，其同时包含将导入黑曲霉菌株基因组的总DNA或转位子。
当导入黑曲霉菌株时，可将载体整合到菌株基因组中。对于整合到本发明的突变黑曲霉菌株基因组中，载体可能依赖于编码异源生物物质的核苷酸序列，或通过同源或非同源重组将载体稳定整合到基因组中的任何其它元件。备选地，载体可包含用于通过同源重组到黑曲霉菌株基因组中而指导整合的附加核苷酸序列。附加的核苷酸序列能够使载体整合到宿主细胞基因组中染色体的准确位置。为了增加在准确位置整合的可能性，整合元件优选应包含足够数目的核酸，例如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，以及最优选800至1,500个碱基对，其与相应的靶序列是高度同源的以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与黑曲霉基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到菌株的基因组中。
对于自我复制，载体可进一步包括能够使载体在所述的黑曲霉中自主复制的复制原点。
可将如上所述的多种核酸和调控序列连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制酶切位点以容许在这些位点插入或取代编码异源生物物质的核苷酸序列。备选地，可通过插入序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体来表达编码异源生物物质的核苷酸序列。在表达载体的产生中，编码序列位于载体中以便编码序列与用于表达的适当调控序列可操作地连接，并可能分泌。
载体优选包含容许容易选择转化黑曲霉菌株的一个或多个可选择的标记物。可选择的标记物是提供抗微生物性或病毒抗性、重金属抗性、原养型到营养缺陷型等的基因产物。用于黑曲霉宿主菌株的选择性标记物可选自，包括但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素转乙酰酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸酯脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤转移酶)、和trpC(氨基苯甲酸合酶)，以及来自其它种属的等价物。优选用于黑曲霉菌株的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。
载体优选包含容许载体稳定整合到基因组中或容许载体在菌株中不依赖于菌株基因组而自发复制的元件。
“导入”是指将包括核苷酸序列的载体导入黑曲霉菌株以使得该载体保持为染色体的整合部分或作为染色体外自我复制的载体。一般认为整合是有利的，因为核苷酸序列更可能稳定地维持在该菌株中。通过同源重组，非同源重组、或转位使载体整合到染色体中。
将表达载体导入黑曲霉宿主菌株可包括由以本身已知的方式形成原生质体、转化原生质体、再生菌株壁组成的方法。转化曲霉宿主菌株的合适方法在EP 238 023和Yelton等人，1984，Proceedings of the National Academyof Sciences USA 811470-1474中有描述。
用于连接在此所描述的元件以构建重组表达载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，纽约)。
在本发明的另一个方面，突变黑曲霉菌株可进一步包含一个或多个第三核苷酸序列的变体，该第三核苷酸序列编码可能对生产、回收、和/或应用令人感兴趣的异源生物物质有害的物质。该变体减少或消除了一个或多个第三核苷酸序列的表达，产生当在相同条件下培养时比没有改变第三核苷酸序列的突变菌株可生产更多异源生物物质的突变菌株。
第三核苷酸序列可以例如编码酶。例如，该酶可以是氨肽酶、α-淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、突变酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。第三核苷酸序列优选编码蛋白水解酶，例如氨肽酶、羧肽酶、或蛋白酶。
本发明也涉及获得亲本黑曲霉菌株的突变株的方法，包括(a)在黑曲霉菌株中导入第一核苷酸序列，其包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因的变体，其分别涉及葡糖淀粉酶、蛋白酶、草酸水解酶、酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B的生产；以及(b)鉴定来自步骤(a)的包括改变的核苷酸序列的突变菌株，其中当在相同条件下培养时，与亲本黑曲霉相比突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产。
本发明进一步涉及亲本黑曲霉菌株的突变株，其包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自的asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因变体的一个或多个第二核苷酸序列，其分别涉及葡糖淀粉酶、蛋白酶、草酸水解酶、酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B的生产，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、和中性α-淀粉酶B、蛋白酶、和草酸水解酶的酶的生产。
通过下列不应被认为是对本发明范围加以限制的实施例进一步描述本发明。
实施例所有的引物和oligos由MWG Biotech，Inc.，High Point，NC提供。
用ABI 3700测序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行DNA测序。
菌株所有的菌株来源于黑曲霉(Aspergillus niger)Bo-1(DSM 12665)。黑曲霉Bo-1包括α-1，6转葡糖苷酶基因的突变而导致没有α-1，6-转葡糖苷酶活性。
培养基和溶液基本培养基的组成为每升6g NaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，20gNoble琼脂，10g葡萄糖，0.5g MgSO4·7H2O，和1ml的Cove微量元素。
Cove平板的组成为每升342.3g蔗糖，20ml Cove盐(50×)，10mM乙酰胺，15mM CsCl，和25g Noble琼脂。
50×Cove盐溶液的组成为每升26g KCl，26g MgSO4，76g KH2PO4，和50ml的Cove微量元素。
Cove微量元素溶液的组成为每升0.004g Na2B4O7·10H2O，0.4gCuSO4·5H2O，1.2g FeSO4·7H2O，0.7g MnSO4·H2O，0.8g Na2MoO2·2H2O，和10g ZnSO4·7H2O。
AMG微量金属溶液的组成为每升14.3g ZnSO4·7H2O，2.5gCuSO4·5H2O，0.5g NiCl2，13.8g FeSO4，8.5g MnSO4，和3.0g柠檬酸。
YP培养基的组成为每升10g酵母提取物和20g Bacto蛋白胨。
STC由0.8M山梨糖醇，50mM Tris，pH8，和50mM CaCl2组成。
SPTC由每升40％ PEG 4000，0.8M山梨糖醇，50mM Tris，pH8，50mMCaCl2组成。
SPC由每升40％ PEG 4000，0.8M山梨糖醇，和50mM CaCl2pH4.5组成。
酪蛋白平板的组成为每升7g NaH2PO4·H2O，0.5g KCl，0.2gMgSO4·7H2O，2g酵母提取物，10g葡萄糖，0.5g Triton X-100，20g Noble琼脂，和10g酪蛋白。
淀粉苯胺蓝平板的组成为每升0.1g葡萄糖，1g KH2PO4，0.5g MgSO4，0.5g KCl，3g NaNO3，0.1g酵母提取物，1ml Cove微量元素，5g淀粉苯胺蓝，15g Noble琼脂，和100mM甘氨酸pH2.9。
实施例1转化方法用限制性内切酶消化下列实施例中所描述的20微克的每一个断裂盒，利用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA)从1％琼脂糖-50mM Tris base-50mM硼酸盐-0.1mM EDTA二钠缓冲液(TBE)凝胶切下和纯化断裂所待用的片段。用无菌的蒸馏水使总体积达到20μl并且分为4个转化物。
利用下列的方法制备原生质体。使含有补充有5％葡萄糖的20ml YP培养基的摇瓶接种密度为每ml大约106-108的黑曲霉分生孢子。在34℃(200rpm)孵育过夜(15-17小时)后，通过用无菌的微孔布MiraclothTM(Calbiochem，San Diego，CA)过滤收集菌丝体，并转入在10-20ml 1.2M山梨糖醇中的每ml 3-5mg NovozymTM234的溶液(黑曲霉菌株JRoy3、SMO110、和MBin111到MBin114，参见实施例6-9)或1M MgSO4溶液(黑曲霉菌株MBin115到MBin120，参见实施例9-12)中。NovozymTM234的消化一般在37℃，以80-100rpm的温和摇动进行30-45分钟。使原生质体滤过无菌的MiraclothTM，用1.2M山梨糖醇(黑曲霉菌株MBin111到MBin114)或2M山梨糖醇(黑曲霉菌株MBin115到MBin120)漂洗，并且在3000×g离心10分钟。用10ml 1.2M山梨糖醇洗涤黑曲霉菌株JRoy3、SMO110和MBin111到MBin114两次，并用10ml 1.2M山梨糖醇-50mMCaCl2洗涤一次，然后以每ml 1.2M山梨糖醇3×107-1×108个原生质体的浓度进行重悬。用30ml 1M山梨糖醇洗涤黑曲霉菌株MBin115到MBin120一次，并用30ml STC洗涤一次，然后重悬在STC∶SPTC∶DMSO(8∶2∶0.1v/v)中以获得每ml 3×107-1×108个原生质体的浓度。直接使用该黑曲霉原生质体用于随后的转化或在-80℃冷冻。
在转化该原生质体前，溶解选择的盖层(overlap)并置于50℃。用于pyrG选择的盖层的组成为每升20ml Cove盐，273.8g蔗糖，8g Noble琼脂，6g NaNO3，和1g NZAmine酪蛋白氨基酸，pH5.5。使用pyrG选择盖层来产生所有的基因断裂。用于amdS选择的盖层的组成为每升20ml Cove盐(50×)，273.8g蔗糖，8g Noble琼脂，10mM乙酰胺，和15mM CsCl。当转化任何表达质粒时，使用amdS选择盖层。
将DNA加5μl肝素(5mg/ml STC)加入100μl的原生质体并置于冰上30分钟。在谱系中黑曲霉MBin115之前的黑曲霉菌株不接受肝素。在室温下孵育30分钟前，加入SPC(对于黑曲霉菌株JRoy3、SMO110和MBin111到MBin114为250μl，对于剩余的菌株为1ml)并温和地混合。加入10ml体积的盖层(50℃)并立即倾倒至选择性平板上。利用pyrG作为可选择标记物的对基因断裂的选择是补充有1M蔗糖的基本培养基。在产生黑曲霉MBin111菌株中，使用组成为每升1M蔗糖，1g 5-氟-乳清酸(5-FOA)，和10mM尿嘧啶核苷的基本培养基平板。Cove平板用来选择包含表达质粒的转化体。平板在34℃培养3-7天。
实施例2Southern分析从包含补充有5％葡萄糖(以及当适用时为10mM尿嘧啶核苷)的5mlYP培养基的15mm平板收获黑曲霉菌丝体，用10mM Tris pH7.4-0.1mMEDTA pH8(TE)，利用有侧臂的培养瓶和陶瓷滤器过滤并漂洗，最后置于微离心试管中，在加速真空下干燥1小时。
利用Qiagen DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)分离DNA。消化5微克的分离DNA 2小时(40μl总体积，4U的特异限制性核酸内切酶/μl DNA)并且利用TBE缓冲液在1％琼脂糖凝胶上电泳。通过用0.25M HCl处理，用1.5M NaCl-0.5M NaOH变性，以及用1.5M NaCl-1M Tris，pH8中和，使凝胶中的DNA片段化，然后在20×SSC中转移至MSI MagnaGraph尼龙转移膜上(Micron Separations，Inc.，Westborough，MA)。使DNA紫外交联到膜上并且在20ml的DIG Easy Hyb(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)中在60℃预杂交1小时。
用PCR DIG探针合成试剂盒，如制造商(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)所描述的制备探针，电泳，并从1％低熔点琼脂糖凝胶切下。在使用前，溶解凝胶并通过煮沸10分钟使探针变性。将总凝胶体积的百分之十加入杂交缓冲液。将变性探针直接加入DIG Easy Hyb缓冲液并在60℃杂交过夜。进行杂交后洗涤(在2×SSC中两次，在0.4×SSC中一次，每次为60℃，10分钟)，利用DIG检测系统和CPD-Star(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)进行化学发光检测。使用DIG-标记的DNA分子量标示III(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)作为标准。
实施例3黑曲霉基因组λ文库的构建根据Wahleithner等人，1996，Current Genetics.29395-403的方法通过在盐酸胍中裂解，然后如制造商所描述的在Qiagen Maxiprep柱上(QIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA)纯化来分离黑曲霉Bo-1 DNA。根据制造商的指导，在EMBL4(Clonetech，Palo Alto，CA)中产生黑曲霉Bo-1的基因组文库。用Sau3A部分消化黑曲霉Bo-1基因组DNA。消化后，DNA在预备的低熔点琼脂糖凝胶上电泳，从凝胶切下包含8至23-kb DNA的区域。用β-琼脂水解酶(New England Biolabs，Waltham，MA)从凝胶提取DNA。如供应商指导所描述的用EMBL4臂(Clonetech，Palo Alto，CA)连接分离的DNA。用Gigapack Gold II包装试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)体外包装该连接物。测定文库的滴度，并用大肠杆菌K802细胞扩增该文库(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)。估计未扩增的文库包含26,500个独立的重组体。
实施例4pyrG盒的构建将来自包含于EMBL4的黑曲霉Bo-1基因组文库的大约26,500个噬菌斑复制接种到尼龙滤膜上，并用来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)pyrG基因的1.4kb片段探测。如制造商所描述的纯化并增殖若干阳性克隆。利用QiagenλMini Prep试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)分离来自阳性克隆的噬菌体DNA。用几个限制性内切酶消化噬菌体DNA，然后是Southern分析以鉴定包含pyrG基因的片段。标明为克隆7b的一个克隆包含黑曲霉pyrG基因(SEQ ID NOs1[DNA序列]和2[推导的氨基酸序列])，在3.5kb的XbaI片段上包括启动子和终止子序列。
从克隆7b将pyrG基因片段以3.5kb的XbaI片段亚克隆到pUC118中(Roche Diagnostics Corporation，曼海姆，德国)产生pJRoy10(图1)。通过用KspI和SpeI消化从pJRoy10分离的包括启动子和终止子序列的pyrG基因。利用QIAEX II凝胶提取试剂盒，在1％琼脂糖TBE凝胶上电泳后，分离在5’末端包含KspI位点和在3’末端包含SpeI位点的片段并且纯化。
从pJRoy10PCR扩增pyrG终止子序列的582bp片段，因此分别在该片段的5’和3’末端加入SpeI和KspI位点。使用引物1来产生SpeI位点而引物2加入KspI位点。
引物15’-GGGACTAGTGGATCGAAGTTCTGATGGTTA-3’(SEQ IDNO3)引物25’-ATACCGCGGGTTTCAAGGATGGAGATAGGA-3’(SEQ IDNO4)在50μl反应物中进行PCR扩增，其组成为10ng pJRoy10质粒DNA，50pmol每种引物，2.5mM各种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mMMgCl2的1×PCR缓冲液(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)。在RoboCycler 40热循环仪(Stratagene，La Jolla，CA)中进行反应，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，60℃ 1分钟，和72℃1.5分钟；以及1个循环的72℃，5分钟。
用SpeI和KspI消化582bp的PCR产物并如下所述直接使用。
通过将黑曲霉pyrG基因片段和黑曲霉pyrG终止子片段连接到pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)的SpeI位点中，以使得pyrG在两侧都与582bp的终止子序列侧邻来构建质粒pMBin01+(图2)。从pMBin01+分离2696bp的SpeI片段，并在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化。利用Qiagen QiaPrep8小提或大提试剂盒(Qiagen，Inc.，Chatsworth，CA)分离质粒DNA。然后使用2696bp的SpeI片段构建所有的断裂盒。
实施例5尿嘧啶核苷营养缺陷型的产生下列实施例中描述的基因断裂使用黑曲霉pyrG基因作为选择性标记。pyrG基因编码orotodine-5’-磷酸酯脱羧酶，其赋予在不加入尿嘧啶核苷而生长的尿嘧啶核苷营养缺陷型。通过向如实施例4所描述的标记物末端加入重复序列使重复使用pyrG成为可能。通过当对5-FOA进行选择时在直接重复之间的同源重组而发生pyrG的切割(d′Enfert，1996，Current Genetics3076-82)。
如实施例4所描述的，断裂盒包含侧接582bp的重复pyrG终止子序列的pyrG基因。基因断裂后，使每种菌株在含有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上传代一次以便除去对pyrG基因的选择。从包含10mM尿嘧啶核苷的平板收集孢子并且转入包含10mM尿嘧啶核苷和每升1g 5-FOA的基本培养基平板。其中丢失pyrG基因的黑曲霉细胞在存在5-FOA时生长，而保持该基因的细胞将5-FOA转化为有毒的中间产物5-氟-UMP。从生长迟缓的非生成孢子集落的菌苔挑选出生长更快速的集落并生成孢子，通过在含有10mM尿嘧啶核苷和每升1g 5-FOA的基本培养基平板上传代两次进行分离，并且选择单个的、生成孢子的集落。如实施例2所描述的进行Southern分析以保证已经删除pyrG基因。在断裂位点留下1个拷贝的pyrG终止子。
实施例6黑曲霉SMO110(Δgla)的构建从实施例3中所描述的基因组λ文库分离8kb片段的黑曲霉葡糖淀粉酶(gla)基因(SEQ ID NOs5[DNA序列]和6[推导的氨基酸序列])，并亚克隆到pUC118(Roche Diagnostics Corporation，曼海姆，德国)中以产生pJRoy13。将来自pJRoy13的包含黑曲霉葡糖淀粉酶基因的4kb SpeI片段和1.8kb的侧翼DNA插入pBluescriptSK+中(Stratagene，La Jolla，CA)以产生pJRoy17(图3)。
利用QIAEX II Gel提取试剂盒，在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后，从pJRoy10分离包含pyrG基因的2.3kb的SpeI/XhoI片段，并在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化。用Klenow(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN)补平限制性末端，将该片段插入pJRoy17的葡糖淀粉酶基因编码区内的BglII位点以产生质粒pSMO127(图4)。pSMO127的2个SpeI位点之间是分别侧接2.2kb和2.3kb的5’和3’葡糖淀粉酶基因序列的2.3kb的pyrG基因。
用Spel消化质粒pSMO127，分离由线性的断裂盒组成的6kb片段并利用实施例1中所描述的转化方法用于转化缺失pyrG的菌株，黑曲霉JRoy3。利用实施例5中所描述的方法从黑曲霉Bo-1获得黑曲霉JRoy3。获得大约700个转化体。
从黑曲霉葡糖淀粉酶基因座(起始密码子前直接的1113bp)PCR扩增包含葡糖淀粉酶基因启动子的1100bp片段并且用作Southern印迹分析中的探针。以引物3和4产生探针，其中引物3与5’末端的SpeI位点杂交，而引物4在3’末端加入SphI位点。
引物35’-ACTAGTGGCCCTGTACCCAGA-3’(SEQ ID NO7)
引物45’-GCATGCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3’(SEQ ID NO8)在50μl的反应物中进行葡糖淀粉酶基因启动子的PCR扩增，其组成为10ng的pJRoy17质粒DNA，50pmol的每种引物，2.5mM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR缓冲液，以及2.5单位的TaqDNA聚合酶。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，55℃，1分钟，和72℃，2分钟；以及1个循环的72℃，5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记葡糖淀粉酶基因启动子探针。
从如实施例2所描述的700个转化体中的200个制备基因组DNA。用SpeI消化基因组DNA，然后用上述探针，利用实施例2中所描述的方法进行Southern分析。断裂盒基因替代到葡糖淀粉酶基因座中导致野生型4kb的葡糖淀粉酶基因条带增加至6.3kb，这是由于增加了2.3kb的pyrG基因。鉴定了一个这种转化体并指定为黑曲霉SMO110。
实施例7黑曲霉Mbin111(ΔpyrG，Δgla)的构建用与3’末端的SpeI位点杂交的引物5和在5’末端加入SphI位点的引物6从pJRoy17扩增800bp片段的黑曲霉葡糖淀粉酶基因终止子。
引物55’-GAGGTCGACGGTATCGATAAG-3’(SEQ ID NO9)引物65’-GCATGCAGATCTCGAGAATACACCGTTCCTCAG-3’(SEQID NO10)在50μl的反应物中进行gla基因终止子的PCR扩增，其组成为10ngpJRoy17质粒DNA，50pmol每种引物，2.5mM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR缓冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶。在RoboCycler40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，55℃，1分钟，和72℃，2分钟；以及1个循环的72℃，5分钟。
如下所述纯化包含葡糖淀粉酶基因终止子的800bp片段并直接使用。
利用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)，根据制造商的指导将葡糖淀粉酶基因启动子(实施例7)和终止子PCR产物亚克隆到pCR2.1载体中。利用QIAEX II凝胶提取试剂盒，在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后，分离包含葡糖淀粉酶基因启动子的1.1kb的SpeI/XhoI片段。以同样的方式分离葡糖淀粉酶基因终止子，然而由于内部的SphI位点，用SpeI/SphI消化产生554bp的片段。将启动子和终止子连接到pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)的SpeI位点中产生pMBin05(图5)。
通过限制性内切酶消化从pMBin05移出SpeI片段并在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒纯化。将分离的片段转化入黑曲霉SMO110(实施例6)以利用实施例1中所描述的转化方法删除pyrG断裂的葡糖淀粉酶位点。在将转化体接种到5-FOA上来选择减去pyrG的表型前(参见实施例5)，进行生长以在选择前提供更多的时间用于重组。在补充有5％葡萄糖，0.9M蔗糖，和10mM尿嘧啶核苷的5ml YP培养基中在37℃和100rpm生长24小时。
获得9个转化体，当转入实施例5中所描述的选择培养基时一个保持pyrG表型。将保持pyrG-表型的转化体指定为黑曲霉MBin111。
对黑曲霉葡糖淀粉酶和pyrG基因产生探针。利用实施例4中所描述的相同方法，使用上述的引物3和5来从pJRoy17PCR扩增gla基因(包括启动子和终止子)，使用引物1和2(参见实施例4)来从pJRoy10扩增pyrG终止子序列。如实施例2所描述的分离和标记探针。
如实施例2所描述的，从黑曲霉菌株JRoy3、SMO110、和MBin111分离基因组DNA，用SpeI消化，并根据实施例2所描述的用于Southern分析的方法用黑曲霉葡糖淀粉酶基因检测。在黑曲霉JRoy3中观察到表示未断裂的gla基因座的4kb条带和6.3kb的条带，这是由于插入了从黑曲霉SMO110获得的断裂盒。用来自黑曲霉MBin111的基因组DNA没有检测到杂交，表示已经缺失了葡糖淀粉酶基因。此外，用pyrG终止子序列检测用SpeI消化的DNA，再次没有在黑曲霉MBin111菌株中观察到杂交，但是黑曲霉SMO110保持有6.3kb的条带。这些结果表示在黑曲霉MBin111中缺失了全部的葡糖淀粉酶基因座和pyrG基因。
实施例8黑曲霉MBin112(Δasa，ΔpyrG，Δgla)的构建分离部分的黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶基因(asa)并如美国专利号5,252,726所描述的克隆到pUC19(Roche Diagnostics Corporation，曼海姆，德国)中。通过用HpaI消化从包含部分酸稳定的α-淀粉酶基因的pUC19切下部分酸稳定的α-淀粉酶基因的起始密码子346bp上游的101bp片段，并通过平末端连接将来自pMBin01(实施例4)的SpeI片段插入这个位点以产生pMBin04+(图6)。用SmaI和SpeI进行pMBin04+的二重消化，在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒分离4237bp的SmaI/SpeI片段。4237bp的SmaI/SpeI片段由酸稳定的α-淀粉酶基因的5’末端、pyrG终止子、全部的pyrG基因(包括终止子)、和酸稳定的α-淀粉酶基因的3’末端组成。
利用实施例1中描述的转化方法，用来自pMBin04+的SmaI/SpeI片段转化黑曲霉菌株MBin111。在基本培养基上总共获得160个转化体。然后将转化体转入淀粉苯胺蓝平板以筛选缺乏酸稳定的α-淀粉酶活性的转化体。16个转化体几乎没有产生澄清带，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离单个集落两次。
从酸稳定的α-淀粉酶基因座PCR扩增522bp的片段，用作Southern印迹分析中的探针。用引物7和8产生探针。
引物75’-CTCATTGGCCGAAACTCCGAT-3’(SEQ ID NO11)引物85’-AGCAGACGATGTCCTGAGCTG-3’(SEQ ID NO12)在50μl的反应物中进行522bp片段的PCR扩增，其由10ngpUC19/HW360质粒DNA，50pmol每种引物，2.5mM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR缓冲液，以及2.5单位的TaqDNA聚合酶组成。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，55℃ 1分钟，又72℃ 1分钟；以及1个循环的72℃，5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记522bp的探针。
如实施例2所描述的从16个转化体和作为对照的未转化黑曲霉菌株MBin111分离基因组DNA。然后用XhoI和SpeI消化基因组DNA，利用上述探针如实施例2中所描述的进行Southern杂交。完整的酸稳定的α-淀粉酶基因座显示为2.3kb的条带而断裂位点是5.3kb大小。这个大小差异是由于插入了实施例4中所描述的3kb pMBin01+SpeI片段。获得包含酸稳定的α-淀粉酶基因断裂的5个转化体，将1个指定为黑曲霉MBin112。黑曲霉菌株MBin113中产生的断裂盒的环突出留下了pyrG终止子并产生了2.8kb的条带。如实施例5所描述的进行环突出并产生黑曲霉MBin113。
实施例9黑曲霉MBin114(ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的构建利用WO 00/20596中描述的2个重叠的克隆，NcE 1.4和ClE 1.8构建黑曲霉prtT基因(SEQ ID NOs13 DNA序列]和14[推导的氨基酸序列])(pMBin09，图7)。用PstI消化NcE 1.4，ClE 1.8，和pZeRO-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)，分别在克隆的5’和3’末端产生PstI位点，并且在多克隆位点使pZeRO-2线性化。利用prtT克隆的共享区中的SspI位点，通过在PstI位点将PstI/SspI克隆片段连接到pZeRO-2中进行三线连接产生pMBin09。
通过用Bstl107I/SspI消化pMBin09首先产生233bp缺失的prtT编码序列，将实施例4中描述的pMBin01 SpeI片段作为平端片段插入到消化的pMBin09中以产生pMBin10(图8)。利用QIAEX II凝胶提取试剂盒在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后分离来自pMBin10的DraIII/NheI片段，用其进行prtT断裂。
利用实施例1中描述的转化方法，用来自pMBin10的DraIII/NheI片段转化黑曲霉MBin113。在酪蛋白平板上筛选102个转化体。9个转化体几乎没有或没有显示澄清带，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离单个集落两次。
从pMBin10中的prtT基因座PCR扩增232bp片段的prtT编码序列并且用作Southern印迹中的探针。利用引物9和10产生该片段。
引物95’-TGTGATTGAGGTGATTGGCG-3’(SEQ ID NO15)引物105’-TCAGCCACACCTGCAAAGGC-3’(SEQ ID NO16)在50μl的反应物中进行PCR扩增，其由10ng pMBin10质粒DNA，50pmol每种引物，2.5mM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mMMgCl2的1×PCR缓冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶组成。反应在RoboCycler 40热循环仪中进行，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，60℃，1分钟，和72℃，1分钟；以及1个循环的72℃，5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记探针，其包含断裂的232bp的prtT编码序列下游。
如实施例2所描述的从9个转化体，以及作为对照的黑曲霉Bo-1和黑曲霉MBin112分离基因组DNA，并且如实施例2所描述的进行Southern分析。用PstI消化基因组DNA，在对照菌株中观察到相应于未断裂的prtT基因的2.5kb条带。当探针与包含132bp的pyrG终止子和1198bp的prtT基因的PstI片段杂交时观察到相应于prtT基因断裂的1.3kb条带。选择1个断裂体并指定为黑曲霉MBin114。如实施例5所描述的外环化(loopedout)pyrG基因产生黑曲霉MBin115。
实施例10黑曲霉MBin116(ΔamyB，ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的构建如美国专利号5,252,726中所公开的内容克隆黑曲霉中性α-淀粉酶基因，amyA和amyB(NA1＝amyA而NA2＝amyB)。
通过EcoRI/BglII消化，并利用QIAEX II凝胶提取试剂盒在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后分离，从pTaka17(美国专利号5,536,661)分离2.6kb片段的黑曲霉中性α-淀粉酶基因(amyB)(SEQ ID NOs17[DNA序列]和18[推导的氨基酸序列])。将2.6kb片段插入pZero2.0(Invitrogen，Carlsbad，CA)的EcoRI/BamHI位点以产生pMBin02(图9)。通过PmeI/SmaI消化在pMBin02中产生从同源amyB基因的第5个外显子除去186bp和从第6个外显子除去52bp的298bp缺失，并通过平末端连接插入pMBin01 2696bp SpeI片段(实施例4中描述的)以产生pMBin03(图10)。
利用实施例1中描述的方法用分离来自pMBin03的EcoRI/AvrII片段转化黑曲霉MBin115。获得192个转化体，如实施例8所描述的转入淀粉苯胺蓝平板，其中有下列改变淀粉苯胺蓝平板缺乏甘氨酸并且pH是至少5。8个转化体显示减少的澄清带，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离单个集落两次。
利用引物11和12PCR扩增产生具有相应于黑曲霉amyA或amyB编码序列的295bp，ATG位点的450bp下游(在该区域中amyA和amyB序列是相同的)的序列的探针。
引物115’-GGCAGCAGGATATGTAAGTCG-3’(SEQ ID NO19)引物125’-CACTGTAATCGACTGAGCTAC-3’(SEQ ID NO20)在50μl反应物中进行PCR，其由10ng pMBin03质粒DNA，50pmol每种引物，2.5mM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mM MgCl2的1×PCR缓冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶组成。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，60℃，1分钟，和72℃，1分钟；以及1个循环的72℃，5分钟.
如实施例2所描述的分离和标记探针。如实施例2所描述的从8个转化体和作为对照的未转化黑曲霉MBin115分离基因组DNA并用EcoRI和BspLU11I消化。利用实施例2中描述的方法对消化的基因组DNA进行Southern分析。起始密码子的616bp上游存在EcoRI位点，终止密码子的99bp下游存在BspLu11I位点。野生型黑曲霉菌株Bo-1 amyB基因条带是2659bp。断裂的amyB基因导致2659bp条带的消失，并且由于插入pMBin01 SpeI片段，在5359bp显示条带。
1个转化体包含清楚的断裂并被指定为黑曲霉MBin116。如实施例5所描述的从黑曲霉MBin116切下pyrG基因，并将该菌株指定为黑曲霉MBin117。
实施例11黑曲霉MBin118(ΔamyA，ΔamyB，ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的构建因为黑曲霉amyA基因序列与amyB是基本上相同的，除在3’末端(Korman等人，1990，Current Genetics 17203-212)之外，因此应用实施例10中所使用的断裂构建和方法。根据实施例1中描述的方法用来自pMBin03的EcoRI/AvrII片段转化黑曲霉MBin117，以便断裂amyA基因(SEQID NOs21 DNA序列]和22[推导的氨基酸序列])。
获得356个转化体并如实施例10所描述的转入淀粉苯胺蓝平板。在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离在淀粉苯胺蓝平板上没有产生澄清带的4个转化体的单个集落两次。
从4个转化体和作为对照的黑曲霉MBin117分离基因组DNA并利用实施例2中描述的方法进行Southern分析。用EcoRI和BspLU11I消化基因组DNA并如实施例10所描述的进行检测。在野生型黑曲霉Bo-1菌株中存在相应于amyB基因的2.7kb条带和表示amyA基因的略大的条带。amyA条带的确切大小不是已知的，因为BspLU11I在amyA基因下游的未知位点有切割。在1个分析的转化体中，相应于amyA基因的条带不再是用探针可检测到的，表明已经存在包括探针位置的amyA基因的缺失。将该转化体指定为黑曲霉MBin118。如实施例5所描述的从黑曲霉MBin118切下pyrG基因，并将该菌株指定为黑曲霉MBin119。
实施例12黑曲霉MBin120(Δoxa，ΔamyA，ΔamyB，ΔprtT，Δasa，ΔpyrG，Δgla)的构建根据WO 00/50576中描述的方法克隆黑曲霉草酸水解酶(oah)基因(SEQ NOs23[DNA序列]和24[推导的氨基酸序列])。如WO 00/50576所描述的构建质粒pHP1。
通过用BstEII消化pHP1除去285bp的缺失，其包括156bp的启动子和129bp的草酸水解酶基因编码序列。将实施例4中描述的pMBin01 SpeI片段平末端连接到这个位点中以产生pMBin08(图11)。用NotI消化质粒pMBin08，在1％琼脂糖-TBE凝胶上电泳后利用QIAEX II凝胶提取试剂盒分离7155bp的片段。来自pMBin08的NotI片段用来断裂黑曲霉MBin119中的草酸水解酶基因。
利用实施例1中描述的转化方法，用来自pMBin08的NotI片段转化黑曲霉MBin119。获得49个转化体，利用Sigma草酸酯试剂盒(编号591，SigmaDiagnostics，St.Louis，MO)筛选草酸酯的产生。通过将密度为每ml大约104个转化体的分生孢子接种到包含补充有5％葡萄糖的20ml YP培养基的125ml摇瓶中而在摇瓶中培养转化体。在37℃和200rpm培养摇瓶3至6天。在第3天移出5μl的摇瓶培养物样品并离心以产生上清液用于酶活性测定。将第3天的上清液加入96孔平板的孔中，然后按照制造商的说明加入1/10体积的草酸酯试剂盒试剂。在590nm分光光度测量草酸酯的产量。1个转化体没有产生可检测的草酸酯，在补充有10mM尿嘧啶核苷的基本培养基上分离单个集落两次。
利用引物13和14从草酸水解酶基因内(起始密码子下游的404bp)PCR扩增包括579bp序列的片段用作Southern印迹分析中的探针。
引物135’-CTACGACATGAAGACCAACGC-3’(SEQ ID NO25)引物145’-GCACCGTTCTCCACCATGTTG-3’(SEQ ID NO26)在50μl的反应物中进行PCR扩增，其由10ng pMBin08质粒DNA，50pmol每种引物，2.5mM每种dATP、dCTP、dGTP、和dTTP，具有2.5mMMgCl2的1×PCR缓冲液，以及2.5单位的Taq DNA聚合酶组成。在RoboCycler 40热循环仪中进行反应，程序为1个循环的95℃，3分钟；30个循环的95℃，1分钟，60℃，1分钟，和72℃，1分钟；以及1个循环的72℃，5分钟。
如实施例2所描述的分离和标记探针。如实施例2所描述的从转化体，以及作为对照的黑曲霉Bo-1和黑曲霉MBin118分离基因组DNA，并且用NdeI和SspI消化。用上述探针对黑曲霉对照菌株Bo-1和MBin118的Southern分析显示相应于未断裂草酸水解酶基因的2.5kb条带。该转化体具有与在草酸水解酶基因座插入断裂盒一致的4.9kb条带。将该转化体指定为黑曲霉MBin120。
实施例13黑曲霉普通宿主菌株的表达分析通过在摇瓶和/或发酵罐中培养菌株评估普通宿主黑曲霉菌株产生葡糖淀粉酶、酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶、和蛋白酶的能力。黑曲霉Bo-1作为对照。
将密度为每ml大约104的黑曲霉菌株分生孢子接种到包含补充有5％葡萄糖的20ml YP培养基的125ml摇瓶中。摇瓶在37℃和200rpm培养3至6天。在第3-6天移出摇瓶培养物样品，离心产生用于酶活性测定的上清液。
也将黑曲霉菌株接种到包含1.8升培养基的2升发酵罐中，培养基组成为每升2g MgSO4·7H2O，2g KH2PO4，2g柠檬酸，2g K2SO4，0.5ml AMG微量金属溶液，300g高麦芽糖糖浆，1.8g CaCl2·2H2O，和1.8ml普朗尼克酸(pluronic acid)。培养的发酵培养基是组成为每升50g尿素和5ml普朗尼克酸的培养基。发酵条件是34℃，pH4.5+/-0.05，1.0vvm曝气(aeration)，和1000rpm进行8天。在第1-8天移出发酵样品，离心产生用于酶活性测定的上清液。
在25℃，pH4.3的0.1M醋酸钠中利用麦芽糖作为底物测量葡糖淀粉酶活性。根据制造商的指导，利用Sigma Trinder显色试剂(Sigma reagent kit315-100，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在490nm测量葡萄糖。AMGTM(Novozymes A/S，Bagsvrd，丹麦；批次7-195)用作以AGU/ml测量的具有葡糖淀粉酶活性的标准物。
确定黑曲霉SMO110没有产生可检测的葡糖淀粉酶活性(在第4天的摇瓶样品中小于0.5AGU/ml)。确定黑曲霉MBin111没有产生可检测的葡糖淀粉酶活性(在第4天的摇瓶或发酵样品中小于0.5AGU/ml)。
分别在pH4.5和pH7.0，利用Sigmaα-淀粉酶底物(Sigma Kit #577，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)在30℃测量酸稳定的和中性α-淀粉酶活性。检测是在405nm。FungamylTM用作标准物并且以FAU/ml报告活性。
与黑曲霉Bo-1(在第5天的发酵样品中为51FAU/ml)相比，对于黑曲霉MBin113、MBin116、和MBin118(在第3天的摇瓶或发酵样品中都＞0.1FAU/ml)发现几乎不能检测到酸稳定的α-淀粉酶活性。与发酵样品中的黑曲霉Bo-1相比，对于黑曲霉MBin114(来自第3天的摇瓶样品为未检测到和在第5天的发酵样品中为5.7FAU/ml)中性α-淀粉酶活性基本上减少了，而对于黑曲霉MBin118(在第5天的发酵样品中为0.5FAU/ml)几乎不能检测到。
利用FITC-酪蛋白作为底物(Sigma Chemical Co.，St.Loius，MO)确定总的蛋白酶活性。通过混合40μl的FITC-干酪素底物(储液1∶1，具有0.1M磷酸钾，pH6.0或0.1M柠檬酸钠，pH5.0)和在0.1M磷酸钾pH6.0或0.1M柠檬酸钠pH5.0中适当稀释的10μl培养物样品，然后在37℃孵育该溶液1小时而进行测定。孵育1小时后，用150μl的5％三氯乙酸淬灭反应并在冷藏室中孵育1小时。将淬灭的反应物转入Eppendorf试管并离心10分钟。将10μl等分的上清液转入包含1ml 0.5M硼酸盐pH9.0的试管并混合。将200μl等分的溶液转入黑色的“U”底96孔平板(ThermoLabsystems，Franklin，MA)。利用Fluorolite 1000仪器(ThermoLabsystems，Franklin，MA)，用参考通路3和设置为1176测量荧光。以蛋白酶荧光单位测量活性。
对于黑曲霉MBin114中prtT基因的缺失，总的蛋白酶活性降低到黑曲霉Bo-1的大约20％。第6天的MBin114发酵样品具有692的蛋白酶活性，而Bo-1是至少3953荧光单位/ml。
实施例14南极洲假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉MBin114、MBin118和MBin120中的表达如美国专利号6,020,180所描述的克隆假丝酵母南极洲脂肪酶B基因(SEQ ID NOs27[DNA序列]和28[推导的氨基酸序列])。如Hoegh等人在Can.J.Bot.73(Suppl.1)S869-S875(1995)中所描述的构建包含脂肪酶B基因的质粒pMT1335。如WO 91/17243所描述的构建包含构巢曲霉amdS基因的质粒pTOC90。根据实施例1中描述的方法将质粒pMT1335和pTOC90共转化入黑曲霉MBin114，并且在乙酰胺上选择转化体。
通过划线至乙酰胺平板分离30个转化体。从转化体收集分生孢子，用于如实施例13所描述的接种于摇瓶。在第3-6天移出摇瓶培养物样品，离心产生用于酶活性测定的上清液。
为了评估prtT基因的断裂对蛋白酶活性的总水平的影响，和南极洲假丝酵母脂肪酶B(CLB)的产率，确定蛋白酶和脂肪酶B的活性。通过发酵评估产生脂肪酶B的几个转化体和最高的生产体。
如实施例13所描述的，在2升的发酵罐中培养黑曲霉MBin114和作为对照的黑曲霉Bo-1。
如实施例9所描述的测量总的蛋白酶活性。
在pH7，用p-硝基苯基丁酸(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)作为底物进行脂肪酶B测定。在0.1M MOPS-4mM CaCl2pH7.0中适当稀释培养物上清液。将100μl等分的培养物上清液加入在96孔微平板孔中的100μl的p-硝基苯基丁酸底物溶液。p-硝基苯基丁酸底物溶液由10μl的p-硝基苯基丁酸，990μl的DMSO，和4ml的0.1M MOPS-4mM CaCl2pH7.0组成。用南极洲假丝酵母脂肪酶B标准物(Novozymes Japan Ltd.，Chiba-shi，日本)来计算LU/ml，在405nm分光光度测量脂肪酶活性。
图14和15显示了这些测定的结果。总的蛋白酶活性降低到野生型的大约20％(参见实施例13，图12)，脂肪酶B活性在发酵的自始至终稳定地上升(图13)。
实施例15Scytalidium thermophilum过氧化氢酶在黑曲霉MBin114、MBin118和MBin120中的表达如美国专利号5,646,025所描述的克隆Scytalidium thermophilum过氧化氢酶基因(SEQ ID NOs29[DNA序列]和30[推导的氨基酸序列])。如美国专利号5,646,025所描述的构建包含过氧化氢酶基因的质粒pDM153。根据实施例1描述的方法将质粒pDM153转化入黑曲霉菌株MBin114、MBin118、和MBin120。
选择40个转化体，在包含1.5ml 1∶4稀释度的M400培养基的24孔平板中培养。在34℃和125rpm培养平板90小时。在第90个小时移出样品用于测定。在发酵罐中评估产生最高水平的过氧化氢酶活性的3个转化体。
在25℃，包含18.2μl过氧化氢储液的10mM磷酸盐pH7缓冲液中测量过氧化氢酶活性。过氧化氢储液由每10ml 10mM磷酸钾pH7的30％过氧化氢组成。将25μl等分的培养物上清液加入在96孔微平板孔中的25μl的过氧化氢储液。孵育5分钟后，加入200μl的钛试剂，在405nm读取吸光率。钛试剂由1.0g二氧化钛和10g K2SO4组成，其用150ml浓缩的H2SO4在180-220℃消化2-3小时，冷却，然后用1.5升去离子水稀释。利用Catazyme(Novozymes A/S，Bagsvrd，丹麦，批次31-2197)作为标准物，并以KCIU/ml报告在405nm分光光度测量过氧化氢酶活性。
如实施例13所描述的，在2升发酵罐中培养黑曲霉菌株MBin114、MBin118、和MBin120。
图15显示了黑曲霉普通宿主菌株MBin114、MBin118和MBin120中Scytalidium thermophilum过氧化氢酶生产的比较。在任何测试的菌株中没有观察到酶生产量的明显变化。
在此所描述和要求的本发明不限于在此所公开的由特定方面所限制的范围，因为这些方面旨在例证说明本发明的几个方面。任何等效方面限定为是在本发明的范围内的。实际上，除在此所显示和描述的实施方案外，从上述说明书看来，本发明的各种改变对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种改变也是属于所附的权利要求的范围内的。就分岐来说，包括定义的本公开的内容将进行控制。
在此引用多种参考文献，其公开的内容全部引入作为参考。
序列表<110>诺维信股份有限公司(Novozymes Biotech，Inc.)<120>在缺乏酶的黑曲霉突变体中生产生物物质的方法<130>10345.204-WO<160>30<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1517<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>1gcagggaaaa atacgagctc caatgaacct gggtgtggca acttcaatgg aaaggaactg 60cctttgcagg tgtggctgaa ccccacggtt ccggtcggag gcggcgaaat cacccgatgt 120ggctggtgcg tggagggtcg cgatgattta ctgagctcct cttttgctcg acattgaatg 180tgcattgttc acctcatata agggccagtc gctgctaaat tattcggtag tatttgcgca 240tctctggatc taccaattag ggcctatcag tcgaaactcc aagctactca tattgcacaa 300gcctctttca tccccgcatt aacccctcca ccgacaccat gtcctccaag tcgcaattga 360cctacactgc ccgtgccagc aagcacccca atgctctggc caagcggctg ttcgaaattg 420ctgaggccaa gaagaccaat gtgaccgtct ctgccgacgt taccaccact aaggagctac 480tagatcttgc tgaccgtagg ccgacccgcc attctgcctg tttatgctgc atacaaactt 540attaacggtg ataccggact gaggtctcgg tccctacatc gccgtgatca aaacccacat 600cgatatcctc tctgacttca gcgacgagac cattgagggc ctcaaggctc ttgcgcagaa 660gcacaacttc ctcatcttcg aggaccgcaa attcatcgac attggcaaca ctgtccagaa 720gcaataccac cgtggtaccc tccgcatctc agaatgggcc catatcatca actgcagcat 780cctgcctggc gagggtatcg tcgaggctct cgctcagacg gcgtctgcac cggacttctc 840ctacggcccc gaacgtggtc tgttgatctt ggcggaaatg acctctaagg gttccttggc 900caccggccag tacactactt cttcggttga ttatgcccgg aaatacaaga acttcgtcat 960gggatttgtg tcgacccgct cgttgggtga ggtgcagtcg gaagtcagct ctccttcgga1020tgaggaggac tttgtggtct tcacgactgg tgtgaacatt tcgtccaagg gagataagct1080cggtcagcag taccagactc ccgcatcggc tatcggtcgg ggtgctgact tcattatcgc1140gggtcgcggt atctacgccg cgccggaccc ggtgcaggct gcgcaacagt accagaagga1200aggttgggag gcgtacctgg cccgtgtcgg cggaaactaa tactataaaa tgaggaaaaa1260agttttgatg gttatgaatg atatagaaat gcaacttgcc gctacgatac gcatacaaac1320taatgtcgag cacgggtagt cagactgcgg catcggatgt caaaacggta ttgatcctgc1380aggctattat agggtggcac gggattaatg cggtacgacg atttgatgca gataagcagg1440ctgcgaagta cttagtcctg taactcttgc gtagagcaaa tggcgacggg tggctgataa1500gggacggtga taagctt 1517
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atggattaga ccttcaacag gtttcgaagg aagacccaga cttcttcgtc aagcaagggg2460tgataattgg tgtcgcacgc cggttcgtta gcgacattag agattgggcc aaccaataca2520<210>22<211>498<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>22Met Met Val Ala Trp Trp Ser Leu Phe Leu Tyr Gly Leu Gln Val Ala1 5 10 15Ala Pro Ala Leu Ala Ala Thr Pro Ala Asp Trp Arg Ser Gln Ser Ile20 25 30Tyr Phe Leu Leu Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Ser Thr Thr35 40 45Ala Thr Cys Asn Thr Ala Asp Gln Lys Tyr Cys Gly Gly Thr Trp Gln50 55 60Gly Ile Ile Asp Lys Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala65 70 75 80Ile Trp Ile Thr Pro Val Thr Ala Gln Leu Pro Gln Thr Thr Ala Tyr85 90 95Gly Asp Ala Tyr His Gly Tyr Trp Gln Gln Asp Ile Tyr Ser Leu Asn100 105 110Glu Asn Tyr Gly Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ala Leu Ser Ser Ala Leu115 120 125His Glu Arg Gly Met Tyr Leu Met Val Asp Val Val Ala Asn His Met130 135 140Gly Tyr Asp Gly Ala Gly Ser Ser Val Asp Tyr Ser Val Phe Lys Pro145 150 155 160Phe Ser Ser Gln Asp Tyr Phe His Pro Phe Cys Phe Ile Gln Asn Tyr165 170 175Glu Asp Gln Thr Gln Val Glu Asp Cys Trp Leu Gly Asp Asn Thr Val180 185 190Ser Leu Pro Asp Leu Asp Thr Thr Lys Asp Val Val Lys Asn Glu Trp195 200 205Tyr Asp Trp Val Gly Ser Leu Val Ser Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu210 215 220
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Tyr Gly<210>23<211>3494<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220>
<221>misc_feature<222>(3370)..(3370)<223>n＝a，c，g或t<400>23tgctccctcg gccaagcgcc aataacgtcc gattcatccc attcctcgtc cagctggcga 60actccggagg ttgattgctc gctcgctctc agttggccac caaacttact cgtccccctc120cttcaccctc cctcctctgc caatgctaca gagtacttgg ctaggctact atcttctcag180ctgggtgaag aacaacgggc cccgtgcgtg atgagcaaaa gcgtctgaca tgcagcaact240gcagtatact ggagcccgcg gctaccgagg aactcgtgct cgtgtgccac cacatcgaag300tgagttgatg cgtcttgtcc atgcagtgtc ggcgtggcct aaagtacggg ccaaacctgt360ctgacttcat cccacactat taccccctcc ctcattctcc cctgattcgg cccaataagg420aaatcactta gtcaatcaat cctgccatta ccggcgcgta atctgaaact acgcgcggac480tgtctcttac tcccctcgcg gtgggcggcc cagccagccc catccttact agatttagcg540aattactggt cattagccct gtacggggga ggggcgggaa aacaaaaatg cgaataatag600aataaattta ataaagaaaa aagagggggg gggagcttat ctaggcccct gctgcattgc660attcggacat ttttcgactt gtcacaggca caaatcatag tccgccgatg gcgtcgattg720accattttct tttcttttct cggcgctggg atggtggcca agaaaattga atggcaatgg780ttcgttcacc ggagtagggt gtacgtgcat tgtgtggatt gacgatgatt ctcggccaag840ggcttgcgtt gcaatcccac caggagggga atgttgcaga cagacagaaa gcaaaagaag900tattggaggg aaaaaaacaa ttcttgaaaa atgatcttct caggtaatga atattggttg960ctggcgggct gatcttctcc cgacacgtct atataaactg gtcaccttct ggcccttcct 1020ttctatctct tccttctcat catcagtctc aaacaagcct ctttctctcc taccttcact 1080ctccactttc tcctttcgaa agggataaaa ctctcctcct cattctcacc tatatatacc 1140ttgtgctttt ctcgcaatga aagttgatac ccccgattct gcttccacca tcagcatgac 1200caacactatc accatcaccg tagagcagga cggtatctat gagatcaacg gtgcccgtca 1260agagcccgtg gtcaacctga acatggtcac cggtgcgagc aaactgcgca agcagcttcg 1320cgagaccaat gagttgctcg tgtgtcctgg tgtgtacgac ggtctgtccg cccgtattgc 1380catcaacctg ggcttcaagg gcatgtacat ggtatgttgg attccttaga ctacctttcc 1440ccacagtcaa cacttctccg cttccgcgat ggagaaaaaa gatcatacta acggaaaggt 1500cagaccggcg ccggtactac cgcgtctaga ctgggcatgg ccgatctggg tctagcccac 1560atctacgaca tgaagaccaa cgcagagatg atcgcgaacc tggaccccta cggtcctccc 1620
ctgatcgcag acatggacac tggctacgga ggtgagaatc ccccatctcc actgtctgcc1680aagacataat gatctacccg cgccaaaaag caaaacggca atatagaccc agttccccac1740taacaccaaa aaaacaaaaa taggccccct gatggtcgcc cgttccgttc aacaatacat1800ccaagccgga gtcgcgggat tccacatcga agatcagatc caaaacaagc gatgcggaca1860cctggcaggc aagcgcgtcg tcaccatgga cgaatacttg actcgcatcc gcgccgccaa1920gctcaccaag gaccgcctcc gcagcgacat cgtgctgatt gcccgcaccg acgccctcca1980gcagcacggc tacgacgagt gcattcgccg ccttaaggcc gcccgcgatc ttggcgccga2040tgttggtctc ctcgagggct tcaccagtaa ggagatggcg aggcggtgtg tccaggacct2100tgcgccttgg ccgcttctgc tcaacatggt ggagaacggt gctgggccgg ttatttccgt2160cgatgaggct agggaaatgg gcttccgcat tatgatcttc tcgttcgctt gcattactcc2220tgcctatatg gggattaccg ctgctctgga gaggctcaag aaggatggtg tggttgggtt2280gcccgagggg atggggccga agaagctgtt tgaggtgtgc ggattgatgg actcggtgag2340ggttgatacc gaggctggtg gagatgggtt tgctaatggt gtttaattct tttctttttt2400tgattcttaa ttccctggtt gttttgttgt gaaagtttct tatttttctg gtttgtttta2460tttccccttc tggtaactaa ttttgtgtga gaaagagttg ttgagttggg ttgaactgca2520ttggatggga ttgatttatt ttcgggatca aagtgaaagg aagggaaggg ggctgtgtta2580ttggttttcg agtggggacc gatatattcc tactatacat atcgaagctt gcgtggtaca2640tatactagta tctactacat taccaagaat ggaaatgaaa actgggtgtt agatttcagt2700tgacaggtct tatgttcgtt taccgataga gtaattcctg cttctcactc catgtgagcc2760caatcacaat ggaattgtaa tctggttgcc ttataagtac ttagtactct gtactctgta2820ctacttctcg catcacatca aatcttaata cttagtacgt agtttgtttc acccagcaaa2880accttattgc cttaacaatc atattctcag taagcacgag acacagaaac gagagaagta2940ttctagaccc tgacagaacw ccctgatcga cagtcactta cccaacaaag taagtggtct3000ctaccctctg attacagtta aggcaggcag tagtaagcaa gaagaagaaa gaaagaataa3060ttaactacta agtttctcac tactgcatgc acgaccacgg agtcgccgtg caaaaaaatt3120ggtgcgtgct cagctagctg cactctgcac actgccaccc tcgccctaca aaagaaacca3180tgctgtttct ccactatact gttcccgcga tgaaactagg gccaataacc atgcagttac3240tattggtccc actggggtgg gttgggtagc cttatggtat taaaaggagt aggggtcttt3300gtcgatcgtt ttctgttttc tttttgkatt tttatttytg ttggwctctg tttgtgttgt3360gttgggccgn ttttgttttc tttgggtaac gagggatggg aatatattca tatggaaatg3420gaaatggatt atgctattga ttgatgaatg gtgatgatct gcgtggaaat taatgtcaga3480gtcttgmtga ttca 3494<210>24<211>341<212>PRT
<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>24Met Lys Val Asp Thr Pro Asp Ser Ala Ser Thr Ile Ser Met Thr Asn1 5 10 15Thr Ile Thr Ile Thr Val Glu Gln Asp Gly Ile Tyr Glu Ile Asn Gly20 25 30Ala Arg Gln Glu Pro Val Val Asn Leu Asn Met Val Thr Gly Ala Ser35 40 45Lys Leu Arg Lys Gln Leu Arg Glu Thr Asn Glu Leu Leu Val Cys Pro50 55 60Gly Val Tyr Asp Gly Leu Ser Ala Arg Ile Ala Ile Asn Leu Gly Phe65 70 75 80Lys Gly Met Tyr Met Thr Gly Ala Gly Thr Thr Ala Ser Arg Leu Gly85 90 95Met Ala Asp Leu Gly Leu Ala His Ile Tyr Asp Met Lys Thr Asn Ala100 105 110Glu Met Ile Ala Asn Leu Asp Pro Tyr Gly Pro Pro Leu Ile Ala Asp115 120 125Met Asp Thr Gly Tyr Gly Gly Pro Leu Met Val Ala Arg Ser Val Gln130 135 140Gln Tyr Ile Gln Ala Gly Val Ala Gly Phe His Ile Glu Asp Gln Ile145 150 155 160Gln Asn Lys Arg Cys Gly His Leu Ala Gly Lys Arg Val Val Thr Met165 170 175Asp Glu Tyr Leu Thr Arg Ile Arg Ala Ala Lys Leu Thr Lys Asp Arg180 185 190Leu Arg Ser Asp Ile Val Leu Ile Ala Arg Thr Asp Ala Leu Gln Gln195 200 205His Gly Tyr Asp Glu Cys Ile Arg Arg Leu Lys Ala Ala Arg Asp Leu210 215 220Gly Ala Asp Val Gly Leu Leu Glu Gly Phe Thr Ser Lys Glu Met Ala225 230 235 240Arg Arg Cys Val Gln Asp Leu Ala Pro Trp Pro Leu Leu Leu Asn Met245 250 255Val Glu Asn Gly Ala Gly Pro Val Ile Ser Val Asp Glu Ala Arg Glu
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<221>MISC_FEATURE<222>(1389)..(1389)<223>X＝Xaa<400>28Met Arg Val Ser Leu Arg Ser Ile Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Val Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Leu Asp Arg Arg Ala20 25 30Ala Leu Pro Asn Pro Tyr Asp Asp Pro Phe Tyr Thr Thr Pro Ser Asn35 40 45Ile Gly Thr Phe Ala Lys Gly Gln Val Ile Gln Ser Arg Lys Val Pro50 55 60Thr Asp Ile Gly Asn Ala Asn Asn Ala Ala Ser Phe Gln Leu Gln Tyr65 70 75 80Arg Thr Thr Asn Thr Gln Asn Glu Ala Val Ala Asp Val Ala Thr Val85 90 95Trp Ile Pro Ala Lys Pro Ala Ser Pro Pro Lys Ile Phe Ser Tyr Gln100 105 110
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385 390 395 400Phe Ile Lys Gln Ala Phe Asp Gly Thr Thr Pro Lys Val Ile Cys Gly405 410 415Thr Pro Ile Pro Ala Ile Ala Gly Ile Thr Thr Pro Ser Ala Asp Gln420 425 430Val Leu Gly Ser Asp Leu Ala Asn Gln Leu Arg Ser Leu Asp Gly Lys435 440 445Gln Ser Ala Phe Gly Lys Pro Phe Gly Pro Ile Thr Pro Pro450 455 460<210>29<211>2794<212>DNA<213>Scytalidum thermophilum<400>29atgaacagag tcacgaatct cctcgcctgg gccggcgcga tagggctcgc ccaagcaaca 60tgtccctttg cggaccctgc cgctctgtat agtcgtcaag atactaccag cggccagtcg 120ccacttgcag catacgaggt ggatgacagc accggatacc tgacctccga tgttggcggg 180cccattcagg accagaccag cctcaaggca ggcatccggg gtccgaccct tcttgaggac 240tttatgttcc gccagaagat ccagcacttc gaccatgaac gggtaaggac ataatgctca 300cacgagcggc tgcgtgccca cctatttccg agacattggg ctggctggct ggctgtgact 360gcttgagttt ggggacatac ggagtacctt actgacgcgc tgaaccactc caggttcccg 420aaagggcggt ccatgctcga ggcgctggag cacacgggac cttcacgagt tacgccgact 480ggagtaacat caccgcggcg tcctttctga acgccactgg aaagcagacg ccggtgtttg 540tccggttctc gaccgttgct gggtctcgag ggagcgcaga cacggcgaga gacgttcatg 600gtttcgcgac gcggtttgta agttttgttg tgtttcattc gttccggtct gtagaggagg 660gttaggatat gagctaacgt gtgtgtgtgt gtgaagtaca ctgatgaagg caactttgta 720cgtcccacgc atggtcctca attctcttat ctggcagcca tgtggtcatt gtcgacgttg 780ctaacttgcg taggatatcg tcggaaacaa catcccggta ttcttcattc aagatgcaat 840ccagttccct gaccttatcc actcggtcaa gccgcgtccc gacaacgaga ttccccaagc 900ggcgacggct catgattcag cttgggactt cttcagccag cagccaagca ccatggtaag 960caatggacca aggagccgca cctggggtga catgccaggg agtacacaag gcgttccgat1020gaccctcgtg tgaccaaggc agtacaacac tccacggagg actcgaagag attcggcaat1080atggaacaca gaactgacag gatggtagca cacgttgttc tgggccatgt ccggccacgg1140aatccctcgc agctaccgcc atatggtacg tttgcctggc tgagatgacc gtgaatccat1200ttctaacctc aagcccagga tggcttcggc gtccacacgt tccggtttgt caaagatgac1260ggctcgtcca agttgatcaa gtggcatttc aagtcacgcc agggaaaggc gagtctagtc1320
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Asp Ser Thr Gly Tyr Leu Thr Ser Asp Val Gly Gly Pro Ile Gln Asp50 55 60Gln Thr Ser Leu Lys Ala Gly Ile Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp65 70 75 80Phe Met Phe Arg Gln Lys Ile Gln His Phe Asp His Glu Arg Val Pro85 90 95Glu Arg Ala Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala His Gly Thr Phe Thr100 105 110Ser Tyr Ala Asp Trp Ser Asn Ile Thr Ala Ala Ser Phe Leu Asn Ala115 120 125Thr Gly Lys Gln Thr Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Ala Gly130 135 140Ser Arg Gly Ser Ala Asp Thr Ala Arg Asp Val His Gly Phe Ala Thr145 150 155 160Arg Phe Tyr Thr Asp Glu Gly Asn Phe Asp Ile Val Gly Asn Asn Ile165 170 175Pro Val Phe Phe Ile Gln Asp Ala Ile Gln Phe Pro Asp Leu Ile His180 185 190Ser Val Lys Pro Arg Pro Asp Asn Glu Ile Pro Gln Ala Ala Thr Ala195 200 205His Asp Ser Ala Trp Asp Phe Phe Ser Gln Gln Pro Ser Thr Met His210 215 220Thr Leu Phe Trp Ala Met Ser Gly His Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg225 230 235 240His Met Asp Gly Phe Gly Val His Thr Phe Arg Phe Val Lys Asp Asp245 250 255Gly Ser Ser Lys Leu Ile Lys Trp His Phe Lys Ser Arg Gln Gly Lys260 265 270Ala Ser Leu Val Trp Glu Glu Ala Gln Val Leu Ser Gly Lys Asn Ala275 280 285Asp Phe His Arg Gln Asp Leu Trp Asp Ala Ile Glu Ser Gly Asn Gly290 295 300Pro Glu Trp Asp Val Cys Val Gln Ile Val Asp Glu Ser Gln Ala Gln305 310 315 320
Ala Phe Gly Phe Asp Leu Leu Asp Pro Thr Lys Ile Ile Pro Glu Glu325 330 335Tyr Ala Pro Leu Thr Lys Leu Gly Leu Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro340 345 350Thr Asn Tyr Phe Ala Glu Thr Glu Gln Val Met Phe Gln Pro Gly His355 360 365Ile Val Arg Gly Ile Asp Phe Thr Glu Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg370 375 380Leu Phe Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Leu Asn Arg Asn Gly Gly Pro Asn385 390 395 400Phe Glu Gln Leu Pro Ile Asn Met Pro Arg Val Pro Ile His Asn Asn405 410 415Asn Arg Asp Gly Ala Gly Gln Met Phe Ile His Arg Asn Lys Tyr Pro420 425 430Tyr Thr Pro Asn Thr Leu Asn Ser Gly Tyr Pro Arg Gln Ala Asn Gln435 440 445Asn Ala Gly Arg Gly Phe Phe Thr Ala Pro Gly Arg Thr Ala Ser Gly450 455 460Ala Leu Val Arg Glu Val Ser Pro Thr Phe Asn Asp His Trp Ser Gln465 470 475 480Pro Arg Leu Phe Phe Asn Ser Leu Thr Pro Val Glu Gln Gln Phe Leu485 490 495Val Asn Ala Met Arg Phe Glu Ile Ser Leu Val Lys Ser Glu Glu Val500 505 510Lys Lys Asn Val Leu Thr Gln Leu Asn Arg Val Ser His Asp Val Ala515 520 525Val Arg Val Ala Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Pro Asp Ala Asp Asp530 535 540Thr Tyr Tyr His Asn Asn Lys Thr Ala Gly Val Ser Ile Val Gly Ser545 550 555 560Gly Pro Leu Pro Thr Ile Lys Thr Leu Arg Val Gly Ile Leu Ala Thr565 570 575Thr Ser Glu Ser Ser Ala Leu Asp Gln Ala Ala Gln Leu Arg Thr Arg580 585 590
Leu Glu Lys Asp Gly Leu Val Val Thr Val Val Ala Glu Thr Leu Arg595 600 605Glu Gly Val Asp Gln Thr Tyr Ser Thr Ala Asp Ala Thr Gly Phe Asp610 615 620Gly Val Val Val Val Asp Gly Ala Ala Ala Leu Phe Ala Ser Thr Ala625 630 635 640Ser Ser Pro Leu Phe Pro Thr Gly Arg Pro Leu Gln Ile Phe Val Asp645 650 655Ala Tyr Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Val Cys Gly Gly Lys Ser Ser660 665 670Glu Val Leu Asp Ala Ala Asp Val Pro Glu Asp Gly Asp Gly Val Tyr675 680 685Ser Glu Glu Ser Val Asp Met Phe Val Glu Glu Phe Glu Lys Gly Leu690 695 700Ala Thr Phe Arg Phe Thr Asp Arg Phe Ala Leu Asp Ser705 710 71权利要求
1.一种生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉菌株的突变体，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，以及(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。
2.权利要求1的方法，其中至少一个基因是asa。
3.权利要求1的方法，其中至少一个基因是amyA。
4.权利要求1的方法，其中至少一个基因是amyB。
5.权利要求1的方法，其中至少一个基因是prtT。
6.权利要求1的方法，其中至少一个基因是oah。
7.权利要求1-6中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是生物聚合物。
8.权利要求7的方法，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
9.权利要求8的方法，其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。
10.权利要求9的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。
11.权利要求8的方法，其中多糖是壳多糖、肝素、或透明质酸。
12.权利要求1-6中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是代谢产物。
13.权利要求1的方法，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代谢途径。
14.权利要求1-13中任何的方法，其中突变菌株包括至少2个拷贝的编码生物物质的第一核苷酸序列。
15.权利要求1-14中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，突变菌株生产至少减少25％的葡糖淀粉酶和选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一种或多种酶。
16.权利要求1-14中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株完全缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。
17.权利要求1-16中任何的方法，其中该突变菌株进一步包括编码蛋白质分解活性的一种或多种基因的变体。
18.权利要求17的方法，其中蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。
19.权利要求1-17中任何的方法，其中突变菌株进一步包括编码选自糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、α-1，6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。
20.一种亲本黑曲霉菌株的突变株，包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT和oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。
21.权利要求20的突变菌株，其中至少一个基因是asa。
22.权利要求20的突变菌株，其中至少一个基因是amyA。
23.权利要求20的突变菌株，其中至少一个基因是amyB。
24.权利要求20的突变菌株，其中至少一个基因是prtT。
25.权利要求20的突变菌株，其中至少一个基因是oah。
26.权利要求20-25中任何的突变菌株，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是生物聚合物。
27.权利要求26的突变菌株，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
28.权利要求27的突变菌株，其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、或转录因子。
29.权利要求28的突变菌株，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。
30.权利要求20-25中任何的突变菌株，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是代谢产物。
31.权利要求20的突变菌株，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代谢途径。
32.权利要求20-31中任何的突变菌株，其包括至少2个拷贝的编码生物物质的第一核苷酸序列。
33.权利要求20-32中任何的突变菌株，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，其生产至少减少25％的葡糖淀粉酶和选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一种或多种酶。
34.权利要求20-32中任何权利要求的突变菌株，当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，其完全缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶。
35.权利要求20-34中任何的突变菌株，其进一步包括编码蛋白质分解活性的一种或多种基因的变体。
36.权利要求35的突变菌株，其中蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。
37.权利要求20-36中任何的突变菌株，其进一步包括编码选自糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、α-1，6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。
38.一种用于获得亲本黑曲霉菌株的突变株的方法，包括(a)将编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列导入亲本黑曲霉菌株；以及(b)鉴定来自步骤(a)的包括改变的核苷酸序列的突变菌株，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产。
39.权利要求38的方法，其中至少一个基因是asa。
40.权利要求38的方法，其中至少一个基因是amyA。
41.权利要求38的方法，其中至少一个基因是amyB。
42.权利要求38的方法，其中至少一个基因是prtT。
43.权利要求38的方法，其中至少一个基因是oah。
44.权利要求38-43中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是生物聚合物。
45.权利要求44的方法，其中生物聚合物选自核酸、聚酰胺、多胺、多元醇、多肽或多糖。
46.权利要求45的方法，其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白、和转录因子。
47.权利要求46的方法，其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、或连接酶。
48.权利要求45的方法，其中多糖是壳多糖、肝素、或透明质酸。
49.权利要求38-43中任何的方法，其中由第一核苷酸序列编码的生物物质是代谢产物。
50.权利要求38的方法，其中第一核苷酸序列包括生物合成或代谢途径。
51.权利要求38-50中任何的方法，其中突变菌株包括至少2个拷贝的编码生物物质的第一核苷酸序列。
52.权利要求38-51中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株生产至少减少25％的葡糖淀粉酶和选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一种或多种酶。
53.权利要求38-51中任何的方法，其中当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株完全缺乏葡糖淀粉酶和选自酸稳定的α-淀粉酶、中性α-淀粉酶A、或中性α-淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的一种或多种酶。
54.权利要求38-53中任何的方法，其中该突变菌株进一步包括编码蛋白质分解活性的一种或多种基因的变体。
55.权利要求54的方法，其中蛋白质分解活性选自氨肽酶、二肽基氨肽酶、三肽基氨肽酶、羧肽酶、曲霉胃蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或液泡蛋白酶。
56.权利要求38-55中任何的方法，其中突变菌株进一步包括编码选自糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转移酶、α-1，6-转葡糖苷酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶的酶的一种或多种基因的变体。
全文摘要
本发明涉及生产异源生物物质的方法，包括(a)在适于生产异源生物物质的培养基中培养亲本黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的突变株，其中(i)该突变菌株包括编码异源生物物质的第一核苷酸序列和包括glaA和至少一个选自asa、amyA、amyB、prtT或oah的基因变体的一种或多种第二核苷酸序列，和(ii)当在相同条件下培养时与亲本黑曲霉菌株相比，该突变菌株缺乏葡糖淀粉酶和至少一个选自酸稳定的α－淀粉酶、中性α－淀粉酶A、或中性α－淀粉酶B、蛋白酶、或草酸水解酶的酶的生产；以及(b)从培养基回收异源的生物物质。
文档编号C12N1/14GK1798848SQ200480015112
公开日2006年7月5日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年3月31日
发明者玛丽亚·康奈利, 霍华德·布罗迪 申请人:诺维信股份有限公司