使用绳状青霉菌imi378536酶的生物增碳剂制备的制作方法

专利名称：使用绳状青霉菌imi378536酶的生物增碳剂制备的制作方法
使用绳状青霉菌IMI378536酶的生物增碳剂制备本发明涉及通过绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)获得的酶混合物的用于 生物乙醇制造的生物量的酶促糖化作用。所述绳状青霉菌根据布达佩斯条约保藏在国际真 菌研究所(International Mycological Institute)，保藏号 IMI 378536。本发明尤其涉及生物乙醇制造的生物量处理方法，所述方法使用纤维素酶、β _葡 聚糖酶、纤维素二糖水解酶、β -葡糖苷酶和可选地木聚糖酶。可再生木质纤维素(lingocellulosic)生物量至乙醇的生物转化作为获得液体 燃料的可选方案已经在最近的十多年里被广泛的研究。生物乙醇制造的成本十分高而产能却很低，人们进行持续的研究以使该方法更加 经济。酶法水解被认为是将纤维质生物量转化为可发酵糖的最有发展前景的技术。酶促步 骤的成本是该方法的主要经济因素之一。人们致力于提高纤维素材料的酶法水解的效率。Vidmantiene等(2006)描述了将多糖水解为谷类衍生废物的方法以产生适于发 酵为乙醇的糖原料，其中使用两种酶制剂，第一种酶制剂用于淀粉水解和糖化作用，其包括 来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)的α -淀粉酶和β -葡聚糖酶。此步骤在65°C 下持续90分钟。第二种酶制剂包括来自泡盛曲酶(Aspergillus awamori)的葡糖淀粉酶、 α -淀粉酶和β -葡聚糖酶和β -木聚糖酶、纤维素酶和来自木霉菌(Trichoderma reesei) 的β -葡聚糖酶，该第二种酶制剂在55-60°C使用持续120分钟。Ohgren等(2006)表示预水解处理对整体的乙醇产量没有负面作用，所述预处理 或者在48°C下用补充有β -葡糖苷酶的市售纤维素酶混合物或者用在55°C下的热活性酶 的培育组合物来进行，所述培育组合物包括来自嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus) 的改性的纤维二糖水解酶、来自嗜热毛壳菌(Acremonium thermophilum)的葡聚糖内切酶、 来自嗜热子囊菌(T. auriantiacus)的β -葡糖苷酶和木聚糖酶蛋白质。Tabka等(2006)描述了真菌木质纤维素酶类将木质纤维生物量转化为用于发酵 糖类的用途的改良条件，该发酵糖类用于生物乙醇的制造。用稀释的硫酸预处理麦秸，随后 蒸汽蒸馏。源于不同真菌的酶之间的协同效应显现纤维素酶、来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶和来自黑曲霉菌(Aspergillus niger)阿魏酸酯酶，以严格的酶浓度 (10U/g纤维素酶、3U/g木聚糖酶和10U/g的阿魏酸酯酶)进行。通过将温度从37°C提高到 50 0C来增加酶法水解的产量。需要降解纤维素基质的新方法，尤其木质纤维素基质，且需要新的酶和酶混合物， 他们能够提高降解的效率。还需要在低温下操作的方法和酶，能够使用高生物量一致性并 导致高糖和高乙醇浓度。本方法可以显著节能并减少投资成本。本发明致力于达到以上需 求。本发明涉及使用来自特定的非遗传修饰的绳状青霉菌的至少一种酶混合物进行 生物量处理的方法，所述绳状青霉菌保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI 378536，其包括提 供生物量的步骤，并随后在上文描述的条件下将所述生物量与酶混合物接触，其中发生所 述生物量的糖化作用。根据本发明，从单独的真菌类的绳状青霉菌(根据布达佩斯条约保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI 378536)获得的酶混合物在欧洲专利申请No. 1007743中描述，其内容 以引用的方式并入本文。根据EP1007743的描述，以上所述的绳状青霉菌由保藏的菌株发酵而得，所述发 酵首先在27°C至36°C之间的孵化温度下，种子培养基中(优选由以下组成(重量)玉米 浆至4%，恰好防止发泡的止泡剂，加水至100%，在培养基灭菌之前，加入足以将pH调 整到约pH3. 0到约pH6. 0的NaOH)。产物培养基优选地具有如下组成(重量)玉米浆0至4.0%，分批处理和给料 纤维素0. 8至14 %，钙盐0至0. 8 %，硫酸铵0至1. 0 %，恰好防止发泡的止泡剂，加水至 100%,在培养基灭菌之前，加入足以将ρΗ调整到约pH3. 0到约pH6. 0的NaOH ；及足以将ρΗ 保持在约3. 0至6. 0的H2SO4,足以将ρΗ保持在约3. 0至6. 0的气体氨或液体氨；产物培养 基在27°C至36 °C之间的孵化温度下使用。在发酵过程期间加入的主要碳源是纤维素；在这些不同的纤维素源当优选使用不 同级别的 ARBOCEL、S0LKAFL0C、CLAROCEL、ALPHACEL 或 FIBRACEL。
发酵期间的ρΗ值优选通过添加硫酸或其他酸、及气体氨或液体氨或另外的碱来 控制。在发酵时间结束时，通过固体-液体分离方法去除固体，所述分离方法诸如过滤 或离心，液相被收集并离心，例如通过有机膜或矿物质膜上的超过滤。根据本发明，可以用分离的纯酶制剂的形式或粗制酶制剂的形式提供酶混合物， 所述粗制酶制剂诸如已经生长有绳状青霉菌的培养基。所述纯酶制剂以商品名Rovabio LC市售。本发明的酶混合物可以用另外的纯的或粗制的酶制剂(诸如木聚糖酶)来补充。根据本发明的生物量是指或的或刚刚死亡的植物材料，其可以用作燃料或其工业 上的制造。生物量包括碳水化合物和非碳水化合物材料。碳水化合物可以被细分为纤维素、 β _1，4连接的葡萄糖部分的线型聚合物、及半纤维素、复合的支化聚合物——其包括β-1， 4连接的木糖的主链及树胶醛糖、半乳糖、甘露糖和葡糖醛酸支链。有时，木糖可以被乙酰化 为半纤维素链或至木质素，树胶醛糖可以包含阿魏酸或桂皮酸酯。生物量的最后主要成分 是木质素，一种高度交联的类苯基丙烷结构。本发明的方法可以用木质纤维素生物量的主要成分实施，或者包含生物素(木质 纤维素生物量还包括木质素)的任何组合物，如种子、谷物、块茎、植物废物或食品加工或 工业加工的或产品(例如茎杆)、玉米(包括玉米棒、秸秆等)、草、木材(包括木片、加工废 物)、纸、纸浆、回收纸(例如报纸)。在一个特定的方面，本发明的酶混合物用于水解纤维 素，所述纤维素包括β_1，4-连接的葡萄糖部分的线型链。但是在优选的实施方式中，麦 秸、麦麸、大麻纤维、或剥皮大麻的茎被用作生物量。根据本发明处理的生物量包括由绳状青霉菌获得的酶混合物。根据布达佩斯条 约，所述绳状青霉菌保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI378536。其中，酶混合物包括至少木 聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、纤维素酶、果胶酶和阿魏酸酯酶，且 所述酶混合物能够根据以上所述的方法获得。在另外一个方面，根据本发明的方法可以包括在与至少一种酶混合物接触之前的 生物量的预处理步骤。此预处理步骤致力于增加表面积和生物量与酶的可接触性。预处理步骤可以是化学性质的，诸如将生物量放置在98°C的硫酸水浴中，硫酸浓度为3g/升；或者预处理步骤可以是机械性质的，诸如破碎所述生物量。本发明的另外一个方面涉及制造生物乙醇的方法，其包括如下步骤提供由绳状 青霉菌获得的至少一种酶混合物，所述绳状青霉菌根据布达佩斯条约保藏在国际真菌研究 所，保藏号IMI 378536 ；提供生物量，在生物量的糖化作用发生的条件下使所述生物量与 酶混合物接触；发酵所述糖化作用的产物。在本发明的特定的实施方式中，所述液体片段根 据糖化作用分离，所述分离可以通过离心培养基来制备，所述培养基包括生物量和酶混合 物。由绳状青霉菌获得的所述酶混合物，根据布达佩斯条约保藏在国际真菌研究所， 保藏号IMI 378536，所述酶混合物可以用作生物量的糖化作用。


图1 使用Rovabio LC的纤维素消化性A.用100 μ 1 Rovabio LC/g底物进行水解，在37°C下，分别持续24、48、72和96
小时。纤维素水解的百分比通过干物质称重确定。B.糖的量由水解上清液的HPLC分析来测定。此图表显示在纤维素水解期间所释 放的各种不同的糖的量。Ml 在温和条件下的各种木质纤维素底物的水解A. 100 μ 1 Rovabio LC/g底物进行麦秸和麦麸的水解。在28°C下进行72小时孵 化。B.此图表显示所有底物释放的葡萄糖，且主要来自麦麸(0. 094g/g的初始S)。Ml 酶浓度对水解麦秸和麦麸的作用所述水解在在28°C下孵化72小时。A.麦秸和麦麸的水解的变化作为酶浓度的函数。B.所释放的葡萄糖的量作为酶浓度的函数。图4 由麦麸释放的葡萄糖的量作为Rovabio LC浓度和水解时间的函数释放的 葡萄糖的量的最大值是0.094g/g Si, 100 μ 1 Rovabio LC/g底物在28°C下作用72小时。S5 温度对麦麸水解的作用用100 μ 1 Rovabio LC/g底物进行麦麸水解A.生物量的水解变化作为温度和时间的函数。B.葡萄糖释放量的变化作为温度和水解持续时间的函数。M6 用稀释酸进行的预处理对麦秸和麦麸水解的影响所述底物在50ml的3%的硫酸中，在98°C下孵化20分钟，随后用100ml的超纯水 进行漂洗。在37°C下，用100 μ 1 Rovabio LC/g底物对两种底物(A)进行水解。预处理 促进底物水解，但是对葡萄糖(B)的释放有相反作用。Ml 用木聚糖酶水解麦麸绳状青霉菌木聚糖酶B在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，木聚糖酶 C在解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达。木聚糖酶浓度使得木聚糖酶活性与包 含在200 μ 1 Rovabio LC的活性。Rov.-Xyn B是一种混合物，其中50%的木聚糖酶活性 来自Rovabio LC,另一半由木聚糖酶B来提供(同理，对于Rov. -Xyn C混合物，其中XynC是木聚糖酶C)。麦麸水解在37°C下进行72小时。A.用各种酶进行麦麸水解的比较。B.用各种酶从麦麸释放的木糖和葡萄糖。
实施例实施例1 材料和方法1.酶和底物Rovabio LC是来自绳状青霉菌(根据布达佩斯条约保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI 378536)的酶混合物，其主要的已知活性是纤维素酶、木聚糖酶和β _葡聚糖酶活 性。还对绳状青霉菌木聚糖酶进行测试。在巴斯德毕赤酵母菌中克隆的绳状青霉菌的 木聚糖酶B和在解脂耶氏酵母中克隆的绳状青霉菌木聚糖酶C。绳状青霉菌发酵果汁也被使用。因为Rovabio LC是发酵产物，因此需要测试粗 制酶混合物的水解能力。所选择的底物是最佳质量的麦秸(Val Agro，批次37600205113)、麦麸(源头未 知)、麦秸(源头未知)和纤维素(JRS, Arbocel批次1600680121)。2.底物制备对于被研究的两种底物，混合步骤是必要的以便优化酶与底物的接触性。它们是 最佳质量的麦秸和麦麸。使用搅拌器进行分解，最终的颗粒尺寸是厘米数量级。在随后的步骤中，所有的底物被等同地处理。所述底物被称出并放置到锥形瓶当 中，随后添加50ml的0. IM醋酸盐缓冲液(pH 5. 4)。所述锥形瓶随后在121°C下加压灭菌 20分钟。3.化学预处理与温和条件下实施的试验相平行，麦秸和麦麸进行化学预处理。预处理的目标是 改变生物量的物理结构和分离各种片段以便使得纤维素更易于接近所述酶，这将能够将其 转化为可发酵糖。这些底物与20ml的浓度3g/l的硫酸相接触，随后在98°C下水浴中孵化 20分钟。它们随后用100ml的超纯水洗涤。洗涤水被去除且预处理底物随后使用与处理其 他底物相同的方式处理，即添加醋酸盐并随后进行高压蒸汽灭菌。4.酶法水解锥形瓶冷却到室温后，酶溶液在灭菌条件下被添加到锥形瓶中。每种条件被测试 两次，对照被整合到每个测试中。所述对照包括不含有酶的锥形瓶。测试不同浓度的酶以 便确定酶量/底物量的比率，这是最有效的，即最可能的比率。对包含除Rovabio LC之外 的酶的测试，测定所使用的量，使纤维素和/或木聚糖酶活性与Rovabio LC的活性相同。锥形瓶随后孵化24、48或72小时，并在给定温度下以150rpm搅拌。在不同的测 试期间，被测试的温度分别是28、30和37°C。5.可溶解和不可溶解片段的分离孵化后，不同样本的可溶解片段通过4°C下IOOOOg力持续离心15分钟来回收。等 分上清液并在_20°C下保存以便随后通过HPLC分析。至于片剂，首先用50ml水洗涤，随后 用40ml水再次洗涤。每次洗涤后，片剂通过离心(之前的相同条件)回收且洗涤的上清液也被等分以便通过HPLC分析。此外，为了估计转化为底物的可溶性糖的百分比，片剂在120°C下干燥24小时， 随后称重。水解后保留的可溶性生物量的百分比等于(保留的干物质/初始的干物 质)X 100。为了确定初始干物质，不依赖于水解测试，每种底物被称重且在121°C下干燥24 小时。因此，新鲜底物和干物质之间的质量差使得我们能够确定包含在生物量中的湿度百 分比。随后能够将湿度百分比施用到每次新鲜底物称重以便确定其干质量。6.上清液的HPLC分析 为了测定可溶性片段的糖组合物，离心上清液以及洗涤上清液使用HPLC(Agilent 1100)进行分析。层析系统包括等度抽运系统、样本转换器、前置柱(Bio-Rad， Micro-Guard Carbo P)、Aminex HPX-87P 柱(Bi0-Rad)、RID (示差折光检测)检测 器或折射计和数据采集和处理系统。注射到层析住中之前，4°C下用I6i00g力离心处理上 清液30分钟以便使杂质成球。其随后通过0. 45 μ m纤维素薄膜过滤。分析条件如下色谱 法在80°C下进行，移动相是超纯水，流速0. 6ml/分钟，注射20 μ 1样本，随后用100 μ 1水 洗涤。样本组分通过他们保留时间来鉴定，通过预先确定的校准范围。此范围由4种糖组 成，所述糖的浓度范围在0. 5g/l到25g/l之间。用于校准范围的糖是纤维二糖、D-葡萄糖、 D-木糖和L-阿拉伯糖。它们是主要在木质纤维素生物量的水解期间主要释放的糖。7.纤维素酶和木聚糖酶活性的分析酶活性通过3，5- 二硝基水杨酸(DNS)测定方法(G. L. Miller, 1959)来测量。纤 维素酶和木聚糖酶活性的单位限定为在限定的酶促条件下，每分钟和每克产物分别释放 一微摩尔葡萄糖当量或木糖当量所需的酶量，所述限定的酶促条件即，对于纤维素酶活性 是pH5和对于木聚糖酶活性是pH4，温度是50°C。对于纤维素酶活性，测试是根据羧甲基纤维素(CMC)的酶水解进行的，其是通过 β -1，4连接的葡萄糖聚合物。酶法水解释放葡萄糖单体，其浓度在比色测定反应结束时测 定，并使用葡萄糖标准曲线，其吸光度在540nm下测定。酶的稀释液在超纯水中制造。每个 样本测定两次以便获得平均活性且对照也被制备。1.75ml底物(1.5%w/v CMC)置于试管 中，随后在50°C下在水浴中孵化5分钟。反应随后通过加入250 μ 1的酶稀释物触发，对照 管中无此操作。随后严格的10分钟后通过添加2ml 1%。(w/v)的DNS使其停止，温度仍旧 是50°C。在此阶段，从水浴中移出试管，250 μ 1的酶稀释剂被添加到对照管中，随后所有的 管被停止反应并转移到95°C的第二水浴中持续5分钟(严格)。通过释放葡萄糖，此步骤 使DNS (橙色染色)分解为3-氨基-5-硝基水杨酸(橙-红显色)。试管随后置于冷水浴 中以便使其回复到室温。最后，通过加入IOml水进行另外的稀释，吸光度在540nm读取。对于木聚糖酶活性，含量测定原则相同。因为底物是1.5% (w/v)桦木的木聚糖， 酶法水解释放木糖单体，其对于纤维素酶活性具有与葡糖糖相同的水解作用。另一方面，用 木糖制备标准范围。实施例2 通过使用Rovabiolg LC进行简单底物转化的评价纤维素我们使用的市售纤维素实际上是纯纤维素和半纤维素的混合物。纤维素是β_1， 4连接的D-葡萄糖。利用Rovabio LC的纤维素酶活性(内-1，4_ β -葡聚糖酶、纤维二 糖水解酶和β “葡糖苷酶)，Rovabio LC因此将纤维素水解并释放葡萄糖单体，在生物乙 醇合成的基础上。半纤维素是D-木糖单体(β_1，4连接)聚合物，并支化不同的糖，例如甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖等。其还通过Rovabio LC水解，利用Rovabio LC的木聚糖酶 活性(内-1，4-β-木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖酶等)。
因为纤维素是99. 5%纯的(根据供应商)，因此可以评估Rovabio LC的在试验 条件下的最大水解能力(主要是其纤维素酶活性还有木聚糖酶活性)，其接近于生物量转 化试验而不是酶活性试验。为了评估纤维素转化为可溶性糖的产量，我们使用两种方法作 为基础。第一种方法包括称重干物质；第二种方法使得我们能够通过水解和洗涤上清液的 HPLC分析释放的糖的量和性质。对于此底物，在100 μ Ι/g底物的Rovabio LC浓度进行所述酶法水解，温度37°C。 在24和96小时之间监测孵化期。1.干物质水解产量通过反应后保留的干生物量百分比来估算。由于纤维素是简单聚合物，与余其他被研究的生物量不同，其水解程度是最大 的，即应当接近90-99%的范围，并且非常必定在相对短的时间内，如已经对酶复合物 Accelerase 1000 (技术公告 No. 1，Genencor)所观察到的。但是，如在图IA中所示，纤维素水解在96小时后仅到达27. 3%。实际上，水解后， 回收大约70%的不溶性片段。根据水解条件和底物性质，这个结果是令人惊讶的。对于这样 的结果的一种解释是水解条件过于温和(温度、PH等)，或相对于底物的量酶浓度过低，或 者相反地是由于通过纤维素二糖水解酶释放的纤维素二糖抑制某些纤维素酶(Valjamie P.等，2001)。为了核实此假设，上清液的HPLC分析的结果应该被检验。2.释放的糖的分析因为纤维素是99. 5%纯的，我们可以期望所水解的28%对应为葡萄糖、数量稍 少的纤维二糖、源自半纤维素片段的木糖。图IB显示在纤维素水解期间释放的各种不同的 糖。所释放的木糖的量达到0. 08g/g的初始固体(Si)，即从IOOg纤维素释放8g木糖。至于释放的葡萄糖，在96小时后，释放0.225g/g Si。此结果与以上所述干物质的 差相一致。实际上，纤维素的可溶型水解是28%，其以葡萄糖(22.5%)和木糖(8%)为形 式。逻辑上，从纤维素释放的葡萄糖的量应当代表使用Rovabio LC水解木质纤维素生物 量期间所能够释放的最大量。最后上清液分析还显示存在纤维二糖。该纤维二糖利用酶合剂的纤维二糖水解酶 活性而从纤维素释放出来。纤维素二糖的浓度是恒定的且在24和96小时之间相对低的 (大约0.026g/g Si)。因此不存在底物抑制，否则纤维二糖浓度将随着水解时间增加，而葡 萄糖浓度保持恒定。因此，低水平纤维素水解可能是由于酶浓度不足或由于水解条件过于 温和。但是，我们选择在相对温和的条件下进行试验，与那些在现在工业上实施的条件相比 较。这种选择受到在相对便宜条件下Rovabio LC有效性的需要的引导。因此，随后在复 杂生物量上进行的测试在初始设置的条件下进行。实施例3 在温和条件下进行的各种生物量的水解在随后的试验中，测试的底物量是2g，Rovabio LC的浓度是100 μ 1/g底物，水解 条件如下28°C下持续水解72小时。生物量水解结果在图2A中显示，HPLC分析结果在图 2B中显示。1.小麦
在法国，小麦是最广泛用于生物乙醇生产中的一种底物。其也是能够得到最好结 果的Rovabio LC水解产量的底物。我们研究它的两种形式麦秸和麦麸。 1. 1 麦秸麦秸由以下成份组成33%至43%的纤维素，20%至25%的半纤维素和15%至 20%之间的木质素(IFP源，2007)。因为标准尺寸过大，通过搅拌将其分解。最终颗粒尺寸 在厘米数量级。酶法水解后，回收的不溶性生物量的数量是80%，从对照回收的量是90%。水解 因此导致生物量减少11. 2%。至于上清液的HPLC分析，这种底物观察到用于我们的校准范围的四种糖的释 放。存在少量(0.005g/g Si)纤维二糖，其表示可能通过葡糖苷酶的有效水解。阿拉 伯糖也被检测到，不过是痕量，同样地木糖的释放浓度是0.009g/g Sio这两种糖的存在是 Rovabio LC的半纤维素酶活性(特别是内-1，4_β-木聚糖酶、α-阿拉伯呋喃糖酶和 β-木糖苷酶)的特征。水解期间释放的葡萄糖的量是0.034g/g Sio即使其是主要在这 些水解条件下释放的糖，其浓度保持过低以将麦秸设计为生物乙醇合成的基本底物。不管是否被混合麦秸保持为原料。但是酶法水解通过使用所述底物促进，所述底 物表面积小而且木质素比例低，其中纤维素结晶性低。麦麸是具有这些特征的底物。1. 2 麦麸难于精确地确定麦麸的每种组分的比例，因此这种组合物根据小麦的源和根据所 述小麦的制粉而不同，并且根据所使用分析的方法而有所不同。但是，其含有平均在3%和 7%之间的木质素(Schwartz等，1988)且其可溶性糖组合物显示为如下2. 的半乳糖、 23. 7%的阿拉伯糖、29. 的葡萄糖和43. 7%的木糖(Benamrouche等，2002)。在测试的过程中，麦麸是显示了酶法水解的最佳特性的底物。具体地，在水解后观 察到生物量减少32. 5%。此外，上清液的HPLC分析显示可溶性片段由以下组成0. 048g纤 维二糖/g Si ;0.034g阿拉伯糖/g Si ;0.076g木糖/g Si和0. 094g葡萄糖/g S”因此，在 温和水解条件下，量为大约10%的水解底物以葡萄糖形式释放。我们获得的可溶性糖的比 例与Benamrouche等人预测的那些并不相似，因此另一方面，酶法水解可能不完全，另一方 面，麦麸的糖组合物可以显著地根据其源头和麦粉的磨粉而有所不同。对于释放葡萄糖，麦麸显示为一种理想的底物。这些第一试验在相对温和的水解条件下进行(28°C持续72小时，酶浓度100 μ 1/g 底物)。实施例4 水解条件的优化这种优化包括3个必要因素酶浓度、水解温度和化学预处理以便提高底物和酶 的可接触性。1.酶浓度的效果为了增加从底物释放的葡萄糖，符合逻辑的推理是增加酶浓度。但是至今，生物燃 料发展的主要障碍是用于木质纤维素生物量的糖化作用步骤总所使用的酶的成本。出于这 个原因，必要的是限制酶浓度。我们因此测试酶浓度对两种底物(麦秸和麦麸)的效果，这两种底物在之前的条 件下得出最好的结果。除了所使用的酶的量，分析条件未改变，即在150rpm的搅拌速度下，28°C下孵化72小时。主要感兴趣的是水解的生物量的百分比以及释放的葡萄糖的量。对于麦秸，评估三种浓度浓度40 μ 1 Rovabiο LC/g底物、100 μ IRovabiο LC/ g底物和200 μ 1 Rovabio LC/g底物。根据100 μ 1 R0Vabi0TMLC/g麦秸的浓度获得的结 果，不论处理成本而测试更高的浓度。至于干生物量的水解效果浓度40 μ 1 Rovabio LC/g底物、100 μ IRovabio LC/ g底物和200μ1 Rovabio LC/g底物，分别观察到干生物量减少1. 2%、11. 2%和15% (图 7A)。应当注意Rovabio LC浓度的加倍并不导致相同比例的麦秸水解。正如所期待的，对于200yl/g底物的酶浓度观察到葡萄糖的最大释放量。特别地，对于增加Rovabio LC浓度，分别得到0. 025,0. 034和0. 067g葡萄糖/g Si (图7B)。 在这个例子中，随着酶浓度增加，所释放的葡萄糖的量增加。有利地，应当注意，对于40μ 1 Rovabio LC/g底物的浓度，每100μ IRovabio LC/g底物所释放73%葡萄糖当量。这个 结果显示了使用较少的酶同时保持纤维素酶有效性的可能性。水解还使木糖释放实际等量 于 40 和 100 μ 1/g 底物浓度(分别是 0. 007 和 0. 009g/g Si)，对于 100 μ IRovabio LC/g 底物浓度，是0.018g木糖/g Si。对于麦麸，我们研究四种不同浓度20 μ 1 Rovabio LC/g底物、40 μ IRovabio LC/g底物、50 μ 1 Rovabio LC/g底物和 100 μ 1 Rovabio LC/g底物。Rovabiο LC浓度的 增加对于增加麦麸水解有效果，但是对于麦秸效果并不是按比例的。实际上，递增浓度时， 伴随着获得干生物量减少水解的麦麸为23%、25%、32%和32. 5%。50 μ 1 Rovabio LC/ g底物的浓度因此足以达到最大程度水解。其将显示为对于所使用的水解条件即pH 5.4， 温度28°C，Rovabio LC底物的最大水解不超过约30%。上清液的HPLC分析还显示使用较高酶浓度的益处。实际上，释放的葡萄糖的量 随着被使用进行水解的Rovabio LC浓度而增加。释放的量如下0. 04,0. 058,0. 068和 0.094g的葡萄糖/g Si，分别对于20、40、50和100 μ Ι/g底物的各种RoVabioTMLC浓度(图 3)。重要的是需要注意到，最高RoVabioTMLC浓度所获得的葡萄糖释放的最大量的同时，增 加50%酶浓度，释放葡萄糖仅增加28%。因此，减少所使用的酶量，但不过分减少所释放葡 萄糖的量是可能的。此外，我们还分析使用不同浓度的R0Vabi0TMLC进行水解所得到的上清液，所述水 解持续24、48和72小时(图4)。于是得出若干结论，首先，对于相同的水解时间(24、48或 72小时)，最大量的葡萄糖总是通过最高酶浓度来释放。此外，对于相同的R0Vabi0 LC浓 度，释放的最大量的葡萄糖在72小时后获得。但是，在此之前48小时，出现对应于可释放 葡萄糖的最大量的80%的一个平台。观察到木糖的相同释放分布，72小时水解和100μ 1/ g底物的Rovabi0TMLC浓度获得的Si的0. 076g/g的最大浓度。所有这些结果清楚地确定了这样一个事实可以进行水解，或者以低浓度的 Rovabio LC且经历更长的水解时间，或者用高的酶浓度但是经历较短水解时间。2.温度效应之前的测试在温度28°C下进行，但是这不是R0Vabi0TMLC活性的最佳温度。实际 上，此酶合剂由各种活性组成，通常在50°C下进行测试。此外，R0Vabi0TMLC首先是用于动物 饲料中的一种营养添加剂。其因此必须能够在动物消化道温度(根据不同物种，该温度在 38和41°C之间变化)下显示活性。因此，木质纤维素生物量的水解测试不得不在28°C以上的温度进行。为了评估温度对于用R0Vabi0 LC对木质纤维素生物量进行水解的影响，我们进 行一系列试验，麦麸作为底物，RovabioTMLC浓度为100 μ Ι/g底物，在3种不同温度(28、30 或37°C )下持续24、48和72小时(图5A)。根据之前试验的获得的最佳结果测定底物和 酶浓度。当观察在此试验中水解的生物量的百分 比时，注意到若干令人惊讶之处(图5B)。 首先，不考虑水解时间，在30和37°C的水解之间仅有轻微差别。另一方面，如果他们与在 28°C进行的水解相比较，注意到水解生物量百分比的轻微增加(平均32%、39%和39%的 麦麸在28、30和37°C的温度下水解)。因此，清楚的是在28°C以上的温度促进水解。对于不同酶活性的温度的效果，更特别地观察到对纤维素酶活性的效果。与处理干生物量获得的结果不同，由分析上清液所得结果更加具有一致性。实际 上，所释放葡萄糖的量随着时间增加，在并37°c下进行的试验中达到最大值。具体地，所得 到37°C下水解72小时的最大浓度是0. Ilg葡萄糖/g Si。在此测试中，温度增加为大约 10°C，因此能够使水解葡萄糖量增加14. 5%。至于木糖，释放曲线与葡萄糖释放曲线相似，所释放木糖的最大量是0.096g/g Sit5这是数值上的释放量，因为木糖还可以从生物乙醇生产过程中回收。即使所测试的温度非常相似，释放的可溶性糖的量的增加与水解温度的增加相平 行。由于在R0Vabi0TMLC活性试验中所使用的温度是50°C，因此能够设计在37°C以上再次 优化木质纤维素生物量的水解。尽管需要确定较经济的水解条件，在某些条件下，糖化作用方法的添加步骤是不 可避免的，尤其是当底物具有过高的半纤维素或木质素组合物时。3.化学预处理的效果用于制造生物乙醇的底物是相对原始的并可以在酶法水解之前的预处理。各种类 型的预处理存在，他们所有的目的是提高底物与酶的可接触性，通过减少颗粒尺寸或通过 减少半纤维素和/或纤维素片段。已经开发出许多预处理物理预处理(加压底物)、热预 处理(蒸汽喷发)(MosierN.等，2005)或其他化学(酸的或碱的)预处理。化学预处理到 目前为止是最为广泛应用的，不仅是在实验室条件下，还在工业发展中(Schell D.J.等， 2003)。我们所选择实施的一种是用3%硫酸在98°C的温度下进行的预处理。这些预处理 条件不同于习惯上所用的那些。实际上，预处理在更高的温度(100至200°C)以及低的酸浓 度(相比浓缩的大致稀释六倍)条件下进行(Lloyd Τ. Α.等，2005 ；Wyman C. Ε.等，2005)。 我们之前所见的，麦秸具有高百分比的半纤维素和木质素，他们是纤维素保护层。酸预处理 具有去除半纤维素片段以及改变木质素结构的特性，因此使得纤维素易于接触酶。我们比 较酸预处理对于以上所研究的两种底物(麦秸和麦麸)的有效性，其中麦秸在温和条件下 不能显著水解。经预处理且随后用R0Vabi0TMLC水解的生物量百分比是17. 5%的麦秸水解，未预 处理，且39. 6%的麦麸水解，未预处理，水解达到20% (图6A)。预处理因此显示出对使用 Rovabio LC水解底物的正面效应。另一方面，当处理释放的葡萄糖的量，预处理有效性是较不明显的(图6B)。对于麦秸，释放的葡萄糖的量是0.063g/g Si,即与无预处理水解相比损失30%。最后，对于麦 麸，释放的葡萄糖的量是0.062g/g Si,即与无预处理水解相比少了 34%。随后的结果，明 显的是预处理对从生物量中释放葡萄糖不具有预期的效果。可以提出两种解释或者所述 酸预处理降解纤维素，在该例子中葡萄糖加热后处于酸溶液中，或者是预处理后底物PH过 低，且使R0Vabi0TMLC的纤维素酶活性失活。为了证实这些假定，我们首先在预处理后通过HPLC分析洗涤上清液。该分析未显 示存在任何可溶性糖，纤维素因此不能通过预处理而能够溶解。其次，我们验证在50ml的 PH 5. 4 (水解之前混合)的0. IM醋酸盐缓冲液中的预处理底物pH，PH 5. 4以及在相同缓 冲液中的未预处理底物的PH。预处理混合物的pH是5. 1，未预处理底物的pH是5. 6。我们 因此通过DNS实验方法在pH 5. 1和pH 5. 6测定R0Vabi0 LC的纤维素酶活性，以便确实所 述活性是否受到PH减少的影响(DNS试验通常在pH 5下进行)。观察到的两种试验条件之 间的差别为7%，然而其不能解释预处理对底物的影响，首先是因为活性的差别很小，第二 是因为对于施加到我们试验中的较低的PH值，纤维素酶活性更高。但是，另一种解释是可能使用稀酸预处理可能导致糖的降解，由于PH过于酸性 (Ogier et al.，1999)。这些降解将改变底物，其因此酶将不能够识别这些改变的底物。
到目前为止，我们已经致力于R0Vabi0TMLC在木质纤维素生物量的糖化作用过程 中的特性，其主要目的在于由这些生物量产生葡萄糖。这是因为葡萄糖是到目前为止优选 的制造生物乙醇所使用的生物体底物。但是，能够将葡萄糖和木糖同化为碳源的新的转基 因修饰的生物已经开始使用。因此有利地是研究纯木聚糖酶对木质纤维素底物的效果。此 夕卜，生物乙醇产物必须以较经济的方式实施。目前，R0Vabi0TMLC是配制产品；我们因此还要 研究绳状青霉菌发酵果汁水解木质纤维素底物的能力。实施例5 用木聚糖酶和发酵果汁水解以下试验仅对麦麸进行。分析条件如下37°C下水解(最有效温度)72小时。酶 浓度进行如下定义，对于木聚糖酶，活性相当于200μ lR0Vabi0TMLC，对于发酵果汁，所保持 的纤维素酶活性与200 μ 1 RoVabioTMLC相似。结果在图7中显示。1.木聚糖酶B所需木聚糖酶B的浓度是150 μ Ι/g底物，使其具有与R0Vabi0TMLC相当的活性。 用木聚糖酶B水解后，回收79%的麦麸，其意味着水解达到21%。此外，上清液的HPLC的分析显示存在单糖0.021g木糖/g Si,即在相同水解条件 下比R0Vabi0 LC少4. 6倍。此结果可以通过如下事实来解释，即R0Vabi0 LC是包括各种 活性的酶合剂，它们彼此协同作用，因此有利于复合底物降解为可溶性糖。另一种绳状青霉菌的聚糖酶被过表达其是木聚糖酶C。2.木聚糖酶C用于这些试验中的木聚糖酶C浓度是850 μ Ι/g的底物。仅18%的麦麸在72小时 后用木聚糖酶C水解。看上去木聚糖酶C相比木聚糖酶B对于水解此类型底物是效果较差 的。另一方面，HPLC分析结果是令人惊讶的。具体地，水解上清液中发现痕量木糖 (0. 004g/g Sj)，葡萄糖浓度是0.057g/g Si。释放的木糖的量是较低的，尽管努力保持木聚 糖酶活性与Rovabi0TMLC活性相当。除此之外，如果检验出木聚糖酶，则不期望存在葡萄糖。因此，将存在绳状青霉菌木聚糖酶也具有纤维素酶活性。仅木聚糖酶自身不具有与R0Vabi0TMLC相同的从麦麸中释放木糖的活性，可能是 因为纯木聚糖酶活性不能得益于R0Vabi0TMLC的各种活性的互补性。3. Rovabio 和木聚糖酶协同如下试验包 括用R0Vabi0TMLC提供的50%木聚糖酶活性对麦麸进行酶法水解，余 下的是50%木聚糖酶B或木聚糖酶C。所述反应在37°C下进行72小时。Rovabio LC-木聚糖酶B混合物使得麦麸水解41 %，而R0Vabi0TMLC-木聚糖酶C 混合物使得麦麸水解38%。用R0Vabi0TMLC的水解使得麦麸水解37%。因此整体水解效率 被保持；此处木聚糖酶补充RoVabioTMLC的作用。此外，通过R0Vabi0TMLC和木聚糖酶B的联合作用，获得释放的0. 12g葡萄糖和 0. 095g的木糖/g Si。Rovabio LC-木聚糖酶C混合物部分地使得释放0. 136g葡萄糖/g Si和0.07g的木糖/g Si。这些结果比那些水解麦麸或单独使用R0Vabi0TMLC那些要好，因 此确定了 Rovabi0TMLC复合体的各种酶之间的相互作用的重要性。研究用木聚糖酶水解麦麸以后，一个测试留待去执行对于木质纤维素底物酶法水 解的此项研究用发酵果汁水解麦麸。4.发酵果汁因此我们分析了用587μ 1的绳状青霉菌发酵果汁水解麦麸，在37°C和72小时的 条件下。这个测试使用的发酵果汁对应于在在4°C下用ISOOg力离心的发酵上清液。获得44%水解的麦麸，这表明与其他测试的整个过程相比本质上更大程度的水 解。上清液得出0. 129g葡萄糖/g Si和0. 106g木糖/g Si。再次，所释放的葡萄糖和木糖 的量略大于通过使用RoVabioTMLC水解麦麸所获得量。参考文献Benamrouche S, Cronier D, Debeire P, Chabbert B. (2002). A chemical and histological studyon the effect of(1 — 4)- β-endo-xylanase treatment on wheat bran. Journal of cereal science,36 (2) :253_260.Lloyd TA，Wyman C E. (2005). Total Sugar Yields for Pretreatment by HemicelluloseHydrolysis Coupled with Enzymatic Hydrolysis of the Remaining Solids. BioresourceTechnology,96(18) : 1967-1977，2005.Miller G. L. (1959) . Use of dinitrosal icy 1 ic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, vol. 31,p.426-428.Mosier N,ffyman C,Dale B,Elander R，Lee YY,Holtzapple M,Ladisch M. (2005 a). Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass.Bioresourcetechnology, 96(6) :673_86.Mosier N, Hendrickson R, Ho N, Sedlak M, Ladisch MR. (2005b). Optimization of pHcontrolled liquid hot water pretreatment of corn stover.Bioresource technology,96(18) 1986-93.Ohgren K, Vehmaanrera J Siika-Aho M, Galbe M, Viikari L, Zacchi G (2007). Hightemperature enzymatic prehydrolysis prior to simultaneous saccharification and fermentationof steam pretreated corn stover for ethanol production. Enzymeand Microbial Technology 40， 607_13· OgierJC，Leygue JP，Ballerini D，Pourquie J and Rigal L (1999). Production d ' ethanol a partirde biomasse ligno-cellulosique. Oil&Gas Science and Technology-Rev. IFP，54(1) :67_94·Schell DJ，Farmer J，Newman M，McMillan JD. (2003) · Dilute—sulfuric acid pretreatment ofcorn stover in pilot-scale reactor !investigation of yields, kinetics，and enzymatic digestibilitiesof solids. Applied biochemistry and biotechnology,105-108 :69-85.Schwarz PB, Kunerth WH, Young VL. (1988). The distribution of lignin and othercomponents within hard red spring wheat bran. Chemical chemistry，65 :59_64.Tabka MG， Herpoel-Gimbert I, Monod F, Asther M, Sigoillot JC(2006). Enzymaticsaccharification of wheat straw for bioethanol production by combined cellulose，xylanase andferuloyl esterase treatment. Enzyme and Technology 39， 897-902.Valjamae P，Pettersson G，Johansson G. (2001). Mechanism of substrate inhibition in cellulosesynergistic degradation.Europeanjournal of biochemistry,268(16) :4520_6.Vidmantiene D， Juodeikeiene G， Basinskiene L. (2006)Technical ethanol production fromwaste of cereals and its products using a complex enzyme preparation. J. of the Sci. of Foo andAgric. 86 1732-1736.Wyman CE，Dale BE，Elander RT，Holtzapple M，Ladisch MR，Lee YY. (2005). Comparativesugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies tocorn stover.Bioresource technology,96 (18) :2026_32·
权利要求
一种处理生物量的方法，其包括如下步骤(a)提供由绳状青霉菌获得的至少一种酶混合物，所述绳状青霉菌根据布达佩斯条约被保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI 378536；(b)提供植物生物量；(c)在所述生物量发生糖化作用的条件下，使步骤(a)的所述酶混合物与步骤(b)的所述生物量接触。
2.根据权利要求1所述的处理生物量的方法，其中，在与步骤(a)的所述酶混合物接触 之前，所述生物量进行至少一个预处理步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述预处理步骤是化学预处理，其包括将所述生 物量置于98°C的硫酸水浴中，所述硫酸的浓度是3g/升。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述预处理步骤是机械预处理，其包括压碎所述 生物量。
5.一种制造生物乙醇的方法，其包括(a)提供由绳状青霉菌获得的至少一种酶混合物，所述绳状青霉菌根据布达佩斯条约 被保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI 378536 ；(b)提供生物量；(c)在植物废物产品发生糖化作用的条件下，使步骤(a)的所述酶混合物与步骤(b)的 所述生物量接触；(d)发酵根据步骤(c)所获得的产物。
6.根据要求1至5所述的方法，其中，所提供的所述酶混合物是分离的纯酶制剂。
7.根据要求1至5所述的方法，其中，所提供的所述酶混合物是粗制的酶制剂。
8.根据要求1至7所述的方法，所述生物量选自麦秸、麦麸、大麻纤维或者剥皮大麻的茎。
9.包括由绳状青霉菌获得的至少一种酶混合物的组合物在生物量的所述糖化作用中 的用途，所述绳状青霉菌根据布达佩斯条约被保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI 378536。
10.一种被处理的生物量，其包括由绳状青霉菌获得的至少一种酶混合物，所述绳状青 霉菌根据布达佩斯条约被保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI378536。
全文摘要
本发明涉及处理生物量的方法，其包括如下步骤(a)提供由绳状青霉菌获得的至少一种酶混合物，所述绳状青霉菌根据布达佩斯条约被保藏在国际真菌研究所，保藏号IMI378536；提供植物生物量；在糖化作用发生的条件下，使步骤(a)所述酶混合物与步骤(b)所述生物量接触。
文档编号C12P19/04GK101889093SQ200880119248
公开日2010年11月17日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月5日
发明者马克·马斯特拉斯 申请人:安迪苏法国联合股份有限公司