专利名称：一种冬虫夏草原草粉的双重pcr鉴真方法
技术领域：
本发明属于药材鉴真领域，具体涉及冬虫夏草原草粉的鉴真方法。
背景技术：
冬虫夏草在传统上多为煎汤或炖服，由于未打破虫草的细胞壁，有效成分难以溶出，不利于人体吸收。为提高冬虫夏草的利用效率，增加人体对冬虫夏草有效成分的吸收，有效的方法是将冬虫夏草粉碎后，制成片剂、胶囊剂、丸剂、酒剂等剂型产品后服用。以往通过形态识别，优质的原草容易为消费者接受，但经过粉碎加工以后，消费者的接受程度就大大降低。冬虫夏草原草深加工产品品质控制已成为制约冬虫夏草产业发展和升级的关键问题。目前，针对冬虫夏草与其形态相似伪品的鉴别研究已有多个专利报道，2000年11月12日公开的中国专利CN 1274010A和2001年6月6日公开的中国专利CN 1298024A分别针对冬虫夏草菌种的rDNA间区和18S rDNA进行引物和探针设计，实现在分子水平上对冬虫夏草菌种的道地性鉴别。2011年6月8日公开的中国专利CN 102086471A针对冬虫夏草菌种的rDNA间区进行研究，并建立了一种既能鉴别冬虫夏草真伪、又能明确其含量的分子鉴别技术；2011年10月26日公开的中国专利CN 102226217A则针对冬虫夏草菌种的18S rDNA进行引物设计，并开发出试剂盒应用于冬虫夏草的真伪鉴别。以上鉴别方法主要应用于冬虫夏草及其形态相似伪品的区分，而对冬虫夏草原草粉的鉴真无显著效果，难以在保证冬虫夏草原草粉的品质上发挥作用。因此，在本领域需要有一种新的检测方法用于冬虫夏草原草粉的鉴真，实现对其品质的控制和管理。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于冬虫夏草原草粉鉴真的可靠方法。为达到上述目的，本发明根据冬虫夏草的组成特点，设计冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因的PCR引物，进行一次单管双重PCR反应，同时扩增冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因，实际扩增片断分别为320bp和136bp。用于冬虫夏草原草粉鉴真的引物序列如下:冬虫夏草菌种特征性持家基因扩增引物:上游引物CICC-Oph-Fl:5，-GCCAATCCCATCAACAT-3，下游引物CICC-Oph-Rl:5，-CACCACCAACGACAAAA-3’冬虫夏草寄主蝠蛾特征性持家基因扩增引物:上游引物CICC-H印-Fl:5’ -GGGGCATCAGTAGATTTAGC-3’下游引物CICC-H印-Rl:5’ -CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’本发明采用的技术方案如下:
I)犾取样品基因组DNA;
2)采用上述弓丨物在PCR仪上进行PCR扩增；PCR 扩增反应体系为 25 ii L，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5yL，4 条引物(10 u mol/L)各 I ii L，10 ii mol/L 的 dNTP 2u L,2.5U 的 Taq 酶 0.5 y L，DNA 模板 1.0 y L，ddH20 15 u L0PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，进入循环:95°C 10s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。3) PCR扩增产物用2 %的琼脂糖凝胶进行检测。
4)样品的真实性判断在紫外灯下查看电泳条带，在136和320bp处有明亮条带的为冬虫夏草原草，仅在320bp具有明亮条带的是冬虫夏草菌丝体产品，在136和320bp处均无条带为伪品。本发明经过充分的前期试验筛选和优化，得到的引物特异性强，PCR扩增条件简单，采用一次单管多重PCR反应后，通过电泳检测便可鉴别产品真伪，操作简单，成本低，准确度高，具有很好的应用前景。
图1和图2分别为冬虫夏草菌种MAT1-2-1基因及其寄主蝠蛾COI基因的特异性引物设计示意图，其中有下划线的部分为扩增片段对应的核苷酸序列，有下划线的斜体部分为所设计的引物特异性结合位点。图3为PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中的电泳图谱，l-DL2000Marker, 2_冬虫夏草原草粉，3-冬虫夏草菌粉，4-蝙蝠蛾拟青霉菌粉，5-蛹虫草菌粉，6-阴性对照，7-DL2000Marker0具体实施案例下面结合实施案例对本发明进行具体说明，实施案例是为了进一步阐述本发明，而不会给本发明造成任何限制。实施例一:PCR引物的设计及其对样品的检测IPCR引物的设计1.1冬虫夏草菌种MAT1-2-1基因特异性引物的设计根据GenBank上公开登录的冬虫夏草MAT1_2_1基因序列信息进行引物设计(见图1)。参考序列的 GenBank 登录号为:FJ654171 (Ophiocordyc印s sinensis, MATl-2-lgene，complete cds, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ654171)。在18-34处设计上游引物，命名为CICC-0ph-Fl。序列为:5’~GCCMTCCCA TCMCAT-3’。在320-337 处设计下游引物，命名为 ClCOOph-Rl。序列为:5’-CACCACCMCGACMAA-3’。1.2冬虫夏草寄主蝠蛾COI基因特异性引物的设计根据GenBank上公开登录的冬虫夏草寄主蝠蛾COI基因序列信息进行引物设计(见图2)。参考序列的GenBank 登录号为:HM595857 (Ahamus yushuensis, cytochromeoxidasesubunit I (COI) gene, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/HM595857)。在346-365 处设计上游弓丨物，命名为 cioc-Hep-Fi。序列为:5’"Ggggcatcagtagatttagc-S’。
在461-481处设计下游引物，命名为CICC-Hep-Rl。序列为:5 ’ -CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’。2样品的检测2.1样品的收集购买市售冬虫夏草原草粉、冬虫夏草菌粉、蝙蝠蛾拟青霉菌粉、蛹虫草菌粉。2.2样品基因组DNA提取采用改良CTAB法提取基因组DNA，并使用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒对其进行纯化。2.3基因组DNA的多重PCR扩增PCR 扩增反应体系为 25 ii L，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5yL，4 条引物(10 u mol/L)各 I ii L，10 ii mol/L 的 dNTP 2u L,2.5U 的 Taq 酶 0.5 y L，DNA 模板 1.0 y L，ddH20 15 u L0PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，进入循环:95 °C 10s，58 °C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。2.4PCR产物检 测PCR扩增产物在2 %琼脂糖凝胶中电泳，在136和320bp处出现明亮条带的为冬虫夏草原草，仅在320bp具有明亮条带的是冬虫夏草菌丝体产品，在136和320bp处均无条带为其他样品(详见图3)。
权利要求
1.一种冬虫夏草原草粉的鉴真方法，其特征在于:经过一次简单的单管双重PCR同时检测冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因。
2.按照权利要求1所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于:用于检测冬虫夏草菌种和寄主蝠蛾特征性持家基因的引物分别为: 冬虫夏草菌种特征性持家基因扩增引物:上游引物 CICC-Oph-Fl:5’ -GCCAATCCCATCAACAT-3’下游引物 CICC-Oph-Rl:5’ -CACCACCAACGACAAAA-3’ 冬虫夏草寄主蝠蛾特征性持家基因扩增引物: 上游引物 CICC-H印-Fl:5’ -GGGGCATCAGTAGAITTAGC-3’ 下游引物 CICC-H印-Rl:5’ -CAAATAATGGTATGCGGTCA-3’。
3.按照权利要求2所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于:PCR扩增反应体系为25iiL，其中 IOXTaq reaction buffer 2.5yL，4 条引物(10umol/L)各 IuL, 10umol/L的 dNTP 2u L,2.5U 的 Taq 酶 0.5 y L，DNA 模板 1.0u L, ddH2015 u L。
4.按照权利要求3所述的冬虫夏草原草粉鉴真方法，其特征在于:所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5min，进入 循环:95°C 10s，58°C退火30s，72°C延伸30s，共35个循环，然后72°C延伸5min。
全文摘要
本发明公开了一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法。其技术方案是以冬虫夏草原草粉基因组DNA为模板，采用本发明设计的PCR引物，进行一次单管双重PCR反应，同时扩增冬虫夏草菌种及其寄主蝠蛾的特征性持家基因，实际扩增片断分别为320bp和136bp，通过琼脂糖凝胶电泳检测，确定产品的真实性。本发明可特异性识别冬虫夏草原草粉，只需DNA提取、PCR扩增和电泳检测三步即可完成对样品的真实性检测，操作简单、易于掌握、准确性高。
文档编号C12Q1/04GK103233062SQ20121050671
公开日2013年8月7日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者程池, 扎西才吉, 李辉, 姚粟, 刘洋, 白飞荣 申请人:中国食品发酵工业研究院, 玉树藏族自治州三江源药业有限公司