一种耐镉青霉菌及其分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水稻种植技术领域，尤其涉及一种高镉吸附能力的耐镉青霉菌及其分 离方法。
【背景技术】
[0002] 由于化学活性强，移动性大，毒性持久，不可生物降解，镉（Cd)成为土壤环境中生 物毒性最强的重金属元素之一，在环境中的易被生物吸收，可能通过食物链进入人体富集。 能引发痛痛病，能与核苷酸共价结合形成不稳定的加合物而损伤DNA，可能引发精神失常疾 病行为等。Cd严重危及人类健康，已被国际癌症研宄机构认定为1类（人类）致癌物。人类 活动产生的含镉污染物排放如工业废气、废水、废物排放，农业废弃物和生活污水、垃圾的 排放等，使稻田土壤镉污染越来越严重，已成为全世界普遍存在的问题。2013年"湖南镉大 米事件"促使水稻镉污染问题再度成为粮食安全方面的难题，稻田镉污染治理任务越来越 紧迫水稻镉污染主要直接来源为土壤，因而，镉污染稻田土壤修复的任务越来越紧迫。传统 的物理化学修复方法收效较快但工程量大、需要消耗大量能源或化学制品等，成本较高，某 些钝化剂的使用甚至会造成修复污染土壤同时对土壤理化性质产生不良作用，从而影响土 壤的后续利用。微生物数量多、比表面积大、代谢活性旺盛，可通过多种机制包括主动吸收、 结晶、螯合、化学形态改变、离子交换、胞内外沉淀、细胞壁或色素吸附等与重金属发生作用 而减少环境中重金属含量或改变其生物有效性，使微生物修复较物理、化学等修复技术操 作简单、处理费用低、效果好。其中，真菌细胞细胞壁上有大量多糖和糖蛋白如葡聚糖、几丁 质、甘露聚糖、磷酸甘露聚糖等，这些聚合物提供了大量金属结合配体，能与重金属充分结 合，且大多数真菌具菌丝结构，菌丝能渗透污染土壤，可与土壤中重金属充分接触而发生物 理化学反应，减少土壤中活性游离态重金属离子，从而减少土壤中有效态污染物质含量，且 不会对环境造成二次污染等。真菌来源广，且对营养物质、通气量、温度、PH的变化相对不 那么敏感，易于发酵，适合于大规模生产，成本低。经济上和生态上、操作上的多重优势使真 菌在重金属污染治理中具有巨大潜力和广阔的应用前景。由于环境长期选择作用，镉污染 土壤中一般存在耐镉且镉吸附能力强的真菌。国内外有从废水、煤矿区和工业区等土壤中 筛选到具有高耐镉能力和镉吸附能力的真菌有臭曲霉菌、青霉菌、酵母菌等，但从水稻田土 壤筛选到的耐镉真菌较少，适应重金属污染环境是应用微生物进行生物修复的前提，本土 微生物更能适应重金属污染稻田土壤特殊环境。因此，筛选镉污染水稻田耐镉真菌并研宄 其镉吸附特性等，可丰富稻田镉污染微生物修复菌种资源。许多真菌能通过产生植物激素 刺激植物生长，如青霉属、木霉属、曲霉属、裸胞壳属真菌。此具高镉吸附能力的耐镉青霉菌 对水稻具有促生作用，对镉胁迫水稻具有解毒作用。因此，此耐镉青霉菌具有在镉污染水稻 田土壤修复过程中发挥双重功效的潜力，此发明对镉污染水稻田镉污染修复具有重要的理 论与现实意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种耐镉青霉菌及其分离方法，旨在解决现有技术没有从 水稻田土壤筛选到的耐镉真菌，稻田镉污染修复率低和影响水稻种植的问题。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明是这样实现的：
[0005] -种耐镉青霉菌的分离方法，所述耐镉青霉菌的分离方法包括以下步骤：
[0006] 步骤一，土样采集、土样属性取，水稻田采集的锦污染土壤IOmg溶于90mL无菌去 离子水中，磁力搅拌30min制备土壤悬浮液，静置lOmin，获得镉污染土壤微生物水溶液；
[0007] 步骤二，取上清液ImL接种于含Cd (NO3) 22mM的PDA液体培养基中，28 °C振荡培养 箱中150rpm条件下培养7d，得到耐镉真菌富集培养液；
[0008] 步骤三，取耐镉真菌富集培养10倍系列稀释液100 μ L涂布于2mM Cd2+PDA平板 上，28°C培养7d后生长良好的菌落依次转接于4、8、16mM Cd2+PDA平板上，梯度驯化培养，筛 选得到耐镉能力最强的真菌。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种耐镉青霉菌，所述耐镉青霉菌对Cd的吸附率可 达83.56%;0(1、？13、211、(：11对0吧5的最低抑制浓度分别为46、>80、>80、201111 ;
[0010] 对Cd2+胁迫的响应外在表现为：菌落直径随重金属浓度升高而减小；Cd 2+浓度 彡2mM时，菌落在不添加迹量元素（Cu、Zn)的CYA平板上菌落由黄色变为红色，Cd2+浓度 彡5mM时，菌落在PDA平板上由绿色变为红色，随着Cd 2+浓度升高，各平板上菌落红色加深； 菌落形态也随Cd2+浓度变化而改变：20mM左右时，菌落表面形成突起；
[0011] 生长条件：能在PH4-8、温度24-37°C范围条件下良好生长，菌株发酵液对水稻种 出苗和幼苗生长无抑制作用。
[0012] 进一步，所述耐镉青霉菌最适生长和耐镉pH为4. 0、5. 0,温度为30°C。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种所述耐镉真菌在镉污染水稻田治理的应用。
[0014] 本发明提供的耐镉青霉菌及其分离方法，获得了对水稻作物安全且能促进水稻生 长和对镉胁迫水稻具有解毒作用的的具有镉污染稻田土壤高效治理潜力的菌株，扩充了微 生物修复的菌种资源库，并对其生长条件进行摸索，为培养和进一步探索利用该菌株进行 稻田环境镉污染治理提供理论基础，为镉污染土壤微生物修复工程提供了良好的菌种。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明实施例提供的耐镉青霉菌分离方法流程图；
[0016] 图2是本发明实施例提供的CN35的菌落在CYA、MEA、OA平板上示意图；
[0017] 图中：a. CN35形态特征：从左至右上排分别为CYA、MEA、0A、下排为CYA反面、MEA 反面、YES ;b.分生孢子梗和分生孢子；c.有隔菌丝；
[0018] 图3是本发明实施例提供的ITS序列不意图；
[0019] 图4是本发明实施例提供的BenA基因序列系统发育树不意图；
[0020] 图5是本发明实施例提供的CN35不同菌丝添加量和Cd2+不同初始浓度吸附率示 意图；
[0021] 图6是本发明实施例提供的不同重金属离子对CN35菌株生长的影响示意图；
[0022] 图7是本发明实施例提供的CN35在含不同浓度Cd2+的PDA、CYA培养基上菌落颜 色和形态差异示意图；
[0023] 图中：（a) PDA ; (b) CYA ; (c) CYA (反面）；（d) PDA ;
[0024] 图8是本发明实施例提供的不同浓度Cd2+对CN35生长的影响（7d)示意图；
[0025] 图9是本发明实施例提供的不同pH对菌株CN35生长和耐镉的影响示意图；
[0026] 图10是本发明实施例提供的不同温度对菌株CN35生长和耐镉的影响示意图。
【具体实施方式】
[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0028] 本发明采用Cd2+浓度梯度压力驯化法从镉污染稻田土壤中分离到耐镉菌株 CN35 ;综合菌株形态特征、ITS、BenA基因序列系统进化分析结果，初步鉴定其为青霉属 (Penicillium sp.);该菌株对Cd的吸附率可达83. 56% ;Cd、Pb、Zn、Cu对CN35的最低抑 制浓度（MIC)分别为46、> 80、> 80、20mM ;其对Cd2+胁迫的响应外在表现为：菌落直径随 重金属浓度升高而减小；Cd2+浓度多2mM时，菌落在不添加迹量元素（Cu、Zn)的CYA平板上 菌落由黄色变为红色，Cd 2+浓度多5mM时，菌落在PDA平板上由绿色变为红色，随着Cd2+浓 度升高，各平板上菌落红色加深；菌落形态也随Cd 2+浓度变化而改变，20mM左右，菌落表面 形成突起；生长条件研宄结果为：能在PH(4-8)、温度（24-37? )范围条件下良好生长，最 适生长和耐镉pH为4、温度为28-30°C，菌株发酵液对水稻种出苗和幼苗生长无抑制作用， 耐镉真菌CN35具有应用于镉污染水稻田治理的潜力。
[0029] 下面结合附图1及对本发明的耐镉菌株CN35分离作详细的描述。
[0030] SlOl :土样采集、土样重金属含量和pH测定：土壤样品采自湖南省常宁市松柏镇 新同村湘江流域稻田，采集一季晚稻田5-20cm 土壤2kg，混匀后分装于两个无菌密封袋， 一袋置于冰盒中带回实验室4°C保存，用于耐镉真菌筛选；一袋风干测定土壤样品全量CcU Cu、Pb、Zn (原子吸收光谱法）含量，各重金属CcU Cu、Zn、Pb总含量分别为17. 73、32. 42、 103. 9、58. 2mg/kg)及 pH 为 6. 1。
[0031] S102 :4°C保存土壤IOmg溶于90mL无菌去离子水中，磁力搅拌30min制备土壤悬 浮液；取土壤悬浮液ImL接种于含Cd (NO3) 22mM的PDA液体培养基中，28 °C振荡培养箱中 150rpm条件下耐镉真菌富集培养7d ;
[0032] S103 :取耐镉真菌富集培养稀释液100 μ L涂布于2mM Cd2+PDA平板上，28°C培养 7d后生长良好的菌落依次转接于更高浓度（4、8、16mM) Cd2+PDA平板上，梯度驯化培养，进一 步筛选、分离、纯化耐镉真菌。
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