一种尖孢镰孢菌及其菌剂和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治领域，具体涉及一种尖孢镰孢菌，还涉及利用该尖孢镰孢菌 生产的微生物菌剂及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 列当属于列当科（Orobanchaceae)列当属（Orobanche)，是一年生根寄生杂草，寄 生于某些高等植物根上，无叶绿素和根系，以吸盘从寄主植物体内摄取养分和水分。寄主 被寄生后，植株表现为生长缓慢、矮化、黄化、萎蔫或枯死等，造成农作物产量降低和品质下 降，严重时可导致农作物绝收。列当的寄主范围广泛，可寄生在菊科、豆科、茄科、萌芦科、十 字花科、大麻科、亚麻科、伞形科和禾本科等植物根上。列当的繁殖力强，每株可产生种子约 10万粒；列当种子存活期长，在土壤中列当种子的生活力可保持8-10年。在适宜温湿度下， 种子终年可以萌发，在作物的整个生育期内都会有列当出土，参差不齐，这种特性使其成为 非常难防的恶性杂草。在我国，危害较大的列当主要是向日葵列当、分枝列当和埃及列当。 近年来列当在河北、山西、内蒙古、新疆等地大面积爆发，重度田块寄生率达100%，损失巨 大。
[0003] 目前防治列当的方法主要是采用耕作、栽培技术措施或施用化学药剂；但是由于 列当种子产生量大，种子存活期长，且在适宜温湿度下，种子终年可以萌发，在作物的整个 生育期内都会有列当出土，参差不齐，使得现有技术措施的防治效果非常差。
[0004] 利用杂草的病原微生物研制专化性强、对目标杂草以外的植物影响小、环境 负效应少、安全性高的生物除草剂，有可能成为防除杂草的有效途径。如镰刀菌属 (Fusarium spp.)的某些种可以侵染列当，引起发病。王之樾（王之樾等·新疆农业科 技.1981(7) :16-17。王之樾等.中国生物防治.1985(1) :24-26)从田间自然罹病的列当 上分离到一株镰刀菌（Fusarium orobanches)并制成生防剂F798,用割莖涂液法防治哈密 瓜列当，但是该方法需要先将列当的茎部割断，再涂抹上生防菌液，操作非常麻烦、推广比 较困难，影响防治效果。尖抱镜刀菌（Fusarium oxysporum) (Heiko Thomas等.Annals of Botany. 1999. 83:453-458)能够在向日葵列当的地下生长阶段进行侵染，显著降低列当种 子的萌发和寄生率。镰刀菌L2菌株（孔令晓等.植物病理学报.2006 36(5):466-469) 对列当的防治效果达到92.4%，L2菌株粗毒素能够抑制列当种子萌发，并造成列当种 子萌芽管损伤。利用生防镰刀菌防治烟草列当可减轻列当的危害（吴元华等.烟草科 技.2012 (10) : 78-80)，但是此种方法需要先用硫磺调节土壤的酸碱度再穴施生防镰刀菌， 比较费事，且防治效果有限；专利《一种层出镰孢菌及其菌剂和应用》（ZL201010209217. 5) 公开了利用层出镰孢菌防治向日葵列当，其田间防治效果可达61. 7%。从以上可以看出，镰 刀菌是防治列当的有效途径，但是现有的镰刀菌还存在防治范围有限，发酵水平低，防治效 果受环境影响较大等缺点，亟需寻找新的能高效和长效防治列当的镰刀菌，并对相应的菌 剂的制备方法进行研宄。
【发明内容】
[0005] 针对培育抗列当品种难，栽培措施防治效果差和化学农药防治带来的污染环境等 问题，本发明目的在于提供一种尖孢镰孢菌。该菌可高效、长效抑制分枝列当和弯管列当， 并对列当的寄主植物的生长具有促进作用。
[0006] 本发明第二目的在于提供利用上述尖孢镰孢菌生产的微生物菌剂。
[0007] 本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。
[0008] 本发明第四目的在于提供上述尖孢镰孢菌在防治番茄、烟草和向日葵上寄生的分 枝列当和弯管列当上的用途。
[0009] 本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治番茄、烟草和向日葵上寄生的分 枝列当和弯管列当上的用途。
[0010] 本发明通过以下技术方案实现：
[0011] -种尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum，亦称尖孢镰刀菌）菌株Br_2,己于2015 年1月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏地址为：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所），保藏编号为CGMCC No. 10324。
[0012] 利用上述尖孢镰孢菌生产的微生物菌剂，所述的微生物菌剂含有尖孢镰孢菌Br-2 菌体和发酵液。
[0013] 上述微生物菌剂为固体制剂，所述的固体制剂中的尖孢镰孢菌Br-2的活菌数大 于 lX108cfu/g〇
[0014] 上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)菌种活化：将低温保存的Br-2菌株接种在PDA平板培养基上，在25°C活化培 养72h，在菌落边缘用直径5_的打孔器打出菌片，得Br-2菌片；
[0016] (2)种子液制备：将步骤（1)活化的Br-2菌片接种于PDB液体培养基中，每200ml PDB液体培养基接种Br-2菌片4~5片，在25~26°C、转速170/rpm下振荡培养48~72h， 得Br-2种子液；
[0017] (3)发酵培养：向发酵罐加入发酵培养基，初始pH值用HCl调为5,灭菌后待温度 降到25°C以下时采用负压方法按照重量百分比为0.5~1%的比例接入步骤（2)所得的 Br-2种子液，在温度为25~30°C、通气量为1:0. 3~1. 0、搅拌速度为160~200rpm条件 下发酵培养48~96h ;
[0018] (4)发酵培养48小时后，检测发酵液中分生孢子数量，待发酵液中分生孢子数量 达到IO 8即可停止发酵培养；离心浓缩10倍，所得即为Br-2菌株的液体制剂；
[0019] (5)按照1:1的重量比向步骤⑷所得的Br-2菌株的液体菌剂中加入助剂，混匀 干燥后即为Br-2菌株的固体制剂。
[0020] 上述制备方法步骤（1)所述的PDA培养基的组成成份及其重量百分比为：马铃薯 20%，葡萄糖2%，琼脂1.5%，其余为水。
[0021] 上述制备方法步骤（2)中所述的其中PDB液体培养基组成成份及其重量百分比 为：马铃薯20%，葡萄糖2%，其余为水。
[0022] 上述制备方法步骤（3)中所述的发酵培养基的组成成份及其重量百分比为：蔗糖 2~4 %，硫酸铵0· 3~0· 5 %，磷酸氢二钾0· 08~0· 15 %，硫酸镁0· 03~0· 06 %，氯化钾 0· 08~0· 15%和硫酸亚铁0· 001~0· 01%，其余为水。
[0023] 上述制备方法步骤（3)中所述的通气量优选为0~24h 1:0. 3 ; 24~48h1:0. 6 ; 48 ~96h 1:1。
[0024] 上述制备方法步骤（3)中所述的通气量是指每分钟通入发酵罐的空气体积与发 酵罐中发酵液的体积比。
[0025] 上述制备方法步骤（3)中所述的搅拌速度优选为160~170rpm。
[0026] 上述制备方法步骤（3)中所述的发酵培养时间优选为48~60h。
[0027] 上述制备方法步骤（5)中所述的助剂为娃藻土或麦麸。
[0028] 上述尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum)菌株Br_2在防治分枝列当（Orobanche acgyptiaca Pers.)或弯管列当（Orobanche cernua Loefling)上的应用。
[0029] 上述微生物菌剂在防治分枝列当（Orobanche acgyptiaca Pers.)或弯管列当 (Orobanche cernua Loefling)上的应用。
[0030] 上述应用中所述列当的寄主分别为番茄、向日葵或烟草等。
[0031] 本发明尖孢镰孢菌Br-2对10种主要作物（包括单子叶和双子叶植物）小麦、甜 瓜、西瓜、茄子、棉花、玉米、烟草、向日葵、辣椒、番茄等10种作物没有致病现象，表现对作 物安全而且具有促生长作用。
[0032] 本发明尖孢镰孢菌微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂在番茄、烟草 育苗期土壤中施用，也可将上述所得微生物菌剂用于番茄、烟草移栽期或向日葵播种期根 施。
[0033] Br-2菌株的分离筛选过程
[0034] Br-2菌株是河北省农林科学院植物保护研宄所从河北省张家口蔚县寄生于烟草 的感病列当上分离得到的。2010年9月河北省农林科学院植物保护研宄所从河北张家口烟 草地中地采集发病的弯管列当植株，表面消毒后切取感病植株茎部组织摆放于PDA平板培 养基上培养得到真菌菌株，对这些菌株进行纯化，经过在10种作物上的安全性检测后，筛 选出对作物无致病作用且有促生长作用的菌株，在烟草、番茄、向日葵列当发生严重的地块 采用作物根部土壤施用进行筛选，从中得到一株对分枝列当和弯管列当具有明显的防治效 果的菌株，定名为Br-2。
[0035] Br-2菌株的分类：
[0036] (一）根据形态特征分类
[0037] 菌株Br-2在PDA平面培养基上25 °C培养，菌落呈发射状生长，菌落颜色白色，随着 培养时间增长中心菌丝变为淡紫色，很少产生大型分生孢子，多数为小型分生孢子。大型分 生孢子无色呈纺锤形或镰刀形，分隔1-5个，一般3个，顶端细胞较长，渐尖，偶见足细胞，大 小约为30-43 μηιΧ3. 5-4. 3 μπι ;小型分生孢子无色，椭圆形或卵圆形，无隔或偶见1分隔， 大小为5-17 μ mX 2-5 μ m，假头状着生于侧生瓶状小梗上，分生孢子梗短；厚垣孢子间生或 顶生于菌丝或大形分生孢子上，单独或呈链状，壁透明，光滑或粗糙，直径5-13 μ m。根据 镜刀菌鉴定手册《The Fusarium Laboratory Manual》（John F 等.Summerell, Blackwell Publishing, 2006)，Br-2的形态特征（见图1、图2、图3和图4)与尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum，亦称尖孢镰刀菌）的形态特征描述相符合，说明Br-2属于镰刀菌属尖孢镰孢菌 (Fusarium oxysporum)〇
[0038] (二）根据翻译延长因子I- a (EFl- α )基因序列进行分类
[0039] 提取fc-2基因组DNA，以fc-2基因组DNA为模板，以下述EFl- a F和EFl- a R 为引物进行PCR扩增，所述的引物序列为：EFl-a F 5' -ATG GGT AAG GA(AG)GAC