一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株酿酒酵母工程菌及其应用，特别是一株在细胞表面锚定表达植酸酶的酿酒酵母菌株及其应用。
【背景技术】
[0002]燃料酒精是一种可再生的清洁能源，国内外生产燃料酒精的原料有玉米、甘薯、木薯、甘蔗、甜菜、高粱秸杆等，目前应用于工业生产的主要是玉米类淀粉质原料。酒精糟液的处理是燃料酒精生产中的一个关键工序，糟液中含有糖分，蛋白质，纤维素，氨，磷，钾等营养成分，经浓缩处理后可用于生产动物饲料。酒精糟液中的磷主要以植酸磷的形式存在，植酸磷是一种抗营养因子，不能被动物直接吸收利用，还会影响其他矿物元素的吸收，同时，植酸磷随动物粪便排出体外后，会对环境造成污染。
[0003]植酸酶能够催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)，同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。在酒精发酵生产中，有通过外源添加植酸酶以提高酒精生产效率，降低酒糟中的植酸磷含量的研宄，但是要从根本上解决植酸磷酒精发酵及酒糟利用的不利影响，还是需要利用基因工程的手段构建能够分泌表达植酸酶的酿酒酵母菌株。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy，已于2015年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)武汉大学保藏中心，保藏编号CCTCC M 2015190。
[0005]本发明提供的酿酒酵母工程菌，是将植酸酶的编码基因Phy和α -凝集素的编码基因AG α I融合后导入酿酒酵母CICMY0086 (江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)中，得到的在细胞表面锚定表达植酸酶的菌株。
[0006]所述植酸酶的氨基酸序列的GenBank号为ΝΡ_415500 ;所述α -凝集素的GenBank号为 ΑΑΑ34417。
[0007]所述植酸酶的编码基因的核苷酸序列的GenBank号为946206 ;所述α -凝集素的编码基因的核苷酸序列的GenBank号为Μ28164。
[0008]所述植酸酶的编码基因phy通过表达载体pMGK-AG导入酿酒酵母；所述表达载体PMGK-AG包含有α -凝集素编码基因的核苷酸序列。
[0009]所述酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae/pMGK-AG-phy优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)PHY0
[0010]酿酒酵母PHY由以下步骤获得:
[0011](I)构建重组质粒pMGK-AG-phy，流程如图4所示。以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，PCR扩增得到植酸酶基因phy片段；将扩增得到的phy基因与质粒pPIC9k连接，得到重组质粒pPIC9k-phy，以此为模板PCR扩增得到含信号肽的sphy基因，与表面展示载体pMGK-AG(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)连接，得到重组载体pMGK-AG-phy。
[0012](2)将重组载体pMGK-AG-phy转化酿酒酵母CICMY0086，获得重组酵母PHY
[0013]酿酒酵母PHY的细胞为椭圆形，菌落形态特征是菌落凸起、光滑、乳白色、边缘整齐；最适生长温度30 °C，最适生长pH为5.5。
[0014]酿酒酵母PHY的植酸酶酶活为6.4U/g(菌体湿重)，酶活测定采用钼蓝法，具体操作:将800 μ L 6.25mmol/L的植酸钠溶液37°C预热lOmin，加入200 μ L上清液或全细胞催化剂，37°C反应30min，立即加入ImL 5%的三氯乙酸终止反应，加入ImL显色液(1.5%钼酸铵溶液，2.7%硫酸亚铁，4:1比例混合，现用现配)，室温下静置10min，8000r/min离心5min，测定其在700nm处的吸光值。酶活定义为:在37°C、pH 5.0条件下，每分钟从5.0mmol/L植酸钠溶液中释放出I μπιο?的无机磷所需的酶量定义为I个酶活力单位。
[0015]本发明还提供了一种利用上述酿酒酵母工程菌生产酒精的应用。
[0016]本发明提供的生产酒精的应用是以玉米粉/木薯培养基为发酵培养基，配制方法为:按l:3(w/v)的比例将玉米粉/木薯粉与去离子水混合，调pH至6.0，加入耐高温α淀粉酶(10U/g)，加热料液至95°C，维持2h，降至室温后调pH至4.5，添加去离子水以弥补水分损失，高压蒸汽灭菌，降温后加入糖化酶(130U/g)和尿素(终浓度0.05% )。
[0017]本发明所提供的酿酒酵母工程菌，在以玉米粉/木薯粉为原料的同步糖化发酵实验表明，生长速度高于出发菌株，同时酒精产量相较出发菌株提高了 5.6%。更为重要的是发酵后酒糟中植酸磷含量与对照相比降低了 91 %。构建的表面展示表达植酸酶的重组工业酿酒酵母能够有效降低植酸含量，提高了酒糟的利用价值，减少磷排放，对燃料酒精的环境友好生产具有重要的意义。
【附图说明】
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[0018]图1为植酸酶基因PCR产物和重组质粒pPIC9k_phy酶切产物电泳图
[0019]图2为带信号肽的植酸酶基因PCR产物和重组质粒pMGK-AG-phy酶切产物电泳图
[0020]图3为酿酒酵母转化子的染色体DNA的PCR产物电泳图[0021 ] 图4为重组质粒pMGK-AG-phy的构建流程图
[0022]图5为酿酒酵母工程菌PHY发酵过程中的葡萄糖和酒精变化图
[0023]图6为酿酒酵母工程菌PHY发酵的过程中，培养基干物质中的植酸磷含量变化曲线
【具体实施方式】
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[0024]下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0025]实施1、构建酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)PHY。
[0026]一、含有植酸酶编码基因的重组质粒pPIC9K_phy的构建
[0027]根据已报道的大肠杆菌植酸酶的编码基因phy的核苷酸序列(phy基因序列的GenBank号为946206)，设计如下引物，在下游引物中引入EcoR I酶切位点(用下划线标出)。
[0028]上游引物Phyl:ATGAAAGCGATCTTAATCCCAT
[0029]下游引物Phy2: CCGGAATTCTTACAAACTGCACGCCGGTA
[0030]以大肠杆菌K12基因组DNA为模板，以Phyl、Phy2为引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示，得到一条约1300bp的特异性条带，其大小与GenBank已公布的基因长度一致，经进一步DNA测序表明扩增得到植酸酶基因。将扩增得到的Phy基因用Pfu补平后与SnaB I酶切后的质粒pPIC9k(江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)连接，构建了重组质粒pPIC9k-phy。利用限制性内切酶Sal I进行酶切验证，结果见图1，酶切得到大小约3000bp和7500bp的带，与预期相当，酶切验证结果证明pPIC9k_phy的结构正确。图1中，泳道M为DL 15000DNA Marker，泳道I为Phy的PCR产物，泳道2为SnaB I酶切后的质粒pPIC9k，泳道3为Sal I酶切后的重组质粒pPIC9k_phy。
[0031]二、含有植酸酶编码基因的重组质粒pMGK-AG-phy的构建
[0032]根据pPIC9K中的alpha因子信号肽的核苷酸序列设计上游引物pl，引入EcoR I酶切位点，Pi核苷酸序列如下
[0033]上游引物P1: CCGGAATTCCGATGAGATTTCCTTCAA
[0034]以重组质粒pPIC9k_phy为模板，以pl和Phy2为上下游引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，得到一条约1500bp的特异性条带，其大小与预期相同，表明扩增得到含信号肽植酸酶基因sphy。将PCR产物用EcoR I酶切后用核酸酶SI处理得到平末端片段，同样方法处理表面展示载体pMGK-AG (江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心保藏)，T4连接酶16°C过夜连接，构建表达载体pMGK-AG-phy。利用限制性内切酶Hind III进行酶切验证，结果见图2，酶切得到大小约1000bp、4000bp和6000bp的带，与预期相当，酶切验证结果证明pMGK-AG-phy的结构正确。图2中，泳道M为DL 15000DNA Marker，泳道I为sphy的PCR产物，泳道2为EcoR I酶切后用核酸酶SI处理的质粒pMGK-AG，泳道3为Hind III酶切后的重组质粒pMGK-AG-phy。
[0035]重组质粒pMGK-AG-phy的构建流程如图4所示。
[0036]三、重组质粒pMGK-AG-phy转化酿酒酵母CICMY0086
[0037]将重组质粒pMGK-AG