解脂亚罗酵母、在葡萄采后病害防治中的应用及使用方法
【专利摘要】本发明涉及解脂亚罗酵母、在葡萄采后病害防治中的应用及使用方法，属于生物【技术领域】。该菌株分离自江苏镇江的葡萄园中，经鉴定为解脂亚罗酵母（Yarrowialipolytica），命名为解脂亚罗酵母WSL-01并将其保存于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO.8492，保藏日期为2013年11月21日。使用时将解脂亚罗酵母活化、发酵培养，离心得到菌体，菌体用无菌水稀释制备成1.0×108个/ml的菌悬液。用喷壶喷射至葡萄外表皮，再风干，放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温或冷藏条件下存放。该菌既能防治葡萄采后病害，又能够高效降解葡萄上的OTA，对食品安全具有重要的现实意义。
【专利说明】解脂亚罗酵母、在葡萄采后病害防治中的应用及使用方法
[0001]
【技术领域】
本发明涉及一种解脂亚罗酵母菌种iYarrowia)以及该菌种对葡萄采后病害防治和降解赭曲霉毒素A的应用及使用方法。
【背景技术】
[0002]葡萄是世界范围内最重要的水果之一。但葡萄的采后腐烂损失严重，因处理不足和缺乏适当的方法来防止腐烂和衰老，每年在贮藏过程中都会损失掉将近30%-40%的葡萄。葡萄采后腐烂主要由致病菌引起，由真菌例如灰霉、青霉、曲霉等引起的采后腐烂严重影响了葡萄的品质，安全性，货架期和市场价值。即使在冷库(0°C )贮藏过程中，由青霉属、曲霉属、链格孢属、灰葡萄孢属、根霉属、链格孢霉属等微生物引起的腐烂导致的葡萄采后损失约占产量的39%和价值的30%。
[0003]致病真菌除了引起水果采后腐烂以外，部分真菌还能产生真菌毒素，严重影响食用者的身体健康。赭曲霉素(Ochratoxins)是曲霉属和青霉属的某些种产生的次级代谢产物，主要包括赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B和赭曲霉毒素C等7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A分布较广且毒性较强，有致畸、致突变、致癌的能力，且具有免疫毒性。2004年国际癌症研究机构(IARC)将其划分为可能的人类致癌物，即2B类物质。自从1996年葡萄汁里检出该毒素开始，赭曲霉毒素陆续从其他各种葡萄制品中检出。据国外文献报道，葡萄制品中赫曲霉毒素残留量一般在0.01~3.4 μ g/kg之间，甜酒中赫曲霉毒素的残留量在I~3.9 μ g/kg，葡萄汁中赭曲霉毒素的残留量较高，在1.16~2.32 μ g/kg之间，葡萄干中赭曲霉毒素的残留量更高，一般超过40 μ g/kg。
[0004]赭曲霉毒素A(OTA)主要是由某些曲霉属dpergiJJiAs)和青霉属产生的次级代谢产物。OTA是苯丙氨酸与异香豆素结合体衍生物，分子式为C2tlH18O6ClN,分子量为403.8，为白色针状晶体，在荧光灯下呈明亮绿色荧光。微溶于水，易溶于极性有机溶剂。OTA是半抗原，需与大分子物质结合后才具有免疫原性。其具有耐热性，焙烤只能使其毒性减少20%，蒸煮对其毒性不具有破坏作用。
[0005]OTA具有多种毒性，尤其具有肾毒性，且有一定致畸、致癌、致突变性，被认为是巴尔干地方性肾病的主要因素之一，因此对动物和人体健康会造成很大的潜在危害。短期试验结果显示，OTA对所有单胃哺乳类动物的肾脏均有毒性，可引起实验动物肾萎缩或肿大、颜色变灰白、皮质表面不平、断面可见皮质纤维性变化；显微镜下可见肾小管萎缩、间质纤维化、肾小球透明变性、肾小管坏死等，并伴有尿量减少、血尿素氮升高、对氨基马尿酸清除率降低、尿频、尿蛋白和尿糖增加等肾功能受损导致的生化指标的改变，而尿蛋白和尿糖增加表明近曲小管对蛋白和糖的重吸收功能降低。母亲经膳食摄入的OTA可分泌至乳汁中，通过母乳暴露OTA对婴儿健康的影响也应引起重视。2004年国际癌症研究(IARC)将其划分为人类可能致癌物质(2B类)。我国规定谷物及其制品中的OTA的限量标准为5 yg/ kg。
[0006]葡萄及其制品中的赭曲霉毒素主要来自于水果在贮藏期污染某些能产生赭曲霉毒素的致病霉菌。因此要控制葡萄及制品中的赭曲霉毒素残留情况，首先要控制葡萄在贮藏期霉菌的污染，减少赭曲霉毒素产生的机会；其次要采取措施，去除或降解已经产生的赭曲霉毒素。
[0007]由于传统方法是从控制葡萄在贮藏期霉菌的污染从而防止OTA的产生、去除或降解已经产生的OTA两方面来控制葡萄及制品中的OTA残留的，以下从这两方面来阐述传统控制方法存在的问题。
[0008]( I)控制葡萄在贮藏期霉菌污染的传统方法存在的问题
低温贮藏、气调贮藏是抑制水果采后病害的有效方法，但两者都需要相应的设备，在广大的发展中国家，已有的设备往往不能满足大多数水果的需要。另外，有些致病霉菌(包括碳黑曲霉)比较耐低温，在冷藏情况下仍能够在水果上生长，并造成葡萄腐烂，甚至产生霉菌毒素。长期以来，控制葡萄采后病害及霉菌毒素污染的主要措施是使用杀菌剂，而葡萄在采前经常使用洒咯菌腈(flud1xonil)和喃菌环胺(cyprodinil)进行喷洒,在采后忙藏及加工过程中经常使用二氧化硫(SO2)处理[29，3°]。杀菌剂的长期和大量使用，严重污染环境，有损于人类健康。过去十多年，公众和科学界对于食品和环境中农药(尤其杀菌剂)残毒问题的关注日益增加。美国国家科学院(NAS)的报道(1987)指出，杀菌剂的应用对人类健康造成了危害。全美9种致瘤化合物的销售量中，杀菌剂占90%左右，在用于食物的全部农药中，杀菌剂构成60%的致瘤危险。这一报道导致了几种杀菌剂如克菌丹(captan)和苯菌灵(benomyl)等被美国环保机构所禁用，并部分或全部地自动退出采后应用市场。对葡萄在采前最常使用的杀菌剂洒咯菌腈(fIud1xonil)和喃菌环胺(cyprodinil)而言,在澳大利亚等发达国家，它们已被明令禁止在葡萄采收之前60天内使用[31]。对葡萄在采后贮藏及加工过程中经常使用的SO2而言，SO2除了能引起葡萄颜色漂白、产生不良风味以外，还能造成食用者的过敏反应，对食用者的健康造成伤害[32]。在美国等发达国家，SO2已被禁止在有机葡萄上使用[33]。
[0009](2)去除葡萄制品中OTA残留的传统方法存在的问题
现有葡萄及其制品中OTA的去除方法，如清洗和拣选原料、吸附处理、澄清处理等，使OTA或进入清洗用水中或进一步富集到吸附材料及澄清后的固态沉淀中，对环境构成了潜在威胁；最主要的是这些方法的效果都很有限，很难将葡萄及制品中的OTA残留量降低到安全限度内。另一方面，现有OTA降解方法如辐照、臭氧氧化及添加化学物质处理等，或由于成本昂贵或由于安全性尚未明确，多停留在试验阶段，生产中尚未见有实际应用。
[0010]总之，上述方法在葡萄及葡萄制品中赭曲霉毒素的控制中存在着安全性、经济性、高效性和实用性低等问题。鉴于以上控制葡萄及制品中OTA残留的传统方法存在的问题，研发环保、安全、经济、高效、实用，既具有水果病害防治效果、又具有控制OTA残留的生物技术，具有重要的社会价值和经济价值。
[0011]本发明中的解脂亚罗酵母WSL-01被认为是最安全的酵母之一，研究证明，其能显著降低葡萄采后病害的发生，并能够显著地降解0ΤΑ。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一株分离自葡萄园的能够控制葡萄采后病害、并能高效降解OTA的酵母菌株，因其具有的高安全性，利用该菌株可实现对葡萄及葡萄制品中OTA的控制。
[0013]本发明所提供的降解OTA的菌株是从江苏省镇江市句容的葡萄园中分离到的，这是一株具有极高活力，对OTA降解能力很强的菌株，其培养方法简单，生长速度较快，不易变异，安全性高。将其编号为WSL-01，已将其保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年11月21日，保藏编号为:CGMCC N0.8492。该菌株的5.8SrDNA-1TS基因序列已经递交到了 GenBank数据库,发现该序列与解脂亚罗酵母(/arroffialipolytica )菌基因序列高度同源。
[0014]本发明同时提供了一种利用解脂亚罗酵母进行葡萄采后病害防治及贮藏保鲜方法；步骤如下:将解脂亚罗酵母)活化、发酵培养,离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成1.0XlO8 CFU/mL的菌悬液；用喷壶喷洒至葡萄外表皮，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温下存放。
[0015]本发明的解脂亚罗酵母WSL-Ol菌株采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为NYDA培养基(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%，琼脂2%)，也可以使用马铃薯琼脂培养基(马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15~20克，自来水1000毫升)。在pH
7.(T9.0,26°C~28°C，培养36 h。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基NYDB(牛肉膏0.8%，酵母浸出物0.5%，葡萄糖1%)或者PM培养基(酵母浸膏5g，蔗糖10g，蛋白胨5g，麦芽糖2g，蒸馏水100mL)中，pH 7.0~9.0，温度26°C~28°C，摇床转速180 r/min的培养条件下，培养4(T48 h。一般在40 h左右可以达到最大生物量。
[0016]本发明的解脂亚罗酵母lipolytica) WSL-01,可以明显的抑制葡萄产生腐烂腐败的病原菌，防止葡萄采后发生腐烂，并且具有不产生毒素、可以和化学杀菌剂共同使用等优点，可以广泛的用于葡萄采后病害的生物防治过程中，减少采后病害造成的损失。
[0017]本发明提供的解脂亚罗酵母能够降解赭曲霉毒素A。
[0018]通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明解脂亚罗酵母WSL-Ol的5.8S rDNA -1TS区序列进化关系图。
[0020]图2不同浓度的耶罗维亚酵母对OTA的降解。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]本发明菌株通过以下方法得到，从镇江市句容葡萄园中分离得到。经过形态学观察、生理生化特征试验和ITS碱基序列分析，鉴定为解脂亚罗酵母WSL-01 iYarrowialipolytica WSL-01)。已将其保藏于位于中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年11月21日，保藏编号为=CGMCC N0.8492。
[0023] 本发明的菌株解脂亚罗酵母WSL-Ol菌株(菌株编号=CGMCC N0.8492)微生物学特性如下:1.形态学特征
(I)在YEro固体培养基平板(酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000mL,琼脂20 g，115°C湿热灭菌20 min)上28°C培养48 h，菌落呈圆形、边缘粗糙呈绒毛状、较湿润、易挑起。细胞形态呈长椭圆形，单个分散。
[0024](2)在麦芽汁液体培养基中培养24h后，不形成醭，菌液浑浊，有沉淀，镜检酵母细胞呈椭圆形，芽殖。
[0025]生理特性
本发明菌株碳源能够同化甘油、甘露醇，不能同化淀粉、麦芽糖、蔗糖、乳糖等。氮源能够同化硝酸盐，37°C可以生长。其生理特性结果具体见下表1和表2。
[0026]分子生物学鉴定
对筛选菌株解脂亚罗酵母WSL-Ol的5.8S rDNA-1TS区序列分析，在GenBank上检索，确定为解脂亚罗酵母WSL-01(Zarroffia lipolytica WSL-01)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。
[0027]表1解脂亚罗酵母WSL-Ol碳源氮源同化结果
【权利要求】
1.解脂亚罗酵母(Jarrowialipolytica) WSL-OI, CGMCC N0.8492。
2.权利要求1所述的解脂亚罗酵母菌株的用途，其特征在于可以用其对葡萄进行采后病害防治及贮藏保鲜。
3.权利要求1所述的解脂亚罗酵母进行葡萄采后病害防治及贮藏保鲜方法，按照下述步骤进行:将解脂亚罗酵母活化、发酵培养，离心得到菌体；将菌体用无菌水稀释制备成18CFU/mL的菌悬液；用喷壶喷洒至葡萄外表皮，再风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温下存放。
4.权利要求 书I所述的解脂亚罗酵母菌株的用途，其特征是能降解赭曲霉素A(OTA)。
【文档编号】A23B7/155GK104130953SQ201410231417
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】张红印, 杨其亚, 王峻峻, 王海英, 张晓云 申请人:江苏大学