专利名称：基于基因工程策略优化耶氏解脂酵母重组菌合成共轭亚油酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程手段对耶氏解脂酵母重组菌进行优化从而提高共轭亚油酸产量，具体是对合成共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株进一步优化。技术背景
共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是由一系列含有碳9、碳10、碳11开始的共轭双键、具有位置和几何异构的十八碳二烯酸构成的。近30年来，由于CLA具有包括抗癌、抗动脉粥样硬化、免疫系统的调节以及抑制脂肪的积累等对人类健康有益的效果，而被广泛的研究。c9，tll-CLA、tlO，C12-CLA是含量最多并且是迄今为止确认具有生理活性功能的三种共轭亚油酸单体(还包括t9，tll-CLA)中的两种。CLA存在于多种动、植物及人体组织中，特别是反刍动物乳制品中，但其含量较低。通过将红花籽油或葵花籽油碱催化异构法等化学方法合成的CLA异构体的混合物，具有活性功能的异构体较难从中分离纯化。而通过生物转化法来获得成分单一的功能CLA是目前的一个前沿技术，能够满足CLA在医药及营养领域的应用要求。
到目前为止，c9, tll-CLA生物合成的最高量是Delacroixia coronata菌株通过delta-9脱饱和酶作用将t_亚油酸转化成CLA，浓度最高达到10.5mg/ml。转基因烟草种子以及大米中tlO，C12-CLA占总脂肪酸的量仅分别为0.3%及1.6%。相对而言，生物合成tlO，cl2-CLA具有很大的提升空间。亚油酸异构酶(PAI)可以将游离亚油酸(LA)催化为共轭亚油酸。在之前我们的研究中通过优化PAI基因成功实现了在耶氏解脂酵母(Yairowialipolytica, Y.1ipolytica)重组菌株中的异源表达,并在重组菌株的脂肪酸组分中检测到了产物tlO，cl2-CLA，利用多拷贝整合进一步提高了 PAI基因在Y.lipolytica中的表达量及tlO，cl2-CLA产量，CLA产量占总脂肪酸量的5.9%。但此重组菌株的tlO，cl2_CLA产量还远远不能满足实际应用的要求。在Y.lipolytica细胞中，LA不只是PAI的底物，它也会参与到脂肪酸贝塔氧化等代谢途径中，这些途径中的相关酶和PAI之间存在竞争关系，因此无论是PAI表达量的提高还是LA的增多都会使更多的LA流向CLA合成通路。来源于本实验室高山被孢霉(Mortierella alpine ATCC32222, M.alpineATCC32222)的 delta-12脱饱和酶基因(FADS12，dl2)具有较广的适配性，无论酵母还是丝状真菌均能成为其表达宿主，delta-12脱饱和酶是将OA转化为LA的脂肪酸脱氢酶，可进一步提高菌体内LA的含量。另外培养基中添加一些植物油也可使底物LA的含量大大提高。
所以本发明通过基因工程的方法来改造Y.lipolytica重组菌株，提高PAI基因表达量和底物亚油酸(LA)的含量，并且培养基中额外添加LA含量较高的大豆油，达到了用微生物法高产tlO，C12-CLA的目标。
发明内容
本发明的目的是通过基因工程及发酵手段提高耶氏解脂酵母重组菌株中PAI的表达量以及底物LA的量，从而提高tlO，C12-CLA专一异构体的产量。
本发明涉及含有opai/dl2共表达基因的重组表达质粒，所述质粒可以是pJU16-opai_dl2。
本发明另外一方面还涉及含有所述的重组表达质粒的宿主细胞，宿主细胞中包含的质粒可以是单拷贝或多拷贝的，例如1-8个拷贝，优选4个、5个、6个、7个或8个拷贝，最优选8个拷贝，所述宿主细胞可以是耶氏解脂酵母菌，例如CCFM-JUL系列菌，优选CCFM-JUL277。
本发明还涉及利用所述的重组表达质粒或所述的宿主细胞在生产共轭亚油酸中的用途，所述的共轭亚油酸是tio，C12-CLA,通过发酵所述宿主细胞，并在大豆油培养基中进行发酵可制备生产共轭亚油酸tlO，C12-CLA专一异构体，具体发酵培养条件如下:CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5%接种量转接至5LYN2(IBDS培养基中，28°C发酵，发酵时间为30-45小时，优选的发酵时间为40小时。
本发明克隆了来源于本实验室高山被孢霉(MortierellaalpineATCC32222，M.alpinaATCC32222)的delta-12脱饱和酶基因，并通过基因工程技术将该基因插入了包含亚油酸异构酶(PAI)基因的质粒载体中，最终获得了包含脱饱和酶基因delta-12和亚油酸异构酶基因opai的表达质粒pJU16-opai_dl2。将该质粒通过本领域常用的转化方法耶氏解脂酵母菌株CCFM-JUL中。最终筛选得到了能够高产量生产CLA的CCFM-JU277系列重组菌株。delta-12脱饱和酶基因(FADS12，dl2)可以将OA转化为LA的脂肪酸脱氢酶，进一步提高菌体内LA的含量，LA的增多使更多的LA流向CLA合成通路。此外，转化后筛选所获得的耶氏解脂酵母菌株中的多拷贝基因组合也提高了所述菌株中PAI表达量，PAI表达量的提高也会同时进一步促进更多的游离亚油酸(LA)被催化转化为共轭亚油酸。opai/dl2共表达及多拷贝整合对CLA产量的提高具有促进作用。
本发明的内容包括:携带opai/dl2共表达基因的多拷贝表达质粒、含有opai/dl2共表达基因的多拷贝整合的重组耶氏解脂酵母菌株、所述重组菌株的制备方法、以及利用所述菌株发酵制备共轭亚油酸的方法。
本发明优选的技术方案为:将密码子优化后的亚油酸异构酶基因opai (SeqIDN0.1)插入质粒pJU16中。质粒pJU16为本实验室构建，该质粒具有尿嘧啶等位基因作为筛选标签，添加有调控元件16 X UA SIB构成的启动子s p 16，并用多拷贝方式进行整合，该质粒转化到大肠杆菌Escherichia coliDH5 a (E.ColiDH5 a )菌中进行保藏，E.Coli DH5 a (pJU16)现保 藏于江南大学食品生物技术中心菌种库(Culture Collectionof Food Microorganisms, Jiangnan universityCCFM),同时提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏(具体保藏编号为:CGMCC7223))。从E.ColiDH5a菌中获得质粒PJU16后，将亚油酸异构酶基因opai插入质粒pJU16中获得重组质粒pJU16_opai，其中密码子优化后的亚油酸异构酶基因opai的序列如序列表中的序列I所示。将从M.alpinaATCC32222中得到的delta-12脱饱和酶基因dl2插入pJU16_opai中，获得表达质粒pJU16-opa1-dl2，其中delta-12脱饱和酶基因dl2的序列如序列表中的序列2所示。将上述构建后的重组质粒用Not I酶切，得到的表达单元用乙酸锂方法转化进耶氏解脂酵母菌株CCFM-JUL中(该菌为本实验室从野生型菌株CCFM-JUW通过紫外诱变方法得到的尿喃唳缺陷型菌株，现保藏于江南大学食品生物技术中心菌种库(Culture Collectionof Food Microorganisms, Jiangnan universityCCFM),同时提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏(保藏编号为:CGMCC7222))，经同源重组后，从YNBD固体平板中筛选得到CCFM-JU277系列重组菌株。用RT-PCR方法检测转化菌株中表达单元的拷贝数目发现，CCFM-JU277-9菌株拷贝数最多为8个；用气相色谱和气质联用对优化后重组菌株CCFM-JU277的脂肪酸进行检测，结果显示CCFM-JU277-9菌体合成CLA的量最高，可达总脂肪酸的10.1% ;用大豆培养基对CCFM-JU277-9进行的5L发酵罐发酵，结果显示CLA的产量最高出现在40h,达到4.4g/L。
SEQ ID NO:1:密码子优化后的亚油酸异构酶基因(opai)核苷酸序列(1281bp)。
SEQIDN0:2:delta-12 脱饱和酶基因(FADS12，dl2)核苷酸序列(1200bp)。
耶氏解脂酵母CCFM-JUL于2013年I月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCN0.7222。
解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9于2013年3月06日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCN0.7284。
大肠埃希氏菌Escherichia coli DH5 a (pJU16)于2013年I月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC N0.7223。
图1耶氏解脂酵母中表达亚油酸异构酶质粒pJU16-opai_dl2的示意图。
图2pJU16-opa1-dl2 转化子 PCR 验证电泳图(A, B: CCFM-JU277 重组菌中 opai 和dl2的验证M:DNA分子量Marker ;Linel-9:9个CCFM-JU277转化子;PC:阳性对照;NC:阴性对照)。
图3Y.lipolytica多拷贝整合重组菌株中opai/dl2共表达基因的拷贝数。
图4耶氏解脂酵母重组菌株CCFM-JU277系列菌合成tlO，cl2_CLA的产量。
图5在5-L发酵罐中，Y.lipolytica重组菌株利用YN20BDS培养基的生长情况(A)、胞内脂质含量及CLA产量(B)、培养基中脂质含量及CLA产量(C)。
表I引物序列表
权利要求
1.含有opai/dl2共表达基因的重组表达质粒。
2.根据权利要求1所述的重组表达质粒，其特征在于该质粒为pJU16-opa1-dl2。
3.含有权利要求1或2所述的重组表达质粒的宿主细胞。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞是耶氏解脂酵母菌。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述耶氏解脂酵母菌是CCFM-JUL菌，该菌株已于2013年I月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCN0.7222。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述耶氏解脂酵母菌是CCFM-JU277-9，该菌株已于2013年3月06日保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCN0.7284。
7.权利要求1-2任一项所述的重组表达质粒或权利要求3-6任一项所述的宿主细胞在生产共轭亚油酸中的用途,其特征在于所述的共轭亚油酸是tlO，cl2-CLA。
8.利用权利要求 3-6任一项所述的宿主细胞生产共轭亚油酸的方法，其特征在于包括发酵培养所述宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的生产共轭亚油酸的方法，其特征在于在大豆油培养基中发酵生产，具体发酵培养条件如下:CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5%接种量转接至5LYN20BDS培养基中，28°C发酵，发酵时间为30-45小时。
10.根据权利要求9所述的生产共轭亚油酸的方法，其特征在于具体发酵培养条件如下:CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5%接种量转接至5LYN2(IBDS培养基中，28°C发酵，发酵时间为40小时。
全文摘要
本发明将来自高山被孢霉(Mortierella alpine ATCC32222，M.alpina ATCC32222)中的delta-12脱饱和酶基因(FADS12,d12)进行扩增，制备了插入opai/d12共表达基因的多拷贝重组表达质粒和重组耶氏解脂酵母菌株。本发明的重组耶氏解脂酵母菌株通过表达d12基因可以增加内源性底物亚油酸(LA)的量以及发酵培养基中外加大豆油增加底物亚油酸的量，所述菌株中多拷贝整合方式增加了opai基因和d12基因的表达量及转录量，能够进一步提高重组耶氏解脂酵母菌中共轭亚油酸t10，c12-CLA专一异构体的合成量。
文档编号C12R1/645GK103233036SQ20131012017
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者陈卫, 张灏, 张白曦, 李敏, 宋元达, 陈海琴, 赵建新, 陈永泉, 顾震南 申请人:江南大学