7单基因表达盒；
[0043] 图4所示为同源重组示意图；其中，erg5(700)即为SEQ ID N0:7所示核苷酸序列， 代表耶氏解脂酵母内源erg5基因上游700bp序列；UAR3即为SEQ ID N0:8所示核苷酸序 列，代表筛选标记ura3;t0即为SEQ ID N0:9所示核苷酸序列，代表与单基因表达盒同源的 200bp序列；tl即为SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列，代表与单基因表达盒同源的208bp 序列；erg5 (670)即为SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列，代表耶氏解脂酵母内源erg5基因下 游670bp序列；
[0044] 图5所示为SyBE_Y11070028-SyBE_Y11070030三种菌株的摇瓶发酵菜油留醇产量 柱形图，纵坐标为菜油留醇产量；
[0045] 图6所示为SyBE_Yl 1070028菌株在不同碳源下的摇瓶发酵菜油留醇产量柱形图， 纵坐标为菜油留醇产量；Glycerol表示甘油，Glucose表示葡萄糖，Sunflower seed oil表 示葵花籽油；
[0046] 图7所示为SyBE_Y11070028菌株以葡萄糖作为碳源的发酵罐批式补料发酵生长 曲线、葡萄糖浓度变化曲线与菜油留醇产量变化曲线图；曲线A代表细胞生长曲线，曲线B 代表葡萄糖浓度，曲线C代表菜油留醇产量，左侧纵坐标表示菌株0D_值，右侧表示菜油甾 醇产量；
[0047] 图8所示为SyBE_Y11070028菌株以菜籽油作为碳源的发酵罐批式补料发酵生长 曲线与菜油留醇产量变化曲线图；曲线A代表细胞生长曲线，曲线B代表菜油留醇产量，左 侧纵坐标表示菌株〇D_值，右侧表示菜油留醇产量。
【具体实施方式】
[0048] 本发明公开了一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用，本领域技术人员 可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0049] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。
[0050] 实施例1 :单基因表达盒的构建
[0051] 在SEQ ID NO:4所示（优化后的褐家鼠来源dhcr7基因 ）、SEQ ID NO: 5所示（优 化后的水稻来源dhcr7基因）以及SEQ ID NO:6所示（优化后的蟾蜍来源的dhcr7基因） 的核苷酸序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源祀基因，并连接到pUC57-simple质粒上；
[0052] 选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1(SEQ ID NO:27所示序列）和终止子XPR2(SEQ ID NO:28所示序列），在两者之间构建一对反向BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒 两端加上NotI酶切位点，并连接到pUC57-simple质粒上；
[0053] 对连接有外源革E基因的pUC57_simple质粒和连接有表达盒的pUC57_simple质粒 进行BsaI酶切，将外源靶基因连接到表达盒上，构成单基因表达载体（质粒图谱见图2)，转 入大肠杆菌DH5a中，菌落PCR筛选，提质粒，进行NotI酶切验证，验证结果见图3,结果与 预期一致，表明单基因表达载体载体构建成功，通过NotI酶切可获得单基因表达盒，序列 如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14所示，依次表示为褐家鼠来源、水稻来源 和蟾蜍来源的单基因表达盒。
[0054] 本实施例构建的三种不同来源dhcr7基因的单基因表达载体序列参见SEQ ID NO: 29-31所示，依次为褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源。
[0055] 实施例2 :片段l(erg5位点上游基因片段）和片段2(erg5位点下游基因片段）的 获得
[0056] 用SEQ ID NO: 15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO: 7-9所示 核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入pEASY-Blunt质粒，进行 NotI酶切，获得片段1，如SEQ ID NO: 21所示。
[0057] 采用SEQ ID N0:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO: 10-11 所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入pEASY-Blunt质粒，进 行NotI酶切，获得片段2,如SEQ ID NO: 26所示。
[0058] 表 10E-PCR 引物
[0059]
【主权项】
1. 一种重组耶氏解脂酵母菌株，其特征在于，基因组包含SEQ ID N0:l-3任意一项所示 的核苷酸序列。
2. 权利要求1所述重组耶氏解脂酵母菌株在生产菜油留醇中的应用。
3. 权利要求1所述重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括： 步骤1、将SEQ ID N0:4所示、SEQ ID N0:5所示或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列连 接到由启动子和终止子组成的表达盒中，获得单基因表达盒； 步骤2、将SEQ ID N0:7所示、SEQ ID N0:8所示和SEQ ID N0:9的核苷酸序列通过 OE-PCR连接，获得片段1，SEQ ID N0:8所示和SEQ ID N0:9的核苷酸序列均位于SEQ ID N0:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID N0:9所示核苷酸序列位于SEQ ID N0:8所示核苷酸序 列下游； 步骤3、将SEQ ID NO: 10所示和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列通过OE-PCR连接，获 得片段2, SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列下游； 步骤4、将单基因表达盒、片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化，然后 采用SC-drop培养基进行筛选，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株； 其中，步骤1、步骤2和步骤3不分先后顺序。
4. 根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤1包括： 步骤1. 1、在SEQ ID N0:4所示、SEQ ID N0:5所示或SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列 两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到载体上； 选用耶式解脂酵母内源启动子EXPl和终止子XPR2,在两者之间构建一对反向BsaI酶 切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到载体上； 步骤1. 2、对连接有外源靶基因的载体和连接有表达盒的载体进行BsaI酶切，将外源 靶基因连接到表达盒上，而后进行NotI酶切，获得单基因表达盒，序列如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 14 所示。
5. 根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，所述载体为pUC57-simple质粒。
6. 根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤2包括： 采用SEQ ID NO: 15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO: 7-9所示核 苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得片 段 1，如 SEQ ID NO: 21 所示。
7. 根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，步骤3包括： 采用SEQ ID N0:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID N0:10-ll所示 核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获得 片段2,如SEQ ID NO: 26所示。
8. 根据权利要求6或7所述构建方法，其特征在于，所述载体为pEASY-Blunt质粒。
9. 权利要求3-8任意一项所述构建方法构建的重组耶氏解脂酵母菌株。
10. -种生产菜油留醇的方法，其特征在于，将权利要求1或权利要求9所述解脂酵母 菌株经种子培养基活化后接种于发酵培养基中培养，培养后收集菌体细胞提取菜油甾醇。
11. 根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述种子培养基为SC-drop培养基。
12. 根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述发酵培养基选自以下之一： (1)葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L ; (2) 葡萄糖 50g/L，酵母粉 15g/L，蛋白胨 30g/L，KH2P048g/L，MgS046g/L ; (3) 与50g/L葡萄糖等碳摩尔数的甘油，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH2P048g/L， MgS0 46g/L ； (4) 占发酵培养基体积20%的葵花籽油，酵母粉15§/1，蛋白胨3(^/1，腿2?048 §/1， MgS046g/L ； (5) 葵花籽油150mL，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
13.根据权利要求10所述方法，其特征在于，所述培养为在28°C、220-400rpm条件下培 养 120-150h。
【专利摘要】本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用。本发明所述重组耶氏解脂酵母菌株基因组包含SEQ ID NO:1-3任意一项所示的核苷酸序列。本发明通过OE-PCR方法构建单基因表达盒表达的菜油甾醇生物合成途径中关键基因dhcr7，用限制性内切酶将单基因表达盒切下并一次性转入酵母进行片段间的同源重组和基因组特定erg5位点的整合，通过营养缺陷型培养基和基因组PCR筛选完整组装的转化子，获得一种新颖的重组耶氏解脂酵母菌株，能够应用于菜油甾醇的生物合成中，并保持较高产量。
【IPC分类】C12N15-81, C12R1-645, C12N1-19, C12P33-00
【公开号】CN104805027
【申请号】CN201510278974
【发明人】肖文海, 杜昊星, 王颖, 元英进
【申请人】天津大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月27日