专利名称：：通过伴随有沉淀的发酵生产l-谷氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过伴随有沉淀的发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛地用作调味品等的材料。技术背景L-谷氨酸主要是采用所谓的生产L-谷氨酸的并且属于短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属的棒状细菌或其突变林通过发酵方法生产的(《氨基酸发酵》第195-215页，GakkaiShuppan中心，1986)。作为采用其它的细菌菌林通过发酵生产L-谷氨酸的方法，现有公知的采用属于芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉属等的微生物的方法(美国专利3,220,929)，采用属于假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属、念珠菌属等的微生物的方法(美国专利3,563,857)，采用属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、产气气杆菌(目前称作产气肠杆菌)等的微生物的方法(日本专利出版物(kokoku)32-9393)，采用大肠杆菌突变林的方法(日本专利申请延迟公开(kokai)5-244970)等等。另外，本发明的发明人已经提出了一种通过采用属于克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或泛菌属的微生物生产L-谷氨酸的方法(日本专利申请延迟公开2000-106869)。此外，已经公开了通过采用重组DM技术增强L-谷氨酸生物合成酶的活性来改善L-谷氨酸生产能力的多种技术。例如，据报道引入编码来源于大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的柠檬酸合酶的基因对于增强棒杆菌属或短杆菌属细菌中的L-谷氨酸生产能力是有效的(日本专利出版物7-121228)。另外，日本专利申请延迟公开61-268185公开了一种携带重组DNA的细胞，所述的重组DNA含有来源于棒杆菌属细菌的谷氨酸脱氢酶基因。再者，日本专利申请延迟公开63-214189公开了一种改善L-谷氨酸生产能力的技术，是通过扩增谷氨酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、乌头酸水合酶基因以及柠檬酸合酶基因来实现的。尽管通过培育前面提到的微生物或者改进生产方法已经大大地提高了L-谷氨酸的生产能力，但是仍需要在更低成本下开发更为有效地生产L-谷氨酸的方法，以便适应未来不断增长的需要。目前已知有一种方法，其中进行发酵时结晶L-氨基酸在培养基中累积(日本专利申请延迟公开62-288)。在该方法中，通过使培养物中积累的L-氨基酸沉淀来维持培养中L-氨基酸的浓度低于某一水平。具体地讲，在发酵的过程中通过调节培养物的温度和pH或者向培养基中加入表面活性剂来使L-色氨酸、L-酪氨酸或L-亮氨酸沉淀。当如上所述已知伴随有使L-氨基酸沉淀的发酵方法的同时，适合于该方法的氨基酸为那些具有相对低的水溶性的氨基酸，并且已知没有将该方法应用到具有高水溶性的氨基酸(如L-谷氨酸)的例子。另外，培养基必须具有低的pH以沉淀L-谷氨酸。但是，L-谷氨酸产生菌(如上面提到的那些细菌)不能在酸性条件下生长，因而L-谷氨酸的发酵是在中性条件下进行的(美国专利3，220，929和3，032，474;ChaoK.C.&FosterJ.W.《细菌学杂志》77,第715-725页(1959))。于是，通过伴随着沉淀的发酵来生产L-谷氨酸是未知的。此外，已知最嗜酸的细菌的生长受到有机酸(如醋酸、乳酸和琥珀酸)的抑制(Yasuro0shima编辑《极端环境微生物手册》第231页，科学论坛；BorichewskiR.M.《细菌学杂志》93，笫597-599页(1967)等)。因此，据认为许多微生物在酸性条件下对同样是有机酸的L-谷氨酸都是易感的，并且也没有报道尝试过对在酸性条件下显示L-谷氨酸生产能力的微生物的研究。
发明内容在以上提到的现有的情况下，本发明的一个目的在于搜寻和培育在低pH的条件下产生L-谷氨酸的微生物，以及提供一种采用得到的微生物通过伴随着使L-谷氨酸沉淀的发酵来生产L-谷氨酸的方法。本发明的发明人在研究通过发酵提高L-谷氨酸生产能力的过程中认识到由培养基中积累的高浓度L-谷氨酸对生产的抑制是提高生产能力的障碍之一。例如，细胞具有L-谷氨酸的分泌系统和吸收系统。但是，如果一旦分泌到培养基中的L-谷氨酸被再次掺入到细胞中的话，结果不仅是生产率下降，而且L-谷氨酸的生物合成反应也受到抑制。为了避免由所述的高浓度L-谷氨酸积累导致的生产抑制，本发明的发明人筛选出了可以在酸性条件下并且在高浓度L-谷氨酸存在的情况下增殖的微生物。结果，他们成功地从土壤中分离出具有所述特性的微生物，并从而完成了本发明。因此，本发明提供了如下的内容。(1)一种微生物，所述的微生物可以在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH下代谢碳源，并且该微生物在所述pH下在所述液体培养基中具有以超过对应于所述饱和浓度的量积累L-谷氨酸的能力。(2)根据(l)的微生物，所述的微生物可以在所述液体培养基中生长。(3)根据(1)或(2)的微生物，其中所述的pH不高于5.0。(4)根据(l)-(3)之任一的微生物，所述的微生物至少具有下列特征之一(a)所述微生物在催化L-谷氨酸生物合成反应的酶活性方面有所增强；以及(b)所述微生物在催化由L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生除L-谷氨酸之外化合物的酶活性方面有所降低或缺陷。(5)根据(4)的微生物，其中所述催化L-谷氨酸生物合成反应的酶至少为一种选自柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶和谷氨酸脱氬酶的酶。(6)根据(4)或(5)的微生物，其中所述催化由L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生除L-谷氨酸之外化合物的酶为a-酮戊二酸脱氢酶。(7)根据(l)-(6)之任一的微生物，其中所述的微生物属于肠杆菌属。(8)根据(7)的微生物，所述的微生物为成团肠杆菌。(9)根据(8)的微生物，所述的微生物当在含糖的培养基中培养时与野生菌林相比具有导致更少地向胞外分泌粘性物质的突变。(10)—种用于通过发酵生产L-谷氨酸的方法，所述方法包括在液体培养基中培养如(1)-(9)之任一定义的微生物，其中将所述培养基的PH调节到使L-谷氨酸沉淀的pH下，以便在所述培养基中产生和积累L—谷氨酸并使L-谷氨酸沉淀。(11)一种用于筛选适合于在液体培养基中通过伴随有使L-谷氨酸沉淀的发酵来生产L-谷氨酸的微生物的方法，所述方法包括将含有微生物的样品接种到含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的酸性培养基中，并选出可以代谢所述碳源的菌林。(12)根据(ll)的方法，其中将可以在所述培养基中生长的菌林选为可以代谢所述碳源的菌林。(13)根据(11)或(12)的方法，其中所述培养基的pH不高于5.0。根据本发明的方法，L-谷氨酸可以通过伴随有使L-谷氨酸沉淀的发酵来生产。结果，培养基中的L-谷氨酸维持在低于某一浓度下，并且可以生产出来L-谷氨酸而不遭受高浓度L-谷氨酸的产物抑制。图1显示出来源于成团肠杆菌pTWVEK101的DNA片段的限制图。图2显示出由来源于成团肠杆菌和来源于大肠杆菌的sucA基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列的比较，上面的序列成团肠杆菌；下面的序列大肠杆菌(下文中将采用相同的定义)。图3显示出由来源于成团肠杆菌和来源于大肠杆菌的sucB基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列的比较。图4显示出由来源于成团肠杆菌和来源于大肠杆菌的sdhB基因的核苷酸序列推定的氨基酸序列的比较。图5显示出由来源于成团肠杆菌和来源于大肠杆菌的sucC基因的核苦酸序列推定的氨基酸序列的比较。图6显示出具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建。图7显示出具有广宿主谱质粒RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。图8显示出具有广宿主谱质粒RSF1010的复制起点、四环素抗性基因、gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。图9显示出具有gltA基因的质粒pSTVCB的构建。具体实施方式下面将详细地说明本发明。本发明的微生物是这样的一种微生物(l)它可以在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH下代谢碳源，并且(2)该微生物在所述pH下在所述液体培养基中具有以超过对应于所述饱和浓度的量积累L-谷氨酸的能力。术语"饱和浓度，，意指当培养基被L-谷氨酸饱和时溶解在液体培养基中的L-谷氨酸的浓度。下面将要描述一种用于筛选可以在特定的pH下在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中代谢碳源的微生物的方法。将含有微生物的样品接种到具有特定pH的含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，并且选出可以代谢所述碳源的菌林。对特定的pH并不作特别的限制，但其通常不高于约5.0、优选不高于约4.5、更优选不高于约4.3。通过伴随着使L-谷氨酸沉淀的发酵，使用本发明的微生物来生产L-谷氨酸。如果pH太高的话，那么使微生物生产出足以沉淀的L-谷氨酸就变得困难起来。因此，pH优选在上面提到的范围内。如果降低了含L-谷氨酸的水溶液的pH的话，那么在y-羧基的pKa附近(4.25，25TC)L-谷氨酸的溶解度明显下降。溶解度在等电点(pH3.2)时变得最低，并且沉淀出超过对应于饱和浓度量的L-谷氨酸。在取决于培养基组成的同时，在大约30TC下，L-谷氨酸在pH3.2下通常以10-20g/L的量溶解，在pH4.0下以30-40g/L的量溶解，在pH4.7下以50-60g/L的量溶解。通常不必使pH低于3.0，这是因为当pH开始低于某一数值时L-谷氨酸的沉淀作用出现平稳段。但是，pH可以低于3.0。另外，"可以代谢碳源，，的微生物的说法意指它可以增殖或者即使它不能增殖但仍可以消耗碳源，即表示它代谢诸如糖或有机酸这样的碳源。具体地讲，例如当在合适的温度下(例如28匸、37t:或50t))在pH5.0-4.0下(优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，仍然更优选pH4.0)在含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时如果微生物增殖的话，那么该微生物可以代谢培养基中的碳源。此外，例如当在合适的温度下(例如28X:、37匸或50*C)在pH5.0-4.0下(优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，仍然更优选pH4.0)在含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时即使微生物不增殖的话，那么消耗培养基中碳源的微生物为可以代谢培养基中的碳源的微生物。可以代谢碳源的微生物包括可以在所述液体培养基中生长的微生物。微生物"可以生长"的说法意指它可以增殖或者即使它不能增殖但仍可以生产出L-谷氨酸。具体地讲，例如当在合适的温度下(例如28"C、37TC或50"C)在pH5.0-4.0下(优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，仍然更优选pH4.O)在含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时如果微生物增殖的话，那么该微生物可以在培养基中生长。此外，例如当在合适的温度下(例如28TC、37TC或501C)在pH5.0-4.0下(优选pH4.5-4.0，更优选pH4.3-4.0，仍然更优选pH4.0)在含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时即使微生物不增殖的话，那么在培养基中增加了L-谷氨酸的量的微生物为可以在所述培养基中生长的微生物。上述的选择可以在相同的条件下或者在改变pH或L-谷氨酸浓度的条件下重复两次或多次。最初的选择可以在含有低于饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行，此后接下来的选择可以在含有饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行。此外，可以选出具有有利特性(诸如突出的增殖率)的菌林。除了上述特性之外，本发明的微生物还具有在液体培养基中以超过对应于L-谷氨酸饱和浓度的量积累L-谷氨酸的能力。前面提到的液体培养基的PH优选与用于筛选具有前述特性(1)的微生物的培养基是相同的或接近的。通常当pH变低时，微生物变得对高浓度的L-谷氨酸易感。因此，从对L-谷氨酸的抗性的观点来看优选pH是不低的，但从伴随着使之沉淀的L-谷氨酸的生产来看低的pH则是优选的。为了满足这些条件，pH可以在3-5的范围内，优选4-5，更优选4.0-4.7，仍然更优选4.0-4.5,特别优选4.0-4.3。作为本发明的微生物或者其所用的培育材料，可以提到的例如有属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、泛菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、脂环酸杆菌属、芽孢杆菌属、糖酵母属等的微生物。在这些微生物中，属于肠杆菌属的微生物是优选的。以下将主要针对属于肠杆菌属的微生物来说明本发明的微生物，但本发明可以应用到属于其它属的微生物中并且不限于肠杆菌属。作为属于肠杆菌属的微生物，可以具体提到的有成团肠杆菌，优选成团肠杆菌AJ13355菌林。作为一种可以在低pH下在含有L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌林，该菌林是从位于日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤中分离出来的。AJ13355的生理特性如下(1)革兰氏染色阴性(2)抵抗氧的行为兼性厌氧(3)过氧化氢酶阳性(4)氧化酶阴性(5)硝酸盐还原能力阴性(6)伏-波试验阳性(7)曱基红试验阴性(8)脲酶阴性(9)丐l哚的产生阳性(10)游动性游动的(11)在TSI培养基中H2S的产生弱的活性(12)P-半乳糖苷酶阳性(13)同化糖的性质阿拉伯糖阳性蔗糖阳性乳糖阳性木糖阳性山梨醇阳性肌醇阳性海藻糖阳性麦芽糖阳性葡萄糖阳性侧金盏糖醇阴性棉子糖阳性水杨苦阴性蜜二糖阳性(14)同化甘油的性质阳性(15)同化有机酸的性质柠檬酸阳性酒石酸阴性葡糖酸阳性醋酸阳性丙二酸阴性(16)精氨酸脱水酶阴性(17)鸟氨酸脱羧酶阴性(18)赖氨酸脱羧酶阴性(19)苯丙氨酸脱氨酶阴性(20)色素的形成黄色(21)明胶液化能力阳性(22)生长的pH:在pH4.0下有可能生长，在pH4.5-7时生长良好(23)生长温度在25'C下生长良好，在30匸下生长良好，在37'C下生长良好，在42'C下有可能生长，在45"C下不可能生长。基于这些细菌学的特性，将AJ13355确定为成团肠杆菌。将成团肠4干菌AJ13355(EnterobacteragglomeransAJ13355)于1998年2月19曰保藏在通商产业省工业技术生命工学工业技水研究所(邮政编码305-8566，1-3，Higashil-chome，Tsukuba-shi,Ibaraki，日本),并得到了射6入册号为FERMP-16644。然后遵照布达佩斯条约的条款于1999年l月U日将其转为国际保藏，并得到了射己入册号为FERMBP-6614。本发明的微生物可以是最初就具有L-谷氨酸生产能力的微生物，或者为通过采用突变处理、重组DNA技术等的培育赋予了或增强了L-谷氨酸生产能力的微生物。例如通过提高催化L-谷氨酸生物合成反应的酶活性，可以赋予或增强L-谷氨酸的生产能力。通过降低催化由L-谷氨酸生物合成途径分支的并产生除L-谷氨酸之外化合物的反应的酶活性或者使该活性缺陷，也可以增强L-谷氨酸的生产能力。作为催化L-谷氨酸生物合成反应的酶，可以提到的有谷氨酸脱氬酶(下文中又称作"GDH")、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(下文中又称作"CS")、砩酸烯醇丙酮酸羧化酶(下文中又称作"PEPC，，)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油搭-3-磷酸脱氬酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、果糖磷酸激酶、葡糖磷酸异构酶等。在这些酶当中，CS、PEPC和GDH的一种、两种或三种是优选的。此外，优选的是在本发明的微生物中所有三种酶，即CS、PEPC和GDH的活性均增加。特别地乳发酵短杆菌的CS是优选的，这是因为它不受a-酮戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。为了增强CS、PEPC或GDH的活性，例如可以将编码CS、PEPC或GDH的基因克隆在合适的质粒上并且用得到的质粒转化宿主微生物。在转化的菌林细胞中编码CS、PEPC或GDH的基因(下文中分别简写为"gltA基因"、"ppc基因，，和"gdh基因，，)的拷贝数增加，从而导致CS、PEPC或GDH活性的增加。将克隆的gltA基因、ppc基因和gdhA基因单独地或其任意两种或三种组合引入到前面提到的起始亲代菌林中。当引入两种或三种所述基因时，可以把两种或三种基因克隆在一种质粒上并引入宿主中，或者分别克隆在可以共存的两种或三种质粒上并引入宿主中。可以将编码同种酶的、但来源于不同微生物的两种或多种基因引入到同一宿主中。对上述的质粒并没有特别的限制，只要它们在属于例如肠杆菌属等的微生物细胞中可以自主复制，但是例如可以提到的有pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218，pACYC177，pACYC184等。除这些之外，也可以使用噬菌体DNA的栽体。转化可以通过例如下列方法进行D.M.Morrison的方法(《酶学中的方法》68，326(1979));其中通过用氯化钙处理受体细菌细胞来增加DNA通透性的方法(MandelM.与HigaA.《分子生物学杂志》53，159(1970));电穿孔(MillerJ.H."细菌遗传学中的短过程，，冷泉港实验室出版社，美国，1992)等。通过使gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多拷贝存在于前面提到的作为宿主的起始亲代菌林的染色体DNA上，也可以增加CS、PEPC或GDH的活性。为了在属于肠杆菌属等微生物的染色体DNA上引入gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝，可以使用其多拷贝存在于染色体DM上的序列(如存在于转座因子末端上的重复DNA和反向重复序列)。另一方面，可以通过利用含gUA基因、ppc基因或gdhA基因的转座子的转移将所述基因的多拷贝引入到染色体DNA上。结果，增加了转化的菌林细胞中gltA基因、ppc基因或gdhA基因的拷贝数，从而增加了CS、PEPC或GDH的活性。作为增加了拷贝数的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的来源的微生物，可以使用任何生物体，只要它具有CS、PEPC或GDH活性。其中作为原核生物的细菌，例如那些属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属、泛菌属、沙雷氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属和芽孢杆菌属的细菌是优选的。作为具体的例子，可以提到的有大肠杆菌、乳发酵短杆菌等。gltA基因、ppc基因和gdhA基因可以从上述微生物的染色体DNA中得到。通过使用在CS、PEPC或GDH活性方面缺陷的突变林，可以获得gltA基因、ppc基因和gdhA基因，从而从前述微生物的染色体DNA中分离出补充了辅源营养的DNA片段。由于已经阐述了这些埃希氏菌属和棒杆菌属细菌基因的核苷酸序列(《生物化学》22，第5243-5249页(1983);《生物化学杂志》95，第909-916页(1984);《基因》27，第193—199页(1984);《微生物学》140，第1817-1828页(1994);《分子基因遗传学》218，第330-339页(1989);《分子生物学》6，第317-326页(1992))，因此它们也可以通过PCR利用基于各核苷酸序列合成的引物并以染色体DNA为模板来得到。除了前面提到的扩增基因之外，也可以通过增强gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表达来提高CS、PEPC或GDH的活性。例如，可以通过用其它更强的启动子置换gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子来增强表达。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、X噬菌体的PK启动子和Pl启动子等已知为强启动子。把启动子被置换的gltA基因、ppc基因和gdhA基因克隆到质粒上并引入到宿主生物体中，或者通过采用重复DM、反向重复序列、转座子等引入到宿主生物体的染色体DM上。通过用其它更强的启动子置换染色体上gUA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子(参见WO87/03006和日本专利申请延迟公开61-268183)或者在各基因编码序列的上游插入一个强启动子(参见《基因》29，第231-241页(1984))，也可以增强CS、PEPC或GDH的活性。具体地讲，在含有启动子被更强的启动子或其部分置换的gUA基因、ppc基因或gdhA基因的DNA和染色体上相应基因之间可以进行同源重组。催化由L-谷氨酸生物合成途径分支的并产生除L-谷氨酸之外化合物的反应的酶的例子包括ot-酮戊二酸脱氲酶(下文中又称作"ocKGDH")、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合成酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。在这些酶当中，otKGDH是优选的。为了获得在属于肠杆菌属等的微生物中前述酶活性的降低或缺陷，通过普通的诱变或者遗传工程方法，可以将导致所述酶的胞内活性降低或缺陷的突变引入前述酶的基因中。诱变方法的例子包括例如采用X光或紫外光照射的方法、用诸如N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍之类的诱变剂处理的方法等。向该基因中引入突变的位点可以在编码酶蛋白的编码区中或者在用于调节表达的区域(如启动子)中。遗传工程方法的例子包括例如采用基因重组、转导、细胞融合的方法等。例如，把抗药基因插入克隆的靶基因中，以制备出已经丧失了其功能的基因(缺陷基因)。随后，将该缺陷基因引入宿主微生物的细胞中，并且通过采用同源重组以前面提到的缺陷基因置换染色体上的靶基因(基因破坏)。通过测量从候选菌林得到的细胞提取物或其纯化部分的酶活性并且与野生菌林相比较，可以确定目标酶的胞内活性的降低或缺陷以及所述活性下降的程度。例如，otKGDH的活性可以由Reed等人的方法来测量(ReedL.J.与MukherjeeB.B.《酶学中的方法》13，第55-61页(1969))。取决于目标酶，目标突变林可以基于突变抹的表型来选择。例如，在有氧条件下在含葡萄糖的基本培养基或含醋酸或L-谷氨酸作为唯一碳源的基本培养基中，缺陷ocKGDH活性或aKGDH活性降低的突变林不能增殖或者表现出显著下降的增殖率。但是，通过向含有葡萄糖的基本培养基中添加琥珀酸或赖氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸，即使在相同的条件下仍可以进行正常的增殖。通过利用这些现象作为指示，可以选出具有降低了otKGDH活性或缺陷该活性的突变林。在W095/34672中详细地描述了一种通过采用同源重组来制备乳发酵短杆菌的aKGDH基因缺陷林的方法。类似的方法可以应用于其它的微生物。此外，在《分子克隆第2版》(冷7^出版社，1989)等文献中详细地描述了一些技术，诸如基因的克隆以及DM的切割和连接、转化等等。突变林的一个具体:子，可以提到的有成一团肠^菌AJ13356。将成团肠杆菌AJ13356(EnterobacteragglomeransAJ13356)于1998年2月19曰保藏在通商产业省工业技术生命工学工业技^M9f究所(邮政编码305-8566,1-3，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，曰本)，并得到了登记入册号为FERMP-16645。然后遵照布达佩斯条约的条款于1999年1月11日将其转为国际保藏，并得到了登记入册号为FERMBP-6615。由于aKGDH-El亚单位基因(sucA)破坏的结果，成团肠杆菌AJ13356缺陷otKGDH活性。当在含糖的培养基中培养成团肠杆菌(本发明所采用的微生物的一个例子)时，有粘性物质向胞外分泌，从而造成了低的操作效率。因此，当使用具有这种分泌粘性物质特性的成团肠杆菌时，优选使用与野生菌林相比分泌较少粘性物质的突变林。诱变方法的例子包括例如采用X光或紫外光照射的方法、用诸如N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍之类的诱变剂处理的方法等。通过在含糖的培养基(例如含5g/L葡萄糖的LB培养基平板)中接种经诱变的细菌细胞，在把平板倾斜大约45度的情况下培养它们并且选出没有显现出液体向下流动的菌落，可以选出粘性物质的分泌有所减少的突变林。在本发明中，可以以任意的顺序赋予或增强L-谷氨酸的生产能力和赋予其它有利的特性(如上迷更少地分泌粘性物质的突变)。通过在将pH调节到使L-谷氨酸沉淀的pH下的液体培养基中培养本发明的微生物，伴随着L-谷氨酸在培养基中的沉淀可以生产并积累L-谷氨酸。通过在中性pH下开始培养、然后在使L-谷氨酸沉淀的pH下结束培养，也可以沉淀出L-谷氨酸。使L-谷氨酸沉淀的pH意指当微生物生产并积累L-谷氨酸时使L-谷氨酸沉淀的pH值。作为以上提到的培养基，可以使用含有碳源、氮源、无机盐和有机痕量营养物(如视需要有氨基酸和维生素)的常用的营养培养基，只要其pH被调节到使L-谷氨酸沉淀的pH。可以使用合成培养基或天然培养基。培养基中所用的碳源和氮源可以是任意的此类物质，只要它们可以被培养的菌林所利用。作为碳源，使用糖，比如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜。另外，可以各自单独地或与另一种碳源混合使用有机酸(如醋酸和柠檬酸)。作为氮源，使用氨、铵盐(如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵)、硝酸盐等等。作为有机痕量营养物，使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、那些含有这些物质的物质(如胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白降解产物)。当使用对代谢或生长而言需要氨基酸等的营养缺陷型突变林时，必须补充所需的营养物。作为无机盐，使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。对于培养方法来说，在控制发酵温度为20-421C以及pH为3-5(优选4-5，更优选4-4.7，特别优选4-4.5)的情况下通常进行通气培养。于是在经过大约10小时至4天的培养后，在培养物中积累了大量的L-谷氨酸。在培养基中沉淀出超过对应于饱和浓度的量的积累的L-谷氨酸。在培养完成后，可以通过离心、过滤等手段收集培养物中沉淀的L-谷氨酸。可以根据已知的方法收集培养基中溶解的L-谷氨酸。例如，可以通过浓缩培养肉汤以使L-谷氨酸结晶来分离L-谷氨酸或者通过离子交换层析等加以分离。在结晶后，在培养肉汤中沉淀出来的L-谷氨酸可以与已溶于培养基中的L-谷氨酸一同分离出来。根据本发明的方法，沉淀出超过对应于饱和浓度的量的L-谷氨酸，并且培养基中溶解的L-谷氨酸的浓度维持在一个恒定的水平。因此，可以减少高浓度的L-谷氨酸对微生物的影响。于是，就有可能培育出具有进一步改善L-谷氨酸生产能力的微生物。此外，由于L-谷氨酸作为晶体而沉淀出来，因此抑制了由L-谷氨酸的积累导致的培育肉汤的酸化，并从而可以显著地减少用于维持培养pH所用的碱的数量。下面，参照下列实施例将更加具体地说明本发明。<1>筛选在酸性环境下具有L-谷氨酸抗性的微生物如下进行在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物的筛选。把从自然界(包括土壤、水果、植物体、河水)中获得的大约500个样品的每个样品均以1g的量悬浮在5mL的无菌水中，把其中的200jliL涂覆在用盐酸调节其pH至4.0的20mL固体培养基上。所述培养基的组成如下3g/L葡萄糖、lg/L(NH4)2S04、0.2g/LMgS04.7H20、0.5g/LKH2P04、0.2g/LNaCl、0.1g/LCaCl2.7H20、0.01g/LFeS04.7H20、0.01g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4迈g/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、50|ng/L生物素、50iug/L泛酸钙、50pg/L叶酸、50iug/L肌醇、50pg/L烟酸、50jug/L对氨基苯甲酸、50ng/L盐酸吡哆醇、50pg/L核黄素、50网/L盐酸硫胺素、50mg/L放线菌酮、20g/L琼脂。将在其上平铺了上述样品的铺制的培养基在28X:、371C或50TC下培养2-4天，并且获得了各自形成菌落的378个菌林。接下来，把如上所述得到的各菌林都接种到长16.5cm、直径为14隨的试管中，该试管含有包含饱和浓度的L-谷氨酸的3mL液体培养基(用盐酸调节至pH4.0)，并在振荡下在281C、371C或50TC下培养24小时-3天。然后选出生长的菌林。前面提到的培养基的组成如下40g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2S04、0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、0.25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、2g/L酵母提取物。于是，成功地得到了在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的78个微生物菌林。<2>从具有L-谷氨酸抗性的微生物中选出在酸性环境中具有突出的生长速率的菌林把如上所述获得的在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的各种微生物各自接种到长16.5cm、直径为14mm的含有3mL培养基(用盐酸调节至pH4.0)的试管中，该培养基是通过向M9培养基(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.与Maniatis，T.《分子克隆》冷泉港实验室出版社，1989)中添加20g/L谷氨酸和2g/L葡萄糖得到的，并且随时间的迁移测量培养基的浊度以选出具有有利生长速率的菌林。结果，作为呈现出有利生长的菌林，从位于日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤中得到了AJ13355菌林。基于其上述细菌学特性，该菌林被确定为成团肠杆菌。<3>从成团肠杆菌AJ13355菌林中获得较少分泌粘性物质的菌林由于当在含有糖的培养基中培养时成团肠杆菌AJ13355菌林向胞外分泌粘性物质，因此操作效率是不利的。因而，通过紫外线照射的方法获得较少分泌粘性物质的菌抹(Miller,J.H.等人《细菌遗传学中的短过程实验指南》笫150页，冷泉港实验室出版社，1992)。在距离60瓦紫外光灯60cm远的位置处用紫外线照射成团肠杆菌AJ13355菌林2分钟，并且在LB培养基中培养过夜以巩固突变。稀释诱变的菌林，并将其接种在含有5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中，从而每个平板中大约有IOO个菌落出现，在将平板倾斜大约45度的情况下在30"C下培养过夜，然后选出没有显现出粘性物质向下流动的20个菌落。作为满足下列条件的菌林，所述的条件为即使在含5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中传代培养5次之后仍没有出现回复突变林，并且应当观察到其生长等同于亲代菌林在LB培养基中、在含有5g/L葡萄糖的LB培养基中以及在向其中添加了20g/LL-谷氨酸和2g/L葡萄糖并用盐酸调节其pH至4.5的M9培养基(Sambrook，J.等人《分子克隆第2版》冷泉港出版社，1989)中的生长，从以上选出的菌林中选出SC17菌林。<4>从成团肠杆菌SC17菌林构建谷氨酸产生菌(1)从成团肠杆菌SC17菌林制备aKGDH缺陷林从成团肠杆菌SC17菌林制备出缺陷aKGDH并具有增强了L-谷氨酸生物合成系统的菌株。(i)克隆成团肠杆菌AJ13355菌林的aKGDH基因(下文中称作"sucAB，，)通过从成团肠杆菌AJ13355菌林的染色体DM中选出补充了大肠杆菌aKGDH-El亚单位基因(下文中称作"sucA，，)缺陷林之不同化醋酸特性的DNA片段来克隆成团肠杆菌AJ13355菌林的sucAB基因。通过采用当从大肠杆菌中提取染色体DNA时常用的方法分离出成团肠杆菌AJ13355菌林的染色体DM(《生物工程实验教材》由日本生物科学与生物工程协会编写，第97-98页，Baifukan，1992)。用作载体的pTWV228(抗氨爷青霉素)是由TakaraShuzo有限公司商购的载体。通过使用T4连接酶连接用EcoT221消化的AJ13355菌林的染色体DNA和用Pstl消化的PTWV228，并将其用于转化sucA缺陷的大肠杆菌JRG465菌林(Herbert,J.等人《分子基因遗传学》105，182(1969))。从以上获得的转化菌林中选出在醋酸基本培养基中生长的菌林，从中提取出质粒并命名为pTWVEK101。除了同化醋酸的特性之外，携带有pTWVEK101的大肠杆菌JRG465菌抹还恢复了对琥珀酸或L-赖氨酸和L-曱硫氨酸的辅源营养。这表明pTWVEK101含有成团肠杆菌的sucA基因。图1显示出pTWVEK101中来源于成团肠杆菌的DNA片段的限制图。图1中画有阴影线部分的测定的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在该序列中，发现了被认为是两个全长0RFs的核苷酸序列以及被认为是0RFs的部分序列的两个核苷酸序列。SEQIDN0S:2-5显示出可以从5，端的顺序由这些0RFs或部分序列编码的氨基酸序列。对这些序列进行同源性检索的结果表明测定了核苷酸序列的部分含有琥珀酸脱氢酶铁-硫蛋白基因(sdhB)、全长sucA和aKGDH-E2亚单位基因(sucB)的3，-端部分序列，以及琥珀酰CoA合成酶p亚单位基因(sucC)的5，-端部分序列。由这些核苷酸序列推定的氨基酸序列与那些来源于大肠杆菌的序列(《欧洲生物化学杂志》141，第351-359页(1984);《欧洲生物化学杂志》》141，第361-374页(1984);《生物化学》24，第6245-6252页(1985))比较的结果示于图2-图5中。因此，氨基酸序列各自显示出非常高的同源性。另据发现与大肠杆菌中的一样(《欧洲生物化学杂志》141，第351-359页(1984);《欧洲生物化学杂志》141，第361-374页(1984);《生物化学》24，第6245-6252页(1985))，sdhB-sucA-sucB-sucC的蔟构建在成团肠杆菌的染色体上。(ii)从成团肠杆菌SC17菌林中获得aKGDH缺陷林通过采用如上所述获得的成团肠杆菌的sucAB基因进行同源重组，以获得成团肠杆菌的aKGDH缺陷林。在用Sphl消化pTWVEK101以切下含sucA的片段后，用克列诺片段(TakaraShuzo有限公司)使该片段的末端成为平端，并且通过采用T4DM连接酶(TakaraShuzo有限公司)将其与用EcoRI消化并用克列诺片段使末端成为平端的pBR322相连。通过采用该酶在基本上位于sucA中心处的限制酶BglII识别位点上消化得到的质粒，用克列诺片段使末端成为平端，然后通过采用T4DNA连接酶再次连接。据认为sucA基因不起作用，这是因为通过上述过程移码突变被引入到新构建的质粒的sucA之中。用限制酶ApaLI消化如上所述构建的质粒，并进行琼脂糖凝胶电泳以回收含有向其中引入了移码突变的sucA和来源于pBR322的四环素抗性基因的DNA片段。通过采用T4DM连接酶再次连接回收的DNA片段，以构建出用于破坏otKGDH基因的质粒。通过电穿孔(Miller,J.H.《细菌遗传学中的短过程；手册》第279页，冷泉港实验室出版社，美国，1992)将如上所述得到的用于破坏ocKGDH基因的质粒用来转化成团肠杆菌SC17菌林，并且通过采用四环素抗性作为指示获得了这样一种菌林，其中通过质粒的同源重组位于染色体上的sucA被突变型的sucA置换。将得到的菌林命名为SC17sucA菌抹。为了证实SC17sucA菌林aKGDH活性的缺陷，通过Reed等人的方法(Reed，L.J.与Mukherjee，B.B.《酶学中的方法》13，第55-61页(1969))经过使用在LB培养基中培养直至对数生长期的菌林细胞来测量酶活性。结果，由SC17菌林中测得aKGDH的活性为0.073(AABS/min/mg蛋白)，而从SC17sucA菌林中检测不到aKGDH的活性，从而证实如预期的那样缺陷了sucA。(2)增强成团肠杆菌SC17sucA菌林的L-谷氨酸生物合成系统接下来，将来源于大肠杆菌的柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和谷氨酸脱氢酶基因引入SC17sucA菌林中。(i)制备携带有来源于大肠杆菌的gUA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒通过参照图6和图7将说明制备携带有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒的步骤。用HindIII和Sphl消化携带有来源于大肠杆菌的gdhA基因的质粒pBRGDH(日本专利申请延迟公开7-203980)，并通过T4DNA聚合酶处理使两个末端都成为平端，然后纯化并回收携带有gdhA基因的DNA片段。单独地用Xbal消化携带有来源于大肠杆菌的gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(W097/08294)，然后通过采用T4DNA聚合酶使两个末端都成为平端。将该片段与以上纯化的携带gdhA基因的DNA片段混合，并通过采用T4连接酶连接以得到质粒p匿CPG，它对应于还含有gdhA基因的pMWCP(图6)。与此同时，用Notl消化具有广宿主谱质粒RSF1010的复制起点的质粒pVIC40(日本专利申请延迟公开8-047397)，用T4DM聚合酶处理并用Pstl消化。用EcoT141消化pBR322，用T4DNA聚合酶处理并用Pstl消化。混合这两种产物，并通过采用T4连接酶连接以获得携带有RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图7)。随后，用EcoRI和PstI消化pMWCPG，并且纯化和回收携带有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片段。类似地用EcoRI和Pstl消化RSF-Tet，并且纯化和回收携带有RSF1010的复制起点的DNA片段。混合这两种产物，并通过采用T4连接酶连接以获得质粒RSFCPG，该质粒对应于含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(图8)。通过补充来源于大肠杆菌的gltA、ppc或gdhA基因缺陷林的辅源营养并测量各种酶的活性，经证实得到的质粒RSFCPG表达gltA基因、ppc基因和gdhA基因。(ii)制备携带有来源于乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒如下构建出携带有来源于乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒。通过采用携带有SEQIDN0S:6和7所示核苷酸序列的引物DM并以乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA为模板进行PCR以获得约3kb的gltA基因片段，其中所述的引物DNA是基于谷氨酸棒杆菌gltA基因的核苷酸序列(《微生物学》140，笫1817-1828页(1994))制备的。将该片段插入到用Smal消化的质粒pHSG399(购自TakaraShuzo有限公司)以得到质粒pHSGCB(图9)。随后，用HindIII消化pHSGCB，并将切下的约3kb的gltA基因片段插入到用HindIII消化的质粒pSTV29(购自TakaraShuzo有限公司)以得到质粒pSTVCB(图9)。通过测量成团肠杆菌AJ13355菌林中的酶活性，经证实得到的质粒pSTVCB表达glU基因。(iii)将RSFCPG和pSTVCB引入SC17sucA菌林中通过电穿孔用RSFCPG转化成团肠杆菌SC17sucA菌林，以便得到具有四环素抗性的转化SC17sucA/RSFCPG菌林。进一步通过电穿孔用pSTVCB转化SC17sucA/RSFCPG菌林，以便得到具有氯霉素抗性的转化<4>获得在低pH的环境下对L-谷氨酸具有改善的抗性的菌林从成团肠杆菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌林中分离出在低pH的环境下对高浓度L-谷氨酸具有改善的抗性的菌林(下文中又称作"低pH下高浓度谷氨酸抗性菌林")。在30'C下在LBG培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、5g/L葡萄糖)中培养SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌林过夜，适当地稀释用盐水洗涤的细胞并将其平铺在M9-E培养基(4g/L葡萄糖、17g/LNa2HP04-12H20、3g/LKH艮0.5g/LNaCl、1g/LNH4C1、10mMMgSOo10一CaCl2、50mg/LL-赖氨酸、50mg/LL-甲硫氨酸、50mg/LDL-二氨基庚二酸、25mg/L四环素、25mg/L氯霉素、30g/LL-谷氨酸，用氨水调节至pH4.5)平板上。得到在32'C下培养2天后出现的菌落作为在低pH下高浓度谷氨酸的抗性菌抹。对得到的菌林来说，测量在M9-B液体培养基中的生长水平，并且在体积为50ml的含有5mlL-谷氨酸生产测试培养基(40g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2S04、0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P0,、0.5g/LNaCl、0,25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS(V2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0,72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2MoO"2H20、2g/L酵母提取物、200mg/LL-赖氨酸盐酸盐、200mg/LL-甲硫氨酸、200mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四环素盐酸盐、25mg/L氯霉素)的大试管中测试L-谷氨酸的生产能力。把呈现出最佳生长水平的并且与其亲代菌林SCU/RSFCPG+pSTVCB具有相同L-谷氨酸生产能力的菌林命名为成团肠杆菌AJ13601,把AJ13601菌株(EnterobacteragglomeransAJ13601)于1999年8月18日保藏在通商产业省工业技术生命工学工业技木研究所(邮政编码305—8566，1—3，Higashil-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本)，并得到了登记入册号为FERMP-17516。然后遵照布达佩斯条约的条款于2000年7月6日将其转为国际保藏，并得到了登记入册号为FERMBP-7207<5>培养成团肠杆菌AJ13601菌抹用来生产L-谷氨酸(1)把成团肠杆菌AJ13601菌林接种到含有300ml培养基的1升发酵罐中，所述培养基含有40g/L葡萄糖、20g/L(mU2S0o0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、0.25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、2g/L酵母提取物、200mg/LL-赖氨酸盐酸盐、200mg/LL-曱硫氨酸、200mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素，并且在341C和pH6.0下培养14小时。通过向培养基中通入氨气来控制培养的pH。把如上所述得到的培养物在5000rpm下离心10分钟，并且把收集的细胞接种到含有300ml培养基的1升发酵罐中，所述的培养基含有40g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2S04、1.5g/LMgS04.7H20、6g/LKH2P04、1.5g/LNaCl、0.75g/LCaCl2.7H20、0.06g/LFeS04.7H20、0.06g/LMnS04.4H20、2.16mg/LZnS04.2H20、1.92mg/LCuS04.5H20、2.16mg/LCoCl2.6H20、1.2mg/L硼酸、3.6mg/LNa2Mo04.2H20、6g/L酵母提取物、600mg/LL-赖氨酸盐酸盐、600mg/LL-甲硫氨酸、600mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素，在34"C和pH4.5下进行培养来生产L-谷氨酸。通过向培养基中通入氨气来控制培养的pH。当最初加入的葡萄糖被耗尽时，继续添加600g/L的葡萄糖。通过如上所述进行了50个小时的用于生产L-谷氨酸的培养，在发酵罐中沉淀出大量的L-谷氨酸结晶。表1显示出当时溶解在培养肉汤中的L-谷氨酸的浓度以及通过把结晶溶解在2M氢氧化钾中测得的L-谷氨酸的浓度。在使培养物保持静置后，通过倾析从培养物中收集L-谷氨酸结晶。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><6>培养成团肠杆菌AJ13601菌林用来生产L-谷氨酸(2)为了验证即使在L-谷氨酸结晶存在的条件下成团肠杆菌AJ13601菌林仍然具有L-谷氨酸生产能力，从而进行下列实验。把成团肠杆菌AJ13601菌林接种到含有300ml培养基的1升发酵罐中，所述培养基含有40g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2S04、0.5g/LMgS04.7H20、2g/LKH2P04、0.5g/LNaCl、0.25g/LCaCl2.7H20、0.02g/LFeS04.7H20、0.02g/LMnS04.4H20、0.72mg/LZnS04.2H20、0.64mg/LCuS04.5H20、0.72mg/LCoCl2.6H20、0.4mg/L硼酸、1.2mg/LNa2Mo04.2H20、2g/L酵母提取物、200mg/LL-赖氨酸盐酸盐、200mg/LL-曱硫氨酸、200mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素，并且在34TC和pH6.0下培养14小时。通过给培养基鼓入氨气来控制培养物的pH。把如上所述得到的培养物在5000rpm下离心10分钟，然后在其中L-谷氨酸以结晶存在的培养基中培养收集的细胞。所用的培养基含有40g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2S04、1.5g/LMgS04.7H20、6g/LKH2P04、1.5g/LNaCl、0.75g/LCaCl2.7H20、0.06g/LFeS04.7H20、0.06g/LMnS04.4H20、2.16mg/LZnS04.2H20、1.92mg/LCuS04.5H20、2.16mg/LCoCl2.6H20、1.2mg/L硼酸、3.6mg/LNa2Mo04.2H20、6g/L酵母提取物、600mg/LL-赖氨酸盐酸盐、600mg/LL-曱硫氨酸、600mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素，并且添加L-谷^氨酸结晶至40g/L。把细胞接种到含有300ml所述培养基的l升发酵罐中，并且在341C和pH4.3下进行培养来生产L-谷氨酸。通过向培养基中通入氨气来控制培养的pH。当最初加入的葡萄糖被耗尽时，继续添加600g/L的葡萄糖。在该培养基中，仅有39g/L添加的L-谷氨酸在pH4.3下溶解，而剩余的1g/L仍以结晶存在。通过如上所述进行了53个小时的用于生产L-谷氨酸的培养，在发酵罐中沉淀出大量的L-谷氨酸结晶。表2显示出溶解在培养肉汤中的L-谷氨酸的浓度、当时以结晶存在的L-谷氨酸的量以及通过把结晶溶解在2M氢氧化钾溶液中测得的L-谷氨酸的浓度。在使培养物保持静置后，通过倾析从培养物中收集L-谷氨酸结晶。结果表明即使在L-谷氨酸结晶存在的条件下，成团肠杆菌AJ13601菌林仍然积累L-谷氨酸并且沉淀出其结晶。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><7>培养成团肠杆菌AJ13601菌林用来生产L-谷氨酸(3)成团肠杆菌AJ13601菌林不仅可以在酸性pH下生长，而且可以在中性pH下生长。因此，通过在中性pH下开始培养并使得在培养过程中产生L-谷氨酸，从而应当自发地降低培养物的pH，如下证实了也可以沉淀出L-谷氨酸结晶。把在30X:下在含25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素的LBG琼脂培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、5g/L葡萄糖、15g/L琼脂)上培养了14个小时的一平板(直径为8.5cm)成团肠杆菌AJ13601菌林的细胞接种到含有300ml培养基的1升发酵罐中，所述的培养基含有40g/L葡萄糖、5g/L(NH4)2S04、1.5g/LMgS04.7H20、6g/LKH2P04、1.5g/LNaCl、0.75g/LCaCl2.7H20、0.06g/LFeS04.7H20、0.06g/LMnS04.4H20、2.16mg/LZnS04.2H20、1.92mg/LCuS04.5H20、2.16mg/LCoCl2.6H20、1.2mg/L硼酸、3.6mg/LNa2Mo04.2H20、6g/L酵母提取物、600mg/LL-赖氨酸盐酸盐、600mg/LL-曱硫氨酸、600mg/LDL-a，s-二氨基庚二酸、25mg/L四环素盐酸盐和25mg/L氯霉素，并且在34TC和pH7.0下开始培养。通过向培养基中通入氨气来控制培养物的pH。当最初加入的葡萄糖被耗尽时，继续添加600g/L的葡萄糖。当积累L-谷氨酸时，pH自发地降低。调节通入的氨气的量，以便在培养开始后的15小时-24小时之间时pH应当逐步地由7.0降至4.5，而在培养开始后的24小时时pH变为4.5。之后，继续培养12小时。通过如上所述进行了36个小时的用于生产L-谷氨酸的培养，在发酵罐中沉淀出大量的L-谷氨酸结晶。表3显示出溶解在培养肉汤中的L-谷氨酸的浓度、当时以结晶存在的L-谷氨酸的量以及通过把结晶溶解在2M氢氧化钾溶液中测得的L-谷氨酸的浓度。在使培养物保持静置后，通过倾析从培养物中收集L-谷氨酸结晶。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>序列表<110>AjinomotoCo.，Inc.<120>通过伴随有沉淀的发酵生产L-谷氨酸的方法<130><150>JP11-234806<151>1999-08-20<150>JP2000-78771<151>2000-03-21<160>7<170>PatentIn2.0版<210>1<211>4556<212>DNA<213>成团肠杆菌<220><221>CDS<222>(2)..(121)<220><221>CDS<222>(322)..(3129)<220><221>CDS<222>(3145)..(4368)<220><221>CDS<222>(4437)..(4556)<400>1tgcattcagegttUccgctgtescageateatgaactgtgtaagtgtt49AlaPheSerValPheArgCysHisSerlieMetAsnCysValSerVal151015tgtcctgggetasacccgacgcgcgetateggccacattaagteg97CysProLysGlyLeuAsnProThrArgAlalieGlyHislieLysSer202530atgctgctgcaacgcagegcgtagttataccaccgggaacc.tcaggttccc148MetLeuLeuGinArgSerAla35ggtattttacggaagcctctgtaaacgcggtcccaaccacgtttacaaaggttcccttac208gggccgggcgcgcgctgcgcacagtgctcgtatcgctgaactcactacggcaaaccgcga268aagcggcaacaaatgaaacctcaaaaaagcataacattgcttaagggatcacaatg324Met1cag33Cagegcgatgaagccctggctggactectectggctggccggc372GinAsnSerAla5MetLysProT「pLeu10AspSerSerT卬Leu15AlaGlygcgcsgtcttacatagagcaaetctatgaggatttcctg3CCgart420AlaAsnGin20SerTyrlieGluGin25l_euTyrGluAspPhe30LeuThrAspcctgactctgtggatgesgtgtggcgctcg3tgttccaacsgttaCC3468ProAsp35SerValAspAlaVal40TrpA「gSerMetPheGin45GinLeuProggcacgggagtgcctgagcagttcC3Ctecgcaactcgcgaatat516GlyThrGlyValLysProGluGinPheHisSerAlaThrArgGluTyr50556065ttccgtcgcctggcggacgestctcgttacacctecgtt3CC564PheArgArgLeuAla70LysAspAlaSerArg75TyrTh「SerSerVal80Thrgatccggcasice幼ctecC33gtggtgctgcagctgatt612AspProAlaThr85AsnSerLysGinVal90LysValLeuGinLeu95lieAsngcgtttcgtttccgcggacatcaggaagessaitetcgatccgcttggc660AlaPheArg100PheArgGlyHisGin105GluAlaAsnl_euAsp"0ProGlyctgtgg的3csggsccgcgttgccgatetcgatcctgcctttC3Cgat708LeuTrp115LysGinAspArgVal120AlaAspLeuAspProAla125PheHisAspctg3CCgccgatUtcaggasagetttaacgtaggttcttttgcc756LeuThrAspAlaAspPheGinGluSerPheAsnValGlySerPheAla130135140U5attggc333g333CCatg33gctggccgatctgttcgacgcgctgaag804lieGlyLysGluThr150MetLysLeuAlaAsp155l_euPheAspAlaLeu160Lyscag3CCtgtggctcgattggtgcagagtatatg■cacateaat犯c852GinThrTyrCys165GlySerlieGlyAla170GluTyrMetHislie175AsnAsnaccg幼gsgaaacgctggstccagcagcgtategaatecggtgcgage900ThrGluGluLysArgTrplieGinGinArglieGluSerGlyAlaSe「180185190cagacgteattcagtggcgaagagggtttcctggagctg948GinThrSerPheSerGlyGluGluLysl_ysGlyPheLeuLysGluLeu195200205gcggaagggctggaaaaatatctgggcgcgaaattcccgggt996ThrAlaAlaGluGlyLeuGluLysTyrl_euGlyAlaLysPheProGly210215220225gca幼3cgtttctcgctgg站ggcggtgatgcgctggtgccgatgctg驅AlaLysArgPheSerLeuGluGlyGlyAspAlal_euValPro他tLeu230235240cgcgagatgattcgtcatgcgggc咖的cggcacscgtgsagtggt3證ArgGluMetlieArgHisAlaGlyLysSerGlyThrArgGluValVal245250255选用杜仲、人参、首乌、鹿茸、大枣、枸杞、百合、龙眼肉、山楂、蜂蜜。白酒为原料;通过以下生产工艺组配成1、筛选按照工艺要求净选，采用挑选、风选、剪、切、刮、削、剔除、刷、擦及泡洗方法，清除原料中的杂质或分离去除非原料部分，使原料和辅料都达到质量要求。2、清洗。对各种原料分别用水清洗淘洗、漂洗、喷淋洗涤等方法，将药物清洗干净。清洗后根据工艺要求及时干燥。3、切制、粉碎根据药材性质，采用直接碎切，冲击粉碎，冷冻后粉碎等方法，将原料切成片、段、块等。切制后根据工艺要求及时干燥。4、炮炙各类药材根据《中华药典》规定的方法进行炮炙。5、干燥根据工艺要求选用不同的干燥方法和干燥设备。温度一般不超过80'C，含挥发性物质的不超过60'C。6、粉碎、过筛粒度应掌握在3—5毫米左右。7、配料根据配伍，分别称量，装入特制的网状不锈钢容器(150cmX150cmX100cm)中。8、浸提应用传统的浸渍法。酒基选用60°以上蒸馏原酒。采用"冷浸提法"提取。浸泡时间夏天5——7天，冬天7——10天。用原酒分3次浸提(实践中用两次浸提即可)。浸提液合并，药渣用纯净水冲洗。冲洗水待调酒用。本发明的有益效果是其有效成分含量高，杂质少，苦涩味小；不仅吸收快，而且释放度高，可直接被肠壁吸收，通过血液循环流遍全身，尽快到达病灶区，提高治疗效果，比其他剂型的药物更便于服用，且剂量小，成本低。下面结合附图和具体实施方式，对本发明作详细说明。图l是本发明的工艺流程图。实施例1:杜仲3g人参3g首乌9g鹿茸1g大枣10g枸杞3g百合8g龙眼肉8g山楂2g蜂蜜30g白酒1000ral。实施例2:杜仲6g人参6g首乌llg鹿茸3g大枣20g枸杞7g百合12g龙眼肉12g山楂6g蜂蜜70g白酒1000ml。实施例3:杜仲5g人参5g首乌10g鹿茸2g大枣15g枸杞5g百合10g龙眼肉10g山楂5g蜂蜜60g白酒1000ml。实施例4:本发明的生产方法是l、筛选按照工艺要求净选，采用挑选、风选、剪、切、刮、肖IJ、剔除、刷、擦及泡洗方法，清除原料中的杂质或分离去除非原料部分，使原料和辅料都达到质量要求。2、清洗。对各种原料分别用水清洗淘洗、漂洗、喷淋洗涤等方法，将药物清洗干净。清洗后根据工艺要求及时干燥。3、切制、粉碎根据药材性质，采用直接碎切，冲击粉碎，冷冻后粉碎等方法，将原料切成片、段、块等。.切制后根据工艺要求及时干燥。ccttatccggcacaggttgacatg333cgcctgaaggaactggcaUg2004ProTyrProAlaGinValAspMetLysArgLeuLysGluLeuAlaLeu550555560cgtateagecsggtccctgagcagattgaagtgcagtcgcgcgtggcc2052ArglieSerGinValProGluGinlieGluValGinSerArgValAla565570575aagatetat紛cgatcgcaagctgatggccgaaggcgag幼agcgttc2100LyslieTyrAsnAspArg匕ysLeuMetAlaGluGlyGluLysAlaPhe580585590gactggggcggtgccgagctggcggccacgctggtgg3tg幼2148AspTrpGlyGlyAlaGluAsnLeuAlaTyrAlaThrLeuValAspGlu595600605ggtattccggttcgcetctcgggtg幼gactecggtcgtggaaccttc2196GlyI〗eProValArgLeuSerGlyGluAspSerGlyArgGlyThrPhe610615620625ttccgcC3CgcggtcgtgC3C33Ccagget33Cggtteaacctat2244PheHisArgHisAlaValValHisAsnGinAlaAsnGlySerThrTyr630635640acgccgctgC3Ccat'attcatagec的ggcgagttc3幼gtctgg2292ThrProLeuHisHislieHisAsnSerGinGlyGluPheLysValTrp645650655gaittcggtgctgtctgaag33gcggtgctggcgtttgaaggttac2340AspSerVall_euSerGluGluAlaValLeuAlaPheGluTyrGlyTyr660665670gccacggetgagccgcgcgtgctg3CCtgggaagcgcagtttggt2388AlaThrAlaGluProArgValLeuThrlieTrpGluAlaGinPheGly675680685gaictttgccggtgetcag.gtggtgattgaccagttcateagetct2436AspPheAlaAsnGlyAlaGinValValI〗eAspGinPhelieSerSer690695700705ggcg幼cagasgtggggccgtatgtgtggcctggtgatgttgctgccg2化4GlyGluGinLysTrpGlyArgMetCysGlyLeuValMetLeuLeuPro710715720C3tggctacgaaggtcagggaccggaaC3Ctectctgcccgtctgg幼2532HisGlyTyrGluGlyGinGlyProGluHisSerSerAlaArgLeuGlu725730735cgctatctgctttgcgccgagcagatgcaggtttgcgtcccg2580ArgTyrLeuGinLeuCysAlaGluGinAsnMetGinValCysValPro740745750tcgacgccggetcaggtgtatC3Catgctgcgccgtcaggcgctgcgc2628SerThrProAlaGinValTyrHisMetl_euArgArgGinAlaLeuArg755760765gggatgcgccgtccgctggtggtgatgtcgccgaagtcgctgttacgc2676GlyMetArgArgProLeuValMetSerProLysSe厂LeuLeuArg770775780785estccaictggcgatetcg'tcgctggatgaactggcaaacggc的tttc2724HisProLeuAlalieSerSerLeuAspGluLeuAlaAsnGlySerPhe790795800cagccggccattggtgagategacgatctg'gatccgcagggcgtg咖2772GinProAlalieGlyGlulieAspAspLeuAspProGinGlyValLys805810815cgcgtcgtgctgtgctecggtaaggtttactacgatctgctggaacag2820ArgValValLeuCysSerGlyLysValTyrTyrAspLeuLeuGluGin820825830cgtcgt333gacgag3333CCgatgttgccategtgcgcategaacag2868ArgArgLysAspGluLysThrAspValAlalieValArglieGluGin835840845cttccgttcccgC3tcaggcggtacaggaagcattggcctat2916LeuTyrProPheProHisGinAlaValGinGluAlaLeuLysAlaTyr850855860865tctC3CgtacaggacUtgtctggtgccaggaagagcctctgcag2964SerHisValGinAspPheValTrpCysGinGluGluProLeuAsnGin870875880ggcgcctggtactgtagecagcartC3tttccgtgatgtcgtgccgttt3012GlyAlaTrpTyrCysSerGinHisHisPheArgAspValValProPhe885890895ggtgccaccctgcgttatgcaggtcgcccggcateggettctccggcc3060GlyAlaThrLeuArgTyrAlaGlyArgProAlaSerAlaSerProAla900905910gtgggttatatgtecgtaC3CC33C33cagcaggacctggttaat3108ValGlyTyrMetSe「ValHisGinGinGinGinGinAspLeuValAsn915920925gacgcaictg33Cgtcaattaa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