专利名称：：检测奶制品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及检测奶制品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒
背景技术：
自2004年4月安徽阜阳发生"劣质奶粉"事件以来，奶粉安全问题成为社会各界广泛关注的焦点。奶粉的主要消费群体是婴幼儿、儿童、老人或病人等免疫力较低的人群，尤其婴幼儿是奶粉的重要消费群体，因此，奶粉的安全性尤为重要，一直受到国务院、职能部门和各级政府的高度重视。2002年科技部下达了"十五"国家重大科技奶业专项，对乳制品中几种常见致病菌进行了快速检测方法的研究。由此可见，研究并建立快速准确检测奶粉及奶制品中的致病菌的方法以保障奶制品的安全非常必要。根据中国国标和国家质检总局行标的有关规定，目前检验检疫部门对奶粉检测的致病菌项目为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和阪崎肠杆菌。此外本发明又增加了近年来引起关注的肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌。因此本发明检测的奶粉及奶制品中常见的十种病原菌为沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏拧檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌。国标中检测致病菌的方法多是采用传统的分离培养和生化鉴定的方法，报告检验结果大致需57天,加之检验方法繁琐、费时费力,不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足食品安全和日益发展的国际贸易的需要。在质检部门内部，采用传统方法检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌，采用行业标准用PCR的方法检测奶粉中的阪崎肠杆菌，但国标和行标中均没有检测肺炎克雷伯氏菌的方法。1997年7月，Affymetrics，Inc.(SantaClara,CA)公司的ThomasR.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。目前最常使用的微生物鉴定的靶分子是16SrRNA和23SrRNA，国内外已有很多文献报道。利用16SrRNA和23SrRNA可将细菌微生物鉴定至种或属，但是对于亲缘关系较近的细菌种或属的鉴定十分困难(BodrossyL,SessitschA.2004.Oligonucleotidemicroarraysinmicrobialdiagnostics-CurrentOpinioninMicrobiology.7:245—25)。目前利用16S-23SrRNA间区作为靶分子进行细菌的鉴定已经逐渐成为研究的热点(NubelU，SchmidtPM,ReifiE，etal.2004.OligonucleotidemicroarrayforidentificationofBacillusanthracisbasedonintergenictranscribedspacersinribosomalDNA.FEMSMicrobiologyLetters240:215-223.)，它的变异速率相当于16SrRNA或者23SrRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可将细菌区分到型，对于亲缘关系较近的种属的区分具有16SrRNA和23SrRNA不可比拟的优势。同时两端是保守的16SrRNA基因和23SrRNA基因区，可在两端的保守区设计通用引物可避免了多对引物带来的引物二聚体的问题，长度在200bp-1000bp之间，大小易于操作，因而靶序列的扩增和标记过程更加简化，也更容易控制，符合操作简便快捷的实际要求。
发明内容本发明的一个目的是提供一种检测奶制品中致病菌的基因芯片，以弥补传统检测奶粉及奶制品中常见致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，縮短检测周期。本发明所述的检测奶制品中致病菌的基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列(1)从阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的zj^H(invasionplasmidantigengene)基因或弗氏柠檬酸杆菌的g^B基因中选取的DNA序列；(2)上述(1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；(3)上述(1)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。其中，上述的从阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的^^H基因或弗氏拧檬酸杆菌的g)^B(DNAgyrasesubunitB)基因中选取的DNA片段具有SEQIDNO:2-SEQIDNO:28所示的DNA序列中的一种或多种DNA序列；从细菌16srDNA保守区中选取的DNA片段具有SEQIDNO:l所示的DNA序列。其中，上述的寡聚核苷酸探针还包含阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。上述的阳性对照探针优选为从细菌16srDNA保守区中选取的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列，本发明的较佳实施例中上述的阳性对照探针具有SEQIDNO:l所示的DNA序列。本发明的另一目的是提供上述的基因芯片的应用，其可用于阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌的至少一种的检测。其中，所鹏的检测引物包括SEQIDNO:29-SEQIDNO:34戶麻的DNA序列中的至少一种。本发明的再一目的是提供一种利用上述基因芯片检测奶制品中致病菌的试剂盒，该试剂盒包含本发明上述的基因芯片，该试剂盒还包含^U弓胸SEQIDNO:29-SEQIDNO:34所示的DNA序列或其互补DNA序列的至少一种。本发明的试剂盒还包含杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。本发明的再一目的是提供上述的试剂盒的应用，其可用于阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌的至少一种的检测。由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入奶粉及奶制品中常见致病菌检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测奶粉及奶制品中常见的致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，无论对于如出入境检验检疫部门对奶粉及奶制品的检验检疫还是对奶制品加工企业及大型超市的奶粉及奶制品安全检验都有重要的应用价值。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。图l为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图。图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图。图3A为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中阪崎肠杆菌时的杂交结果。图3B为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中化脓性链球菌时的杂交结果。图3C为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中志贺氏菌时的杂交结果。图3D为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中金黄色葡萄球菌时的杂交结果。图3E为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中产酸克雷伯氏菌时的杂交结果。图3F为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中沙门氏菌时的杂交结果。图3G为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中单核细胞增生李斯特菌时的杂交结果。图3H为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中蜡样芽胞杆菌时的杂交结果。图31为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中肺炎克雷伯氏菌时的杂交结果。图3J为利用本发明的基因芯片检测奶粉及奶制品中弗氏柠檬酸杆菌时的杂交结果。具体实施方式实施例l探针的设计和制备1.序列获得(1)细菌16srDNA序列的获得从GenBank公共数据库下载得到十种菌的全部16srDNA序列。(2)16S-23SrDNA间区序列的获得从GenBank公共数据库下载得到沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、阪崎肠杆菌及他们的近缘菌的所有16S-23SrDNA间区序列。肺炎克雷伯氏菌的间区序列公共数据库中仅有9株菌的21条间区序列，产酸克雷伯氏菌的间区序列只有l株菌的l条序列，满足不了筛选特异探针的需求。本实验室对22株肺炎克雷伯氏菌，3株臭鼻克雷伯氏菌，2株鼻硬结克雷伯氏菌，4株产酸克雷伯氏菌，1株土生克雷伯氏菌和1株植生克雷伯氏菌和2株解鸟氨酸克雷伯氏菌进行了间区的测序。用上述从16srDNA和23srDNA序列设计的引物扩增间区，PCR产物纯化后连接到T载体上，后电转进DH5a感受态中，挑取含500bp-lkbp的质粒测序，测序仪ABI3700。测得的序列用StadenPackage软件拼接，从而得到肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌及其近缘菌的间区序列。(3)^"H基因序列的获得从GenBank公共数据库下载得到志贺氏菌四个种的全部ipaH基因序列。(4)g^B基因序列的获得我们从GenBank公共数据库里下载了弗氏柠檬酸杆菌三条不完全序列。此外，华盛顿大学和Sanger分别对克氏柠檬酸杆菌和啮齿柠檬酸杆菌进行全基因组测序，申请人经过生物信息学分析，得到它的g^B基因序列。同时申请人的实验室对9株弗氏柠檬酸杆菌、l株无丙二酸柠檬酸杆菌、l株啮齿柠檬酸杆菌的gyrB基因进行了测序。2.探针设计(1)细菌的通用探针十种菌全部的16srDNA序列及其他菌的16srDNA序列导入GlustalX软件中，选取靠近间区的一段16srDNA保守序列作为探针，满足长度27bp土2bp，Tm值68t:士3X:。(2)间区探针分别将阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的所有16S-23SrDNA间区序列导入GlustalX软件中，从而得知该菌的间区序列有几种类型，每种类型选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。对照GlustalX比对结果，选取满足不同株间该区段都保守的性质，同时长度27bp土2bp，Tm值68。C土3。C。(3)^"H基因探针将上述从GenBank公共数据库下载得到的志贺氏菌四个种的^"H基因序列用序列比对软件GlustalX比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下-n20;-130;-L40;國D3000;國t79;-T90;-s65。C;-x65。C;画N2;画p33，-P65;-mGGGGGCCCCCTTTTTAAAAA;-g15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp士2bp，Tm值68。C士3t:的探针。(4)g^B基因探针将上述下载和自己测序得到的全部弗氏拧檬酸杆菌的g)TB序列导入GlustalX软件中，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下-n20;-130;-L40;-D3000;479;-T90;-s65°C;-x65°C;-N2;-p33，-P65;-mGGGGGCCCCCTTTTTAAAAA;-g15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp士2bp，Tm值68。C士3。C的探针。3.探针合成将下表1中的探针序列的5'端延长10个T(表1所示的荧光探针序列中没有包含延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。4.探针筛选:将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。在本发明的优选实施例中，选择了31条长度在35bp士2bp、Tm75°C士2。C的探针，并通过269次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.1(SEQIDNO:l)的探针序列选自所有细菌的16srDNA，作为阳性对照用来检测是否有细菌，编号为NO.2的探针作为荧光探针，编号为N0.3的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为NO.4的探针为50%的DMSO,用作空白对照，编号NO.5-NO.25的21条探针序列(SEQIDNO:2—SEQIDNO:22)选自常见致病菌(阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌)的16S-23SrDNA间区，编号NO.26—NO.29(SEQIDNO:23—SEQIDNO:26)的4条探针序列选自志贺氏菌的z>aH基因，编号NO.30-NO.31(SEQID<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1.序列获得同前设计探针的序列。2.设计引物(1)扩增间区序列引物的设计从公共数据库NCBI中下载得到的IO种细菌的16SrDNA用序列比对软件GlustalX比对后，选取靠近间区的一段16srDNA保守序列作为上游引物，长度符合Tm值50°C土5'C、长度17bp土2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:NONE,且包含细菌通用探针序列在内。(2)扩增ipaH基因序列引物的设计将上述从GenBank公共数据库下载得到的志贺氏菌四个种的z)^H基因序列用序列比对软件GlustalX比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件PrimerPremier5.0软件中，相应参数设定如下SearchFor:PCRPrimers,Searchtypes:Both.SearchRanges:SensePrimer1to672,Anti-sensePrimer1to672，PCRProductSize:100bpto1000bp.PrimerLength:20bp±2bp.SearchMode:Automatic。从输出结果中选取Tm值50°C±5°C、长度17bp±2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:NONE且包含探针序列在内的引物。(3)扩增g^B基因序列引物的设计将上述下载得到的和自己测序的所有弗氏柠檬酸杆菌g^B基因序列用序列比对软件GlustalX比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件PrimerPremier5.0软件中，相应参数设定如下SearchFor:PCRPrimers,Searchtypes:Both.SearchRanges:SensePrimer1to2415,Anti-sensePrimer1to2415，PCRProductSize:100bptolOOObp.PrimerLength:20bp±2bp.SearchMode:Automatic从输出结果中选取Tm值50°C±5°C、长度17bp±2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:NONE且包含探针序列在内的引物。3.引物合成将下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。4.引物筛选将合成好的引物溶解并适量稀释，一方面通过PCR反应分别扩增16S-23SrDNA间区、志贺氏菌^aH基因和弗氏柠檬酸杆菌的g^B基因序列检测引物的扩增性，另一发面，三对引物同时对10种菌的不同菌株进行扩增检测三对引物的相容性，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的引物。在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合同时使用3对引物扩增10种奶粉及奶制品中常见致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌)DNA的引物6条，为适应同时三对引物的PCR，经生物信息学初筛并通过大量PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。表2用于奶粉及奶制品中10种常见致病菌检测DNA的PCR扩增的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例3基因芯片制备——芯片点样1.溶解探针将实施例1中合成的探针分别溶解于50XDMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到lpg^1。2.加板将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10pl。3.点样将如图1所示的57.5mmx25.5mmxlmm(长X宽X高)的洁净的醛基化玻片(CELAssociates,Inc.)放到芯片点样仪(Spotarray72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Telechemsmp3stealtypin),运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mmx4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mmx2.25mm，该点阵内点间距250pm，矩阵12x9，12x250(im=3mm，9x250pm=2.25mm，标准片基尺寸75.5mmx25.5mmxlmm。4.干燥将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45'C烘箱干燥2小时。5.交联用交联仪(uvpcl-2000MultracioletCrosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。由图2可见，每个点样区内为12(行)X9(列)个探针点。NO.l框区示意的位置为检测细菌的正对照探针，N0.2框区示意的位置为荧光探针，NO.3框区示意的位置为负对照探针，其它为各致病菌的特异探针(对应于表1中的相应探针编号)。实施例4利用基因芯片快速检测奶粉及奶制品中常见致病菌1.样品处理25g奶粉及奶制品加入预先配制好的225ml2YT培养基中，37°C，200rpm过夜振荡培养。2.提取基因组lml过夜培养的样品8000rpm离心5分钟沉淀可能存在的致病菌菌体，弃上清(尽量空干)。向沉淀中加入100ul去离子水重悬，8000rpm,离心5分钟，去除上清。加入100ul的裂解液(配方如下)，IO(TC沸水浴15分钟，12000rpm离心3分钟，上清即为粗提的DNA模板。附裂解液配方1XPCR缓冲液(含Mg+)0.5%的NP400.5%的Tween203.扩增靶序列取上述基因组提取方法提取的3ul中层上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)表3MultiplexPCR反应混合液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注表中P-l至P-2以及P-3和P-4为表2中所列的引物。将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下94°C5分钟94。C30秒50°C30秒72°C1分钟回到第二步，共35个循环72°C5分钟4°C20分钟3.纯化将上述获得的PCR扩增产物用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400ial。(2)25°C、6000rpm离心15分钟，丢弃收集管。(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25^1的超纯水(MilliQ)，37。C放置5分钟。(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2分钟，收集产物。4.标记靶序列取12pl纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。表4标记混合液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>72°Cl分钟回到第二步，共35个循环72°C5分钟4°C20分钟5.烘干将标记产物置65r烘箱烘干。6.杂交向杂交盒(博奥公司)内预加入70|11ddH20以保持湿度。12^1杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，4(TC水浴锅中杂交16小时。7.洗涤杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。杂交液配方10%硫酸葡聚糖(dextranSulfate);25%甲酰胺(formamide);0.1°/。SDS(十二烷基硫酸钠)；6XSSPE洗液A:1XSSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1%SDS洗液B:0.05XSSC洗液C:95%乙醇8.扫描用GenePixpersonal4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下软件及版本GenePixPro6.0officialname:575DF35PMTGain:550扫描分辨率10|im扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式用本发明的基因芯片分别检测常见的奶粉及奶制品中致病菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌)时的杂交扫描结果如图3A-3J所示。9.分析判读由于奶及奶制品在生产加工过程中有灭菌步骤，所以相对其他食品致病菌相对较少，因此目前质检部门对奶粉及奶制品的致病菌检测项只包括五种菌(沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、阪崎肠杆菌)，本发明针对实际检出情况又增加了肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌总计10种致病菌。细菌数目较少，探针点也较少，检测结果可由肉眼判断。根据扫描出的杂交图像，以正对照探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出致病菌。若只有正对照探针有信号，则不存在此十种致病菌。实施例5对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测对实施例3中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下总计用205株致病菌的标准株和检出株以及他们的近缘菌株来鉴定实施例三中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表5。利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。_表5.*特异性试验用到的菌株_<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>小牛葡萄球菌1山羊葡萄球菌1头状葡萄球菌1肺炎链球菌2唾液链球菌1乳链球菌1无乳链球菌1屎链球菌1粪链球菌1猪链球菌1牛链球菌1臭鼻克雷伯氏菌3鼻硬结克雷伯氏菌2土生克雷伯氏菌1植生克雷伯氏菌1解鸟氨酸克雷伯氏菌21副溶血弧菌1无害李斯特氏菌1威氏李斯特1枯草芽胞杆菌1啮齿柠檬酸杆菌1无丙二酸柠檬酸杆菌1对实施例3中制备的奶粉及奶制品中常见致病菌检测基因芯片的灵敏度进行检测如下该基因芯片的检测灵敏度经过107次杂交实验的验证，0.1ng的微量基因组DNA或每25g(ml)奶粉及奶制品中有(1-5)cfU就可保证上述IO种致病菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。序列表<110>天津生物芯片技术有限责任公司中华人民共和国天津出入境检验检疫局<120〉检测奶制品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒<130〉7P13014-CN<160〉34<170>Patentlnversion3.2<210〉1<211>25<212〉DNA<213>基于细菌16SrDNA保守区设计并人工合成的正对照探针序列<400>1ttgtacacaccgcccgtcacaccat25<210>2<211〉27<212〉DNA<213>基于阪崎肠杆菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>2gtcagagtctctcaaactcgcagcacg27〈210>3<211〉30<212>DNA<213>基于阪崎肠杆菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>3ccaccatcacttcagagtgtactcagtgag30<210>4<211>29〈212〉DNA<213>基于阪崎肠杆菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400〉4acagacacgctgctgtatttctccgtaa/t29<210>5<211>31<212>DNA<213>基于化脓性链球菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>5ggctccatcaggatacaatcctactaaactt31<210〉6<211>30<212〉DNA<213>基于化脓性链球菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列〈400〉6cacatggtcagattcctaattttctacaga30〈210〉7<211>28<212〉DNA<213>基于化脓性链球菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>7gctaaagcgagcgttgcttagtatccta28<210>8<211〉29<212>腿〈213〉基于金黄色葡萄球菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列〈400〉8gcttatgcgagcgcttgacaatctattct29<210>9<211〉28<212〉賺〈213>基于金黄色葡萄球菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400〉9taaagcagtatgcgagcgcttgactaaa28<210〉10<211>30<212>DNA<213〉基于金黄色葡萄球菌的16S-23SrDM间区设计并人工合成的探针序列〈400>10atgtgaacgtttgacttataaaaatggtgg30<210>11<211〉27<212〉DNA<213〉基于产酸克雷伯氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400〉11ctgatag3tgtaaag3agcaagacggc27<210>12<211>23<212〉DNA<213>基于产酸克雷伯氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列〈400>12acggctgcgaagtcgcgacacct23〈210〉13<211〉23<212>DNA〈213>基于产酸克雷伯氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400〉13tctagcggttaggactccgccct23<210>14<211>25<212>腿<213>基于产酸克雷伯氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>14tgaaaggcacaaccaaccgatatct25<210〉15<211>25<212>DNA<213〉基于肺炎克雷伯氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400〉15atttga卿ggttgcaaacgatggg25<210>16<211>23<212〉DNA<213>基于肺炎克雷伯氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400〉16ggcctaccaaatttgcgaagcaa23<210>17<211〉27<212>腿<213>基于沙门氏菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>17gaggttctgactacacgatggggctat27〈210>18<211>25〈212>腿<213〉基于单核细胞增生李斯特菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>18aggcactatgcttgaagcatcgcgc25<210>19<211>30<212〉DNA<213>基于单核细胞增生李斯特菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>193ag333t3C333t33tcat3cccttttstg30<210>20<211〉34<212>DNA〈213〉基于单核细胞增生李斯特菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>20tttctttctgacacaagaaataca犯taatcata34<210>21<211>30<212>腿<213>基于蜡样芽孢杆菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>21atcaatataagtttccgtgtttcgttttcg30<210>22<211>32<212>腿<213〉基于蜡样芽孢杆菌的16S-23SrDNA间区设计并人工合成的探针序列<400>22ttctttgaaaactagataacagtgtagctcat32<210>23<211〉27〈212>DNA<213>基于志贺氏菌的ipaH基因设计并人工合成的探针序列<400>23gataatgataccggcgctctgctctcc27〈210>24<211〉30<212>DNA<213〉基于志贺氏菌的ipaH基因设计并人工合成的探针序列<400>24agatagaagtctacctggccttccagacca30<210〉25<211>26<212>腿<213>基于志贺氏菌的ipaH基因设计并人工合成的探针序列<400>25aggaaatgcgtttctatggcgtgtcg26<210>26<211〉27<212>DNA<213〉基于志贺氏菌的ipaH基因设计并人工合成的探针序列<400>26accatggcatgctgtactgaagcgtac27<210〉27<211>25<212〉DNA<213〉基于弗氏柠檬酸杆菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列<400>27cgtaaagacgctgaactgaacctgt25<210〉28<211〉25<212>DNA<213>基于弗氏柠檬酸杆菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列<400>28ctgatgaagcgaaagtcactgcctg25<210>29〈211>17<212>DNA<213〉基于阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌16S-23SrDNA间区设计并人工合成的通用检测用上游引物序列<400〉29tgtacacaccgcccgtc17<210〉30<211>21<212〉DNA<213〉基于阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌16S-23SrDNA间区设计并人工合成的通用检测用下游引物序列〈400>30ggtacttagatgtttcagttc21<210〉31<211>17<212〉DNA<213〉基于志贺氏菌ipaH基因设计并人工合成的检测用上游引物序列<400>31tgaccgcctttccgata17<210〉32<211>19<212〉DNA〈213>基于志贺氏菌ipaH基因设计并人工合成的检测用下游引物序列<400>32gccagtacctcgtcagtca19<210>33<211〉25<212>DNA<213>基于弗氏柠檬酸杆菌gyrB基因设计并人工合成的检测用上游引物序列<400>33gcgttgtccgaactgtaccttgtgg25<210〉34<211>22<212>腿<213>基于弗氏柠檬酸杆菌gyrB基因设计并人工合成的检测用下游引物序列<400>34gcccatcagcgtggtgaacagc2权利要求1.一种检测奶制品中致病菌的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其特征在于所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列(1)从阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因或弗氏柠檬酸杆菌的gyrB基因中选取的DNA序列；(2)所述(1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；(3)所述(1)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。2.根据权利要求l所述的基因芯片，其特征在于所述的从阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的—H基因或弗氏柠檬酸杆菌的g^B基因中选取的DNA片段具有SEQIDNO:2-SEQIDNO:28所示的DNA序列中的一种或者多种DNA序列。3.根据权利要求l所述的基因芯片，其特征在于所述的寡聚核苷酸探针还包含阳性对照探针、阴性对照探针和荧光探针。4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针选自细菌16srDNA保守区中选取的DNA片段或者其互补的DNA或RNA序列。5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于所述的阳性对照探针具有SEQIDNO:l所示的DNA序列。6.权利要求l-5任一项所述的基因芯片的应用，其特征在于该基因芯片用于阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌的至少一种的检测。7.根据权利要求6所述的基因芯片的应用，其特征在于所自的检测弓l物包括SEQIDNO:29-SEQIDNO:34戶g的DNA序列中的至少一种。8.—种检测奶制品中致病菌的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含权利要求1-5任一项所述的基因芯片。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含检测弓物SEQIDNO:29-SEQIDNO:34^的DNA序列或其互补DNA序列的至少一种。10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。11.权利要求8所述的试剂盒的应用，其特征在于所述的试剂盒用于阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弗氏拧檬酸杆菌、蜡样芽胞杆菌的至少一种的检测。全文摘要本发明提供一种检测奶制品中常见致病菌的基因芯片，其包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中上述寡聚核苷酸探针包含从阪崎肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的16S-23SrDNA间区以及志贺氏菌的ipaH基因或弗氏柠檬酸杆菌的gyrB基因中选取的DNA片段或其互补的DNA或RNA序列。本发明还提供利用上述基因芯片检测奶制品致病菌的试剂盒。利用本发明的基因芯片和试剂盒检测奶制品中致病菌，操作简便，准确性高，重复性强。文档编号C12Q1/04GK101240335SQ200710166530公开日2008年8月13日申请日期2007年11月5日优先权日2007年2月9日发明者曹勃阳,敏王,磊王,高旗利申请人:天津生物芯片技术有限责任公司;中华人民共和国天津出入境检验检疫局