专利名称：通过发酵制备l-谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵制备L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是食品、医药、化学制品等的一种重要氨基酸。
已知属于短杆菌属或棒状杆菌属的微生物能产生L-谷氨酸。还有人报道了一种能产生L-谷氨酸的短杆菌属微生物的一个突变菌株。已证明该突变株的α-酮戊二酸脱氢酶活性低于其亲本株的相应酶的活性;但是，已证明该突变株的L-谷氨酸产率与亲本株的产率相似(Agric.Biol.Chem.(1980)441897-1904;Agric.Biol.Chem.(1982)46493-500)。
在工业上，利用属于短杆菌属或棒状杆菌属的微生物进行发酵而制备L-谷氨酸。为了达到最大的L-谷氨酸产率已采用各种方法培养这些微生物。例如，已知生物素是这些微生物生长的一种必需因子并且培养基中生物素或生物素活性物质的浓度会大大地影响这些微生物分泌L-谷氨酸。当将这些微生物在含有其生长所需要的限定量的生物素或生物素活性物质的培养基中培养时，L-谷氨酸的产量增加。但是，在培养基中使用的普通碳源是廉价的物质如甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜，它们含有太多的生物素以致于得不到高产量的L-谷氨酸。因此，必须向该培养基中加入青霉素如青霉素G、F、K、O、V、X等，或加入由高级脂肪酸或其衍生物如蔗糖单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕样品酸酯等组成的表面活性剂以便在微生物细胞的对数生长初期抑制生物素活性。人们非常期望找到一种制备L-谷氨酸的工业生产方法，其中L-谷氨酸的产生不受培养基中生物素量的影响。
因此，本发明的一个目的是提供一种改进了的通过发酵制备L-谷氨酸的工业方法，该方法比以前的已知方法更经济、更有效。
现在本发明人已发现，当在含有过量生物素的液体营养培养基中培养能产生L-谷氨酸的短杆菌属或棒状杆菌属的微生物的突变株(与衍生该突变株的野生菌株相比，该突变株有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性)时，不必向培养基中加入抑制生物素活性的物质就能累积和高产率地产生L-谷氨酸。
因此，本发明提供了一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括在含有浓度为10-1000μg/l的生物素但不用加入抑制生物素活性的物质的液体营养培养基中培养能产生L-谷氨酸的短杆菌属或棒状杆菌属的微生物的突变株，其中所说突变株与衍生该突变株的野生株相比具有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性;在培养液中产生和积累L-谷氨酸;从所说培养液中回收L-谷氨酸。
在本发明中使用的合适的突变株可以是从产生L-谷氨酸的短杆菌属或棒状杆菌属微生物诱导得到的突变株并且与衍生该突变株的野生菌株相比，该突变株具有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性。该突变体还可以具有提高L-谷氨酸产率的其他特性，包括对有维生素P活性的化合物的抗性、对德夸菌素或杀结核菌素的抗性、提高了的超氧化物歧化酶活性，以及如在美国专利号4，334，020、4，389，483和4，529，697(引入本文作为参考)中描述的其他类似的特性。
可以使用下面的突变株乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ 12821(FERM BP-4172);
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ 12822(FERM BP-4173)以及谷氨酸棒状杆菌AJ 12823(FERM BP-4174)。
通过将产生L-谷氨酸的属于短杆菌属或棒状杆菌属的菌株进行人工突变可以获得这些突变株。对亲本菌株没有特定的限制，只要是属于短杆菌属或棒状杆菌属并能产生L-谷氨酸的菌株即可。可以使用下列野生菌株乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 13869;
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 14067;
叉开短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 14020;
玫瑰色短杆菌ATCC 13825;
解糖短杆菌ATCC 14066;
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032;
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC 13870;
醋谷棒状杆菌ATCC 15806;
百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 15990和Corynebacterium melassecola ATCC 17965。
采用常规技术如紫外线照射、X-射线照射、放射性照射或用诱变剂处理使野生型菌株进行突变可以获得本发明所述的突变株。典型的是，在30℃用250μg/ml的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍使野生型菌株诱变20分钟可以获得突变株。另外可以采用DNA技术获得突变株。
对在突变后从野生型菌株中分离本发明所述的突变株的合适的方法没有特别限制，可以包括，例如，能分离出在含有以L-谷氨酸作为唯一碳源和氮源的培养基上不能生长、但能在已用琥珀酸和氨替代上面所提的培养基中的L-谷氨酸得到的培养基中生长的菌株的方法(参见Agric.Biol.Chem.(1982)46493-500，引入本文作为参考文献)。
在本发明中使用的突变株具有比衍生该突变株的野生菌株更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性。对其活性应降低的程度没有必要限制，但优选使用其活性为亲本菌株的1/5至1/500之间的突变株，并且更优选的是其活性为亲本菌株的1/10至1/100之间。
为了使用获得的突变株生产和积累L-谷氨酸，在液体营养培养基中进行培养，其中使用含有过量生物素的物质如甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜作为碳源。另一种方法，可使用在碳源如糖化液或乙酸中加入过量的生物素的液体培养基。
按照常规方法，如在含有过量生物素的液体培养基中进行培养时，必需向培养基中加入一种抑制生物素活性的物质，例如青霉素如青霉素G、F、K、O、V或X或者由一种高级脂肪酸或其衍生物如蔗糖单棕榈酸酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯组成的表面活性剂，以便高产率地产生L-谷氨酸。但是，如果使用本发明的突变株，该突变株具有比衍生该突变株的野生菌株更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性，那么甚至可以在含有10至1000μ/l高浓度的生物素的液体营养培养基中不加入如上文所述的抑制生物素活性的物质的情况下高产率地产生和积累L-谷氨酸。
用于培养本发明突变株的液体营养培养基除含有碳源外，还可以含有合适的营养物如氮源或无机离子。可利用的氮源包括铵盐、氨水、氨气、脲、或通常用作L-谷氨酸发酵的氮源的其他化合物。可利用的无机盐离子包括磷酸盐、镁或其他碱或碱土金属盐。另外，如有必要可以适当地加入微量营养物如硫胺。
培养适合在通气条件下进行。温度适当地维持于24℃至42℃。pH值适当地控制在5至9。可用无机或有机化合物或酸性或碱性物质如脲、碳酸钙或氨气调节pH值。
从培养液中回收L-谷氨酸的方法包括将已知方法例如离子交换树脂处理或结晶适当地结合使用。
上述对本发明进行了一般性描述，参考具体的实施例可以进一步理解本发明，除另有指明，不然本文提供的实施例仅是用于解释目的而不是用于限制本发明。
实施例获得突变株用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(250μg/ml，30℃，20分钟)对乳发酵短杆菌ATCC 13869的细胞进行常规诱变处理，之后，将细胞在含有表1中所示成分的琼脂培养基中进行培养以形成菌落。
表1成分 浓度多蛋白胨 10 g/l酵母提取物 10 g/lNaCl 5 g/l乙酸 1 g/l琼脂 20 g/lpH7.0
然后用复型法从上述培养基中分离在含有以L-谷氨酸作为唯一碳和氮源的培养基上不能生长的突变株。就是说，挑取在表2中所示成分的培养基上甚至于30℃培养2天后而不能生长、但在同样条件下在其中用10g/l琥珀酸和1ml/l氨替代表2中所述L-谷氨酸钠后得到的培养基上能生长的菌落。
表2成分 浓度L-谷氨酸钠 10 g/lKH2PO410 g/lMgSO4·7H2O 0.4 g/lFeSO4·7H2O 0.5 g/lMnSO4·4H2O 8.1 mg/l盐酸硫胺素 100 μg/l生物素 300 μg/l琼脂 20 g/lpH 7.0由此获得许多突变菌株，与亲本野生型菌株乳发酵短杆菌ATCC 13869相比，这些突变菌株具有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性。选择乳发酵短杆菌AJ 12821(FERM BP-4172)作为代表性菌株。采用相类似的方法，分别以野生菌株黄色短杆菌ATCC 14067和谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032作为亲本菌株可以获得黄色短杆菌AJ 12822(FERM BP-4173)和谷氨酸棒状杆菌AJ 12823(FERM BP-4174)。
在下面所述方法中测定上述三个突变株及其亲本菌株各自的α-酮戊二酸脱氢酶活性。
取表3中所示成分的培养基20ml倾倒至一个500ml振摇瓶中，并将其在115℃灭菌10分钟。
表3成分 浓度葡萄糖 50 g/l(NH4)2SO445 g/lKH2PO41 g/lMgSO4·7H2O 1 g/lFeSO4·7H2O 10 mg/lMnSO4·4H2O 10 mg/l酸水解的大豆蛋白 400 mg/l(作为总氮物质)盐酸硫胺素 200 μg/l生物素 300 μg/lCaCO350 g/lpH 7.0将待检测的菌株细胞接种于该培养基中，并在31.5℃培养36小时。通过离心和洗涤从得到的培养物中收集细胞，之后，将其悬浮于20ml含30%甘油的0.1M TES(N-Tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)-NaOH缓冲液中。然后用超声波处理所述细胞，并将其离心得到的上清液用Sephadex G-25柱进行凝胶过滤以生产粗酶溶液。接着，用表4中所示的反应液组合物测定粗酶溶液中α-酮戊二酸脱氢酶活性。
表4成分 浓度TES-NaOH 100 mM辅酶A 0.2 mM硫胺焦磷酸素 0.3 mMα-酮戊二酸 1 mML-半胱氨酸 3 mMMnSO4·7H2O 1 mMMgCl25 mM3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸 1 mMpH 7.7向1.5ml的反应溶液中加入0.1ml的粗酶溶液而启动反应，并且在室温在365nm处追踪光密度的变化。将没有α-酮戊二酸的反应液作对照。
结果列于表5中。
表5<
>(一个单位定义为每分钟反应混合物中消耗1μmol的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸所需的酶量)。
结果清楚地证明，用上文所述的方法获得的所有三个突变株其α-酮戊二酸脱氢酶活性明显地低于各自的亲本野生菌株。
实施例1用表6中所示的组合物制备种子培养基，并将该培养基分成每份20ml分装于500ml振摇瓶中，然后进行灭菌。将三个突变株和其亲本菌株各自分别接种于该培养基中，用往复振荡器并维持温度于31.5℃培养这些菌株。在下文中将它们称为种子培养物。
表6成分 浓度葡萄糖 50 g/l脲 4 g/lKH2PO41 g/lMgSO4·7H2O 0.4 g/lFeSO4·7H2O 10 mg/lMnSO4·4H2O 10 mg/l盐酸硫胺素 200 μg/l生物素 30 μg/l酸水解的大豆蛋白 0.9 g/l(作为总氮物质)pH 7.0接着，用表7中所示的组合物单独配制一种培养基，并以每份20ml分装于500ml的振摇瓶中，然后在115℃将其灭菌10分钟。该培养基中生物素浓度为60μg/l。
表7成分 浓度甘蔗糖蜜 60 g/l(作为葡萄糖)KH2PO41 g/lMgSO4·7H2O 1 g/l盐酸硫胺素 100 μg/lpH 7.0以约10%的体积比将上文中提到的种子培养物接种于各自的培养基中，并用往复振荡器在31.5℃进行培养。在培养期间少量地加入浓度为450mg/ml的脲溶液以使培养液的pH维持在6.0和8.5之间。至36小时终止发酵，并检测培养液中积累的L-谷氨酸的量。
如表8所示，由于培养基中存在过量的生物素，野生型菌株积累的L-谷氨酸量非常低。而具有低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的所有突变株产生并积累大量的L-谷氨酸。
表8
实施例2用表9中所示的组合物配制一种培养基，以每300ml分装于1升发酵罐中，并在120℃灭菌10分钟。该培养基中生物素浓度为150μg/l。
表9成分 浓度甘蔗糖蜜 150 g/l(作为葡萄糖)KH2PO41 g/lMgSO4·7H2O 1 g/l盐酸硫胺素 100 μg/l消沫剂 20 μg/lpH 7.0将实施例1中得到的每个菌株的种子培养物以10%的体积比接种于上述培养基中，在通气及搅拌下于31.5℃进行培养。用氨气将培养液pH调至7.8。至32小时终止发酵，并检测积累于培养液中的L-谷氨酸的量。
如表10所示，由于存在过量的生物素，野生型菌株积累的L-谷氨酸非常低，而所有的具有低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的突变株产生并积累大量的L-谷氨酸。
表10
实施例3用表11所示的组合物并加入浓度分别为3、10、50、300和1000μg/l的生物素配制培养基，并以每份300ml装入1升发酵罐中，然后在120℃灭菌10分钟。
表11成分 浓度葡萄糖 100 g/lKH2PO41 g/lMgSO4·7H2O 1 g/lFeSO4·7H2O 10 mg/lMnSO4·4H2O 10 mg/l酸水解的大豆蛋白 0.4 g/l(作为总氮物质)盐酸硫胺素 100 μg/l消沫剂 20 μl/lpH 7.0将实施例1得到的各个菌株的种子培养物以10%的体积比接种于各自的培养基中，在31.5℃并通气和搅拌下进行培养。用氨气将培养液的pH调至7.8。至30小时终止发酵并检测培养液中产生并积累的L-谷氨酸的量。
如表12所示，在生物素浓度限定为3μg/l的产生L-谷氨酸的培养基中，对于亲本野生型菌株和突变菌株其积累的L-谷氨酸量几乎相同。另一方面，在含有浓度为10-1000μg/l的生物素的培养基中，野生型菌株的L-谷氨酸产生受到抑制，而具有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的所有突变株产生并积累大量的L-谷氨酸。
表12
至现在为止，已对本发明进行了详细描述，对本领域内任一技术人员来说，在不偏离本文所提出的发明的精神及范围的情况下可进行许多变化及更改不言而喻的。
权利要求
1.通过发酵制备L-谷氨酸的方法，包括下列步骤在含有浓度至少为10μg/l的生物素而不用加入生物素活性抑制物质的液体营养培养基中培养能产生L-谷氨酸的短杆菌属和棒状杆菌属的微生物的突变株，所说突变株与衍生该突变株的野生菌株相比具有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性；在培养液中产生并积累L-谷氨酸；以及从所说培养液中回收所说的L-谷氨酸。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物素的浓度为10-1000μg/l。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的突变株由下列一组短杆菌和棒状杆菌的一种野生菌株衍生乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 13869;黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 14067;叉开短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 14020;玫瑰色短杆菌ATCC 13825;解糖短杆菌ATCC 14066;谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032;嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC 13870;醋谷棒状杆菌ATCC 15806;百合棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 15990和Corynebacterium melassecola ATCC 17965。
4.根据权利要求1的方法，其中所述的突变株选自下列菌株乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)(AJ 12821(FERM BP-4172);黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ 12822(FERM BP-4173)和谷氨酸棒状杆菌AJ 12823(FERM BP-4174)。
5.根据权利要求1的方法，其中所述的突变株的α-酮戊二酸脱氢酶活性为所述野生型菌株的活性的1/5至1/500之间。
6.根据权利要求4的方法，其中所述的突变株的α-酮戊二酸脱氢酶活性为所述野生型菌株活性的1/10至1/100之间。
7.通过发酵制备L-谷氨酸的方法，包括下列步骤在含有浓度为10-1000μg/l的生物素的液体营养培养基中培养能产生L-谷氨酸的短杆菌属或棒状杆菌属的微生物突变株，其中所述突变株选自于下列一组菌株乳发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ 12821(FERM BP-4172)、黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)AJ 12822(FERM BP-4173)和谷氨酸棒状杆菌AJ 12823(FERM BP-4174);在培养液中产生并积累L-谷氨酸;以及从所述培养液中回收所述的L-谷氨酸。
全文摘要
本发明提供了更经济和更有效地通过发酵工业制备L-谷氨酸的方法，包括下列步骤在含有浓度为10至1000μg/l的生物素而不加入抑制生物素活性的物质的液体营养培养基中培养能产生L-谷氨酸的短杆菌属和棒状杆菌属的微生物的突变株，所述突变株与衍生该突变株的野生型菌株相比具有更低的α-酮戊二酸脱氢酶活性；在培养液中产生并积累L-谷氨酸；从所述培养液中回收L-谷氨酸。
文档编号C12R1/13GK1092467SQ94101578
公开日1994年9月21日 申请日期1994年2月8日 优先权日1993年2月16日
发明者中泽英次, 川伸树, 小山稻雄, 石井惠史, 河原义雄 申请人:味之素株式会社