一种枯草芽孢杆菌及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 细菌性病害是危害农作物生长的一类大病害，一直都严重危害着农业生产；目前， 常用的防治细菌性病害的药剂主要是化学农药，而且对有些病害防治效果一般，对生态环 境及农产品质量安全影响很大。在我国至今依然十分缺乏高效、广谱、低毒、低残留的以防 治细菌性病害为主的生物农药。
[0003] 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，其单个细胞0. 7~0. 8X2~3微米，着色均 匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6~0.9X1.0~1.5微米，椭圆到 柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色，它通过 竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形 成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害。枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质，抑制病菌孢子 发芽和菌丝生长。
[0004] 现有技术还存在以下问题：
[0005] 1、现有枯草芽孢杆菌制剂对水稻稻瘟病、水稻稻曲病、黄瓜白粉病、草莓灰霉病等 多种真菌引起的植物病害有明显的防治效果，但是并没有厂家在细菌引起的病害上取得登 记。
[0006] 2、现有制备枯草芽孢杆菌的方法通常采用液体发酵取得发酵液，预处理后用碟式 离心机浓缩，然后进行喷雾干燥得到原粉；发酵液经过碟式离心机分离，重液留下，轻液弃 去，分离速度快但是收率低。
【发明内容】
[0007] 针对以上问题，本发明提出了一种生长繁殖快、发酵周期短、下罐孢子数高和防治 效果好，制备效率高，可以防治多种细菌性病害的枯草芽孢杆菌及其制备方法和用途。
[0008] 本发明的技术方案如下：
[0009] 上述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，其保藏号为CGMCC NO :9269。
[0010] 所述枯草芽孢杆菌，其中：所述菌种属于细菌域（Bacteria)~厚壁菌门 (Firmicutes)~芽抱杆菌纲（Bacilli)~芽抱杆菌目（Bacillales)~芽抱杆菌科 (Bacillaceae)~芽抱杆菌（Bacillus)~枯草芽抱杆菌（B. subtilis)，菌种代号为M22,在 自然界中以活芽孢形式存在。
[0011] 所述枯草芽孢杆菌，其中，所述菌种的有效成分分析方法为：采用稀释平板法，将 稀释后菌悬液定量接种于培养基中，待枯草芽孢杆菌在培养基内长出菌落，计数枯草芽孢 杆菌菌落数，以测定样品的单位重量活芽孢数。
[0012] 所述枯草芽孢杆菌，其中：所述菌种能够用于制造孢子数为2000亿活芽孢/克的 原粉，杂菌率< 5%。
[0013] 一种枯草芽孢杆菌的制备方法，其包括以下步骤：（1)配制菌种，即将10个克氏 瓶种子加无菌水做成菌悬液，在无菌条件下接种到大罐中；（2)发酵培养基，即将含量为 2. 0%~3. 2%且细度大于80目的啤酒酵母粉、含量为1. 0%~1. 6%的工业级玉米淀粉、 含量为0. 2 %~0. 6 %的工业级碳酸钙、含量为0. 2 %~0. 6 %的工业级磷酸二氢钾、含量为 0. 2%~0. 6%的工业级硫酸铵和含量为0. 02%~0. 04%的工业级消泡剂放入灭菌后体积 为发酵罐60 %容积的罐中，灭菌前pH7. 3~7. 5 ;然后在0~6h这段时间内保持通气量为 1 : 0.6,在6~IOh这段时间内保持通气量为1 : 0.7, IOh至放罐通气量为I : 1;在0~ 24h这段时间内温度为31 °C~32 °C，24h至放罐这段时间内温度为30 °C~31 °C，罐内压力 为0. 05MPa，搅拌转速为150r/min。
[0014] (3)后处理，即发酵38小时左右，镜检看到视野内80%以上的成熟孢子，放罐至调 浆罐，调pH至5. 0,加入辅料后喷雾干燥；最后，按比例加入助剂形成制剂，加入助剂将原药 稀释为100亿/克，助剂白炭黑为总质量的8%~12%，茶皂素为总质量的5%~8%，其余 为娃藻土。
[0015] 所述枯草芽孢杆菌的制备方法，其中，所述步骤（3)中所述辅料是由发酵液中干 物质的质量百分数为：3%的木质素磺酸钠、3%的十二烷基磺酸钠、8%的氯化钠和0.5% 的白炭黑组成。
[0016] 所述枯草芽孢杆菌的制备方法，其中：所述步骤（3)中喷雾干燥在进风温度为 140°C，出风温度为80°C下可制成孢子数为2000亿活孢子数/克的原粉。
[0017] 一种枯草芽孢杆菌的用途，其中：所述菌种的摇培液对靶标菌水稻白叶枯病菌、靶 标菌烟草青枯病菌、靶标菌烟草野火病菌、靶标菌柑橘溃疡病菌和靶标菌白菜软腐病菌均 具有明显的抑制作用。
[0018] 有益效果：
[0019] 本发明枯草芽孢杆菌具有有生长繁殖快、发酵周期短、下罐孢子数高和防治效果 好等优点。
[0020] 本发明枯草芽孢杆菌的制备方法步骤简单、操作方便，是由深度发酵、陶瓷膜浓缩 和喷雾干燥得到枯草芽孢杆菌，制备效率高、效果好；采用液体发酵取得发酵液，预处理后 用膜分离设备浓度，然后进行喷雾干燥得到原粉；膜分离设备收率高，可以得到2000亿活 孢子数/克的原粉。
[0021] 本发明枯草芽孢杆菌可以防治多种细菌性病害，目前已登记在白菜软腐病、柑橘 溃疡病、烟草野火病、烟草青枯病和水稻白叶枯病上。
【具体实施方式】
[0022] 本发明枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)的保藏号为CGMCC NO :9269,其 属于细菌域（Bacteria)，厚壁菌门（Firmicutes)，芽孢杆菌纲（Bacilli)，芽孢杆菌 目（Baci Ilales)，芽抱杆菌科（Baci Ilaceae)，芽抱杆菌（Bacillus)，枯草芽抱杆菌 (B. subtilis)，菌种代号M22,在自然界中以活芽孢形式存在。
[0023] 本发明枯草芽孢杆菌原粉的有效成分含量为2000亿活芽孢/克，杂菌率< 5%。
[0024] 本发明枯草芽孢杆菌制剂中其他组成成分名称及含量，如下表1所示：
[0025] 表 1
[0026]
【主权项】
1. 一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，其特征在于所述菌种的保藏号为CGMCC NO ：9269〇
2. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述菌种属于细菌域 (Bacteria)~厚壁菌门（Firmicutes)~芽抱杆菌纲（Bacilli)~芽抱杆菌目 (Bacillales)~芽抱杆菌科（Bacillaceae)~芽抱杆菌（Bacillus)~枯草芽抱杆菌 (B. subtilis)，菌种代号为M22,在自然界中以活芽孢形式存在。
3. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述菌种的有效成分分析方法为： 采用稀释平板法，将稀释后菌悬液定量接种于培养基中，待枯草芽孢杆菌在培养基内长出 菌落，计数枯草芽孢杆菌菌落数，以测定样品的单位重量活芽孢数。
4. 如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述菌种能够用于制造孢子数为 2000亿活芽孢/克的原粉，杂菌率< 5%。
5. -种如权利要求1至4任意一项所述的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于包括 以下步骤： (1) 配制菌种 即将10个克氏瓶种子加无菌水做成菌悬液，在无菌条件下接种到大罐中； (2) 发酵培养基 将含量为2. 0%~3. 2%且细度大于80目的啤酒酵母粉、含量为1. 0%~1. 6%的工业 级玉米淀粉、含量为〇. 2 %~0. 6 %的工业级碳酸钙、含量为0. 2 %~0. 6 %的工业级磷酸二 氢钾、含量为〇. 2%~0. 6%的工业级硫酸铵和含量为0. 02%~0. 04%的工业级消泡剂放 入灭菌后体积为发酵罐60%容积的罐中，灭菌前pH7. 3~7. 5 ;然后在0~6h这段时间内 保持通气量为1 : 0.6,在6~IOh这段时间内保持通气量为1 : 0.7, IOh至放罐通气量 为I : 1;在0~24h这段时间内温度为31°C~32°C，24h至放罐这段时间内温度为30°C~ 31°C，罐内压力为0? 05MPa，搅拌转速为150r/min。 (3) 后处理 即发酵38小时左右，镜检看到视野内80%以上的成熟孢子，放罐至调浆罐，调pH至 5.0,加入辅料后喷雾干燥； 最后，按比例加入助剂形成制剂，加入助剂将原药稀释为100亿/克，助剂白炭黑为总 质量的8%~12%，茶皂素为总质量的5%~8%，其余为硅藻土。
6. 如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，所述步骤⑶中所述辅 料是由发酵液中干物质的质量百分数为：3 %的木质素磺酸钠、3 %的十二烷基磺酸钠、8 % 的氯化钠和〇. 5%的白炭黑组成。
7. 如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：所述步骤（3)中喷雾 干燥在进风温度为140°C，出风温度为80°C下可制成孢子数为2000亿活孢子数/克的原 粉。
8. -种如权利要求1至4任意一项所述的枯草芽孢杆菌的用途，其特征在于：所述菌 种的摇培液对靶标菌水稻白叶枯病菌、靶标菌烟草青枯病菌、靶标菌烟草野火病菌、靶标菌 柑橘溃疡病菌和靶标菌白菜软腐病菌均具有明显的抑制作用。
【专利摘要】本发明涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌种的保藏号为CGMCC NO：9269。该菌种是由深度发酵、陶瓷膜浓缩、喷雾干燥得到。该菌种的摇培液对靶标菌水稻白叶枯病菌、靶标菌烟草青枯病菌、靶标菌烟草野火病菌、靶标菌柑橘溃疡病菌和靶标菌白菜软腐病菌均具有明显的抑制作用。本发明枯草芽孢杆菌具有生长繁殖快、发酵周期短、下罐孢子数高和防治效果好等优点；同时，该菌种的制备方法步骤简单、操作方便，是由深度发酵、陶瓷膜浓缩和喷雾干燥得到枯草芽孢杆菌，制备效率高、效果好；该菌种可以防治多种细菌性病害，目前已登记在白菜软腐病、柑橘溃疡病、烟草野火病、烟草青枯病和水稻白叶枯病上。
【IPC分类】C12N1-20, A01P1-00, A01N63-02, C12R1-125
【公开号】CN104805031
【申请号】CN201410473208
【发明人】易虹, 王敏, 杨文亮, 章丽, 田利, 崔占东, 穆春, 董蕾, 余满
【申请人】德强生物股份有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2014年9月17日