一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物及制备方法、邻苯二甲酸丁基苄酯的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物及制备方法、邻苯二甲酸丁基苄酯的检测方法。半抗原衍生物为4-氨基邻苯二甲酸丁基苄酯，衍生物制备方法步骤包括：4-硝基邻苯二甲酸酐水解酯化反应、水解酯化产物与氯化苄反应制得4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯、4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯还原得到最终产物，检测方法包括抗原、抗体制备、标准曲线的绘制及样品邻苯二甲酸丁基苄酯含量测定。检测方法技术灵敏度高，选择性强，检测时间短，成本低。
【专利说明】一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物及制备方法、邻苯 二甲酸丁基苄酯的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于有机合成【技术领域】，特别涉及一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物 及制备方法、邻苯二甲酸丁基苄酯的检测方法。
【背景技术】
[0002] 环境激素，又称环境荷尔蒙，是指外源性干扰生物和人体正常内分泌机能的化学 物质，主要由人类活动释放到环境中，并对人体和生物体内的正常激素功能施加影响，具有 类似雌性激素的作用，从而导致包括人类在内的各种生物的生殖功能下降、生殖器肿瘤、免 疫力降低，并可引起各种生理异常。
[0003]邻苯二甲酸酯类物质是一种环境激素类物质中的一类化合物，主要用作增塑剂。 邻苯二甲酸丁基节酯（Benzylbutylphthalate，BBP)是常见的一种邻苯二甲酸酯类化合 物，在涂料、农药、化妆品、香料和食品包装材料等的生产中非常常见。由于塑料制品在生活 中被广泛使用，从而产生大量的塑料垃圾，加之最近几年频频发生的塑化剂在酒、奶茶等相 关食品中超标的发生，为大众敲响了警钟。邻苯二甲酸丁基苄酯是一种低毒物质。其沸点 高、不易挥发、空气中浓度不高，不容易引起工业中毒，正是因为这一特性人们一直忽视了 邻苯二甲酸酯类的污染特性而大量地使用。这类物质进入人体后，与相应的激素受体结合， 干扰血液中激素的正常水平的维持，从而影响人的生殖、发育和行为，长期接触环境激素可 对人体造成慢性危害，主要表现为对人和动物的生殖毒性。邻苯二甲酸酯类含有较弱的荷 尔蒙活性成分，在人和动物的体内起着类似雌性激素的作用，可导致内分泌紊乱、生殖机能 失常。邻苯二甲酸酯类对人体健康的影响是一个慢性的过程，可以通过胎盘和授乳产生跨 带的影响。目前主要通过动物实验对其毒性进行研究。PAEs能引起大鼠睾丸的严重萎缩， 输精管变形等危害。国内外有许多关于PAEs的报道。
[0004]所以对BBP的检测显得十分重要。目前邻苯二甲酸酯类的检测方法主要有气相色 谱法（GC)、高效液相色谱法（HPLC)和气相色谱-质谱法（GC-MS)等。谢利等人采用GC-FID 法测定五种邻苯二甲酸酯的含量，检出限为0. 9?2. 9yg/ml。王东辉等人采用反相液相色 谱串联质谱技术（LC-MS-MS)测定食品包装的塑料中的八种邻苯二甲酸酯的含量，最低检 出限为0. 〇lmg/kg。这类分析方法测定污染物灵敏度不高，选择性不好，并且检测过程中需 要将待测污染物从样品中分离提取并去除杂质干扰，过程十分复杂，操作费时繁琐，仪器和 分析成本昂贵。所以开发一种简单、快速、适用于现场监控的痕量分析方法具有重要的现实 意义。
[0005]环境荷尔蒙物质常常以ppt浓度甚至ppq浓度存在，这对环境监测分析提出了很 高的要求。目前对邻苯二甲酸丁基苄酯的检测主要是气相色谱、液相色谱和质谱联用等技 术，但是由于色谱技术测定过程比较复杂，操作繁琐，检测成本昂贵，分析周期较长并且检 测的灵敏度也有限制，难以适应环境激素的检测要求。因此人们迫切需要一种操作简单、灵 敏度高、成本低的检测方法。免疫分析法以其特异性和高灵敏的荧光、化学发光、纳米等技 术结合建立相应的荧光免疫等方法可以满足此项要求。自1958年BersonS.A和Yellow创立了放射免疫分析以来，其他各种免疫分析方法如酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、化 学发光免疫分析法等已在分析检测各种蛋白质、激素、小分子物质等中得到广泛的应用。
[0006] 近年来，多种邻苯二甲酸酯类环境激素免疫分析已经相继被报道，但是文献没有 涉及到邻苯二甲酸丁基苄酯的半抗原衍生物、全抗原及免疫分析的报道。由于邻苯二甲酸 丁基苄酯是小分子物质，其具有反应特异性，但不具备免疫原性。要制备相应的抗体必须先 得到免疫原。又由于邻苯二甲酸丁基苄酯中不含有能与相应蛋白质偶联的基团，先须制备 相应的半抗原衍生物。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生 物及制备方法、邻苯二甲酸丁基苄酯的检测方法。本发明邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生 物制备方法操作简单、产率高，可以得到满足制备免疫原纯度要求的半抗原衍生物。检测方 法灵敏度高，选择性强，检测时间短，成本低。
[0008] 本发明采用的技术方案是：
[0009] -种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物，其结构为：
[0010]
【权利要求】
1. 一种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物，其结构为：
2. -种邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物的制备方法，步骤包括： A、 将4-硝基邻苯二甲酸酐与无水正丁醇混合后加热到100?130°C，使其完全溶解成 无色透明液体，在105?115°C下搅拌回流进行水解酯化反应； B、 在碱性条件和催化剂催化条件下，将步骤A制得的产物与氯化苄在100?120°C下反 应2. 5?4小时，制得4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯； C、 将4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯溶于有机溶剂中，在酸性条件下与还原剂室温下反 应12?24小时后，向反应体系中加入0?KTC的冷水，并用无机碱调节pH值至9?10 ; 分离出有机层，水层再用有机溶剂萃取，合并萃取液，水洗后用干燥剂干燥；蒸馏除去有机 溶剂，得到固体，纯化分离，得到邻苯二甲酸丁基苄酯半抗原衍生物。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤A中4-硝基邻苯二甲酸酐与 无水正丁醇的物质的量比为1 :1?3,水解酯化反应时间为0. 5?2小时。
4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤B中步骤A制得的产物与氯 化苄物质的量之比为1 :1?2。
5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于： 所述步骤B中碱性条件通过下述方法获得： 将步骤A中反应后的液体冷却到70?90°C，用碱性溶液中和，再用碱性溶液调节溶 液pH至8?8. 5之间，中和用的碱性溶液选用氢氧化钠，氢氧化钠溶液的百分比为20%? 50%，调节溶液pH的碱性溶液选用碳酸钠，碳酸钠溶液的百分比为10 %?30%。
6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤B中催化使用的催化剂选自 聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇800中的一种或几种，催化剂与步骤A制得的产物的 质量比为。
7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤C中有机溶剂选自苯、甲苯、 二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、乙醚中的一种或几种，优选苯；4-硝基邻苯二甲酸丁基 苄酯在有机溶剂中的浓度为0. 02?0. 04g/ml。
8. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤C中酸性条件通过下述方法 获得： 向溶解4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯的有机溶剂中加入强酸，室温下搅拌10?30分 钟，并使得4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯与强酸的物质的量之比为1 :15?30 ;所述强酸为 浓硫酸或浓盐酸，优选浓盐酸。
9. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤C中还原剂选自锌粉、铁粉、 镁粉中的一种或几种，优选锌粉；4-硝基邻苯二甲酸丁基苄酯与还原剂的物质的量之比为 1 :8 ?25。
10. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的无机碱选自氢氧化钠、碳酸钠、 碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾中的一种或几种，优选氢氧化钠。
11. 一种邻苯二甲酸丁基苄酯的检测方法，步骤包括： a、 邻苯二甲酸丁基苄酯的免疫全抗原和包被抗原的制备：将由邻苯二甲酸丁基苄酯制 备的4-氨基邻苯二甲酸丁基苄酯中加入无机酸，0?5°C下搅拌5?15分钟，缓慢加入亚硝 酸钠，反应30?60分钟；之后加入少量尿素；将牛血清蛋白（BSA)溶于四硼酸钠溶液中制 得浓度为〇. Olmol/L的牛血清蛋白溶液，然后逐滴加入到上述溶液中，调节pH至9?9. 4， 溶液呈现橙黄色，〇?5°C下搅拌3?6小时，得到抗原的粗产品。将反应液装入透析袋中， 置于二次水中透析5?7天，得到邻苯二甲酸丁基苄酯的免疫全抗原； 包被抗原的制备基本同免疫全抗原，不同处在于使用卵清蛋白（OVA)代替牛血清蛋白 (BSA)； b、 邻苯二甲酸丁基苄酯抗体的制备： 以哺乳动物作为免疫对象，步骤a制得的邻苯二甲酸丁基苄酯免疫抗原用0. 85 %生理 盐水稀释一倍，和完全弗氏佐剂已1:1体积比混溶后充分乳化，进行初次免疫注射，3周后 再将邻苯二甲酸丁基苄酯免疫抗原与不完全弗氏佐剂进行强化免疫，以后每2周再次加强 免疫，从第二次加强免疫开始，每次免疫后第7天静脉采血，测定血清效价，当效价不再变 化时,加强一次免疫,1周后心脏采血,纯化,得到抗体。 c、 标准曲线的绘制及样品邻苯二甲酸丁基苄酯含量测定： (1)每孔50?150 μ L包被抗原BBAP-OVA包被96孔酶标板；0?5°C下培养12小时， 37°C下温育2?3小时；甩干，每孔加入1/4?3/4体积的PBST洗涤2?5次，每次2?6 分钟； ⑵每孔加入150?250 μ L封闭液封闭各孔；封闭液选自1?5%卵清蛋白溶液、含有 1?3%吐温-20的1?5%卵清蛋白溶液、以PBS为溶剂的质量百分比为1?5%的脱脂 奶粉溶液中的一种，优选1?2%脱脂奶粉溶液；37°C下温育0. 5?1. 5小时，甩干，每孔加 入1/4?3/4体积的PBST洗涤2?5次，每次2?6分钟； (3)加入30?60 μ L/孔浓度浓度分别为0. 0001?1000ng/mL邻苯二甲酸丁基苄酯标 准溶液和样品溶液，30?60 μ L抗邻苯二甲酸丁基苄酯抗体，每孔加入的邻苯二甲酸丁基 苄酯标准溶液、样品溶液和抗邻苯二甲酸丁基苄酯抗体的体积优选每孔加入45?55 μ L ; 37°C下温育1?3小时，甩干，每孔加入1/4?3/4体积的PBST洗涤2?5次，每次2?6 分钟； ⑷每孔加入50?150 μ L生物素标记的羊抗兔IgG ;37°C下温育1?3小时，甩干，每 孔加入1/4?3/4体积的PBST洗涤2?5次，每次2?6分钟； (5) 每孔加入50?150 μ L HRP标记的链霉亲和素；37°C下温育25?60分钟，甩干， 每孔加入1/4?3/4体积的PBST洗涤2?5次，每次2?6分钟； (6) 每孔加入50?150 μ L底物液，37°C下温育15?45分钟； (7) 每孔加入30?60 μ L终止液，测定吸光度值，绘制标准曲线； (8) 根据工作曲线求得待测样品溶液中邻苯二甲酸丁基苄酯的含量。
12. 如权利要求11所述的检测方法，其特征在于：所述步骤a中4-氨基邻苯二甲酸丁 基苄酯与无机酸的物质的量之物为1 :2?5 ;4_氨基邻苯二甲酸丁基苄酯与亚硝酸钠的物 质的量之比为1 :1?I. 5 ;4-氨基邻苯二甲酸丁基苄酯与尿素的物质的量之比为I :0. 5? 1. 5 ;4_氨基邻苯二甲酸丁基苄酯与牛血清蛋白的质量之比为I :2. 5。
【文档编号】G01N33/543GK104370761SQ201410512584
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】张明翠, 洪文童 申请人:安徽师范大学