杂交瘤细胞dbp-4e10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的制作方法
【专利说明】杂交瘤细胞DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及杂交瘤细胞株DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体。
【背景技术】
[0003]邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)是一类环境激素类物质，具有雌激素活性，干扰生物体内分泌系统正常功能、导致突变、畸变和癌细胞增殖。2005年，欧盟将邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)评定为“第二类生殖毒性”。其中，DBP被认为是毒性最高的酞酸酯类化合物。
[0004]PAEs化合物是塑料工业的主要增塑剂和软化剂，广泛应用于食品包装材料、容器、医疗用品及塑料等的制造。由于其广泛应用以及从各种制品中的释放，酞酸酯类化合物已经几乎渗透到我们生活的每一个角落。研宄表明，我国居民DBP每日摄入量为12.2mg/kg，超过世界卫生组织建议的10mg/kg.d的每日最大容许摄入量标准。食品被认为是人类暴露于酞酸酯类化合物的主要途径。食品中酞酸酯类化合物的污染主要来自于食品的塑料包装以及生产过程。这是因为酞酸酯是一种脂溶性化合物，它很容易进入食品的脂肪、油脂中，并在其中富集。
[0005]DBP现有的检测方法GC、MS、HPLC测定DBP灵敏度高、精确度好，而且能分别测定结构相似的多种化合物及其异构体，是目前最理想的检测方法。但是这类分析方法体系将待测污染物从样品中分离提取并去除杂质干扰的前处理过程十分复杂，操作费时，分析成本昂贵。所以开发操作简单、快速、经济且灵敏度高的检测方法具有重要的实际意义。
[0006]免疫分析方法将免疫反应的高特异性和现代测试手段高灵敏性相结合，具有快速、经济、样品所需量少、前处理简单等优点，成为现代生物化学、医学、化学分析和环境监测等领域的研宄热点。免疫分析是利用抗原抗体的特异性的结合反应和抗原、抗体上的标记物的放大作用来对超微量待测物进行定性、定量检测，所以要研宄建立针对邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的抗体。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株DBP-4E10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯DBP的单克隆抗体
本发明提供了杂交瘤细株DBP-4E10，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC N0.10202。分类命名为S/P20杂交瘤细胞。
[0008]抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体由保藏编号为CGMCC N0.10202的杂交瘤细胞株DBP-4E10分泌产生。该DBP单克隆抗体可以识别邻苯二甲酸二丁酯，对邻苯二甲酸二丁酯的50%抑制浓度IC50为0.22 mg/Lo
[0009]抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体在邻苯二甲酸二丁酯测定中的应用。
[0010]本发明提供的杂交瘤细胞株DBP-4E10单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是:以4-硝基邻苯二甲酸酐在H2SO4作用下和正丁醇反应生成4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，然后将硝基还原成氨基，在最后在盐酸和亚硝酸钠的存在下发生重氮化作用然后和BSA偶联生成DBP-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的DBP-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗邻苯二甲酸二丁酯而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用DBP作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞DBP-4E10。
[0011]本发明提供的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株DBP-4E10注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体。
[0012]上述纯化方法的具体操作为:腹水于4°C，3000r/min离心5min以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33yL，室温混合30min，4°C静置2h以上，使其充分沉淀。然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4°C预冷I小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4°C静置2h以上，然后40C 12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20°C冰箱中备用；
醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至10mL ；
0.1mol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，
0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL。
[0013]0.01mol/L磷酸盐缓冲液:用纯水将0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。
[0014]本发明的有益效果在于:
I本发明提供的杂交瘤细胞DBP-4E10可以用于制备高效价的抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体，将邻苯二甲酸二丁酯小鼠腹水抗体酶联免疫吸附方法测定的效价达到3.12X 106，即腹水稀释至3.12 X 16时溶液测定结果仍为阳性。
[0015]2本发明提供的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对邻苯二甲酸二丁酯的半抑制浓度IC50为0.22 mg/L，与邻苯二甲酸二乙丁酯的交叉反应率36.9%，与邻苯二甲酸丁苄酯的交叉反应率10.7%，与其他结构类似物的交叉反应率均小于1%。
[0016]3本发明提供的抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体可用于测定邻苯二甲酸二丁酯的含量。
【附图说明】
[0017]图1 DBP-4E10单克隆抗体对DBP的标准曲线。
【具体实施方式】
[0018]实施例1:杂交瘤细胞株DBP-4E10的筛选
1.抗原的合成及动物的免疫
4-硝基邻苯二甲酸酐与正丁醇生条件下发生酯化反应，得到4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，再在酸性条件下与锌粉发生还原反应，得到半抗原衍生物4-氨基邻苯二甲酸二丁酯酯，有苯氨基的邻苯二甲酸酯半抗原衍生物在低温下与NaN02和浓HCl发生重氮化反应，生成相应的重氮盐；重氮盐与载体蛋白发生偶联反应，得到相应的人工抗原。
[0019]4-硝基邻苯二甲酸二丁酯的合成
将2.5克4-硝基邻苯二甲酸溶于50mL正丁醇中，向其中缓慢滴入ImL浓H2S04作催化剂，在120°C下反应并不断搅拌。反应结束后，用10%NaC03洗涤三次，每次10mL。80°C旋转蒸发除去正丁醇和水。得油状物质4-硝基邻苯二甲酸二丁酯，称重。
[0020]4-氨基邻苯二甲酸二丁酯酯的合成
称取0.1523克4-硝基邻苯二甲酸二丁酯；加入28mL苯和0.28g锌粉，然后分三次加入8.2mL浓HC1，搅拌反应18min后再加入0.28克锌粉，室温搅拌反应12h。反应结束后，分液；然后用34mLH20清洗苯层，分别用5g无水Na2S04干燥苯层三次，50°C旋转蒸发除去苯。得黄色4-氨基邻苯二甲酸二丁酯固体，称重。
[0021]人工抗原的合成
配置A液:称取0.0466克4-氨基邻苯二甲酸二丁酯于50mL三角瓶中，依次加入0.1mL浓HCl、3mLH20和2mL 二甲基甲酰胺。置冰浴5度下，搅拌。逐滴加入0.2mol/L亚硝酸钠，至淀粉KI试纸变蓝，反应30分钟。
[0022]配置B液:4mg/mLBSA的硼酸钠缓冲溶液(ρΗ9.0) 40mL。
[0023]将B液逐滴加入A液中，逐渐有橙红色溶液出现，继续反应2h，得粗产品。反应液装入透析袋中，磷酸盐缓冲液(PH7.4 0.0lmol/L)透析3天，每天换两次透析液。收集透析袋内的液体，即为制得的DBP-BSA人工抗原。
[0024]人工抗原的鉴定
通过紫外光谱扫描法鉴定表明制备得到了邻苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP-BSA。
[0025]购买6周龄雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的邻苯二甲酸二丁酯的完全抗原DBP-BSA。第一次免疫将完全抗原DBP-BSA与等量弗氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积完全抗原DBP-BSA乳化，免疫剂量与方法与首免相同。第三次免疫与第二次免疫间隔时间3周，免疫剂量和方法与第二次相同。第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式及免疫剂量与第三次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠50yg。前3次每次免疫后一周，眼周采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免