杂交瘤细胞dbp-4e10及其产生的邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体的制作方法_2

文档序号:8392394阅读:来源:国知局
疫后3天,尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价,并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度,选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫,免疫剂量为之前的2倍。
[0026]2.细胞融合
最后一次加强免疫3天后,米用50% (重量百分比)的聚乙二醇(PEG,分子量1460)作融合剂,按常规方法进行细胞融合。具体步骤如下:
将BALB/c小鼠脱颈处死,浸泡于75%酒精中。约3 min后放入超净台。用镊子提起小鼠腹部皮肤,用手术剪剪一个小口(注意勿剪破腹膜),然后用镊子向头、尾两个方向撕开皮肤,充分暴露腹膜。换用干净剪刀剪开腹膜,取出脾脏,放入已盛有1mL不完全培养液的平皿中清洗一次,并剥去结缔组织。将脾脏转入另一盛有5 mL不完全培养液的平皿中,取一铜网,将脾脏置于铜网上,用注射器内芯研磨脾脏,并用平皿内的不完全培养液冲洗铜网,使脾细胞全部通过网孔进入溶液中。将脾细胞溶液转入50 ml离心管中,加不完全培养液至30 mL,混匀。1000 rpm离心5 min,弃上清。沉淀细胞再用不完全培养液离心一次,然后将细胞悬于10 ml完全培养液中,混匀。细胞计数,备用。
[0027]将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10的比例混合,在50 mL离心管中用DMEM培养基洗I次,1200 rpm离心8 min ;弃上清,用吸管吸净残留液体。用50%PEG融合,用含20%牛血清、1% HAT DMEM培养基重悬。将上述细胞,加到已有饲养细胞层的96孔板内,每孔加100 μ L。将培养板置37°C、5%C02培养箱中培养。DMEM培养基为含有2% (重量百分数)生长因子的DMEM基础培养基,DMEM基础培养基购于Hyclone公司,1%HAT (次黄嘌呤一氨基蝶呤一胸腺啼啶核苷购于Gibco公司。
[0028]3.细胞株的筛选及克隆
待细胞融合后第10天左右,细胞集落长到占孔底1/2面积大小,即可进行抗体检测。采用ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选,筛选分两步进行,第一步采用间接ELISA法筛选出抗邻苯二甲酸二丁酯而不抗载体蛋白BSA的阳性孔;第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔进行检测,用邻苯二甲酸二丁酯作为竞争原,选择吸光值和灵敏度均较高的孔(吸光值较高指竞争原为O的孔即阴性对照孔的最终测定值较高,灵敏度较高指抑制率为50%时的竞争原浓度亦即IC 50值较小),采用有限稀释法将杂交瘤细胞克隆化,克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测,如此重复克隆2-3次后,获得杂交瘤细胞株DBP-4E10。
[0029]实施例2:抗体的制备、纯化及鉴定
将实施例1获得的将获得的杂交瘤细胞株DBP-4E10注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠,收集该小鼠的腹水,纯化处理后获得抗邻苯二甲酸二丁酯的单克隆抗体。
[0030]具体操作为:腹水于4°C 3000r/min离心5min以上,吸取上清,将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合,边搅拌边缓慢加入正辛酸,每毫升腹水所需的正辛酸体积为33 yL,室温混合30min,4°C静置2h,使其充分沉淀。然后4°C 12000r/min离心30min,弃沉淀,将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后,加入1/10滤液体积的0.lmol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液,用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4,4 °C预冷I小时,缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%,4°C静置2h,4°C 12000r/min离心30min,弃上清,将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬,装入透析袋,用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析,将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油,置_20°C冰箱中备用; 醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸,纯水定容至10mL ;
0.lmol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠,0.29g十二水磷酸氢二钠,0.02g氯化钾,0.02g磷酸二氢钾,加水定容至100mL。
[0031]0.01mol/L磷酸盐缓冲液:用纯水将0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。
[0032]用常规非竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得2D10的鼠腹水抗体的效价可达3.12X106,即腹水稀释至3.12X106时测定结果为阳性。用常规间接竞争ELISA法鉴定其对对邻苯二甲酸二丁酯的半抑制浓度IC50为0.22 mg/L,与邻苯二甲酸二乙丁酯的交叉反应率36.9%,与邻苯二甲酸丁苄酯的交叉反应率10.7%,与其他结构类似物的交叉反应率均小于1%。
[0033]实施例3:抗体的应用
将杂交瘤细胞株DBP-4E10分泌的抗邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体用于邻苯二甲酸二丁酯单克隆ELISA添加回收试验,具体步骤如下:
(I)包被:使用96孔聚苯乙烯酶标板,用0.05mol/L pH 9.6的碳酸缓冲液将DBP-BSA稀释到I μ g/mL,用多道可调式移液枪(简称排枪)往每孔中加入100 μ L,加完后将酶标板用保鲜膜盖住,置于4°C过夜。
[0034](2)洗板:第二天,将酶标板从4°C取出,使用PBST洗涤,每孔250 μ 1,洗涤4次,洗完后在毛巾上拍干。
[0035](3)封闭:用排枪往每孔中加入200 μ L 1% BSA的PBS,加完后将酶标板用盖盖住,置于37°C放置2h。使用PBST洗涤,每孔250 μ 1,洗涤4次,洗完后在毛巾上拍干。
[0036](4)用 35% 甲醇配制 0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 mg/L 的邻苯二甲酸二丁酯标准溶液。将标准溶液及待检测样品提取液,分别加入已经封闭好的酶标板中,50mL/孔,每个样品3个重复孔,再加入稀释成1:50000邻苯二甲酸二丁酯单克隆抗体50mL/孔,再加入稀释成1:3000的酶标二抗50mL/孔,轻轻拍打酶标板后37°C恒温箱中反应40min。
[0037](5)洗板:操作同上。
[0038](6)显色:将显色液A和显色液B按1:1的体积比混合,用排枪加入混合好的显色液10mL/孔,置37°C恒温箱避光环境反应lOmin。
[0039](7)测定:使用排枪加入2mol/L H2SO4 50mL/孔,轻轻振荡酶标板,使用酶标仪检测450/630nm波长处OD值。
[0040](8)添加回收率及样品前处理:称取5g白酒置于干净的1mL玻璃试管中,分别添加1.5、3、5mg DBP,加入2mL色谱纯的正己烷,盖上盖后振荡3min,静置,待分层后取上层清液lmL,于干净的玻璃器皿中挥干。挥干后用ImL 35%的甲醇重溶,转移至1.5ml离心管后作为ELISA样品提取液待测。采用间接竞争ELISA进行添加回收率实验,回收率分别为78.1,89.9,109.3%。
[0041](9)溶液的配置:碳酸缓冲液:称取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g,加入纯水至990mL,调pH至9.6,再用纯水定容至1000mL,4°C贮存备用。磷酸缓冲液(PBS): 8.5gNaCl, 2.2g Na2HPO412H20,0.2g NaH2P042H20,溶于 900mL纯水中,调pH至7.4,定容至 1000mL。PBST:取500mL PBS,加入0.25mL吐温20,混匀备用。
[0042]显色液A:20mg TMB溶于1mL DMSO中,4°C保存,临用前取出恢复至室温,用纯水稀释至lOOmL。
[0043]显色液B:21g —水合柠檬酸,71.1g Na2HP0412H20,2g过氧化氢尿素,加纯水定容至 lOOOmL。
[0044]酶标二抗购自于SoutherB1tech公司。
【主权项】
1.杂交瘤细胞株DBP-4E10,其特征在于:已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏编号为CGMCC N0.10202。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株DBP-4E10分泌的抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体,其特征在于:它由所述的杂交瘤细胞株DBP-4E10所分泌产生。
3.权利要求2所述的抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体的应用,其特征在于在邻苯二甲酸二丁酯DBP分析检测中的应用,对邻苯二甲酸二丁酯DBP具有较好的亲和力和检测灵敏度,用于食品安全中邻苯二甲酸二丁酯DBP免疫检测。
【专利摘要】本发明提供了杂交瘤细胞株4E10、其分泌产生的抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体及其应用。该杂交瘤细胞株4E10可以用于制备高效价邻苯二甲酸二丁酯DBP抗体,鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达3.12×106;该抗邻苯二甲酸二丁酯DBP单克隆抗体灵敏度高,对邻苯二甲酸二丁酯DBP的50%抑制浓度即IC50为0.22mg/mL,其用于测定邻苯二甲酸二丁酯DBP含量,实际应用价值大。CGMCC NO. 1020220141212
【IPC分类】C07K16-44, G01N33-577, G01N33-74, C12N5-20
【公开号】CN104711230
【申请号】CN201510020296
【发明人】时国庆, 孙清, 邓乾民, 栗时锋, 高永杰, 曹雨
【申请人】北京科技大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年1月15日
当前第2页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1