一种新型的制备经血间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型的制备经血间充质干细胞的方法。具体而言，本发明涉及一 种新型的采集、分离和储存经血间充质干细胞的方法，属于生物医学领域。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多 种功能细胞。干细胞的研宄受到越来越多的关注。目前干细胞来源可分为胚胎干细胞和成 体干细胞。然而由于胚胎干细胞涉及伦理道德方面的争议，严重限制了其在临床上的运用。 成体干细胞分为神经干细胞、血液干细胞、间充质干细胞，表皮干细胞等，其中间充质干细 胞（mesenchymalstemcells，MSCs)是目前最受关注的干细胞成员之一，这是因为具有高 度自我更新能力和多向分化潜能。MSC最初在骨髓中发现，然而骨髓间充质干细胞的获得具 有侵入性从而制约了其在临床中的应用。理想的干细胞应具备无伦理道德的争议、易于获 得、高度增殖能力以及多向分化的潜能等特性。
[0003] 近年来，日本科学家Hida在女性经血中发现了具有多向分化潜能的干细胞，该 干细胞可用于修复受损的心肌组织。2008年，美国科学家Patel等发现，从健康女性经血 中可分离出来间充质干细胞，这些细胞具有多向分化能力，并将该细胞命名为经血源间充 质干细胞（menstrualblood-derivedmesenchymalstemcells,MenSCs)。经血的获得不 具有侵入性不会对供者造成伤害，MenSCs不仅来源广泛，且对其研宄不会涉及伦理道德和 法律问题。此外，MenSCs还具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干 细胞研宄的一种理想种子细胞，因此成为寻找人类间充质干细胞新来源及提高临床应用效 果的研宄热点。
[0004] 中国专利申请CN103966162A公开了一经血来源间充质干细胞分离方法，该方法 包括：a.收集经血，并保存在作为保存液的特定磷酸盐缓冲液中于4°C下保存；b.加入PBS 缓冲液，过滤，将滤液离心，分离，提取到中间白膜层物质；c.将其加入PBS缓冲液中离心， 取沉淀细胞；d.将沉淀细胞B培养；和e.收集所培养的细胞。
[0005] 中国专利申请CN103849944A公开了一种宫膜干细胞库的构建方法，该方法包括： 包括月经血采集、宫膜干细胞分离除菌、扩增及分析检测、长期保存及定期检测的步骤，其 中月经血采集包括使用月事杯收集月经血，并保存在月经血保存液中，所述月经血保存液 为添加肝素钠的PBS盐缓冲溶液或SPB盐缓冲溶液，其中还可以添加抗菌物质，如两性霉 素、青霉素、链霉素等。宫膜干细胞分离除菌包括用密度梯度离心或磁珠分选得到单个核细 胞，并在密度梯度离心前后多次用缓冲液冲洗去除残余细菌和杂质。
[0006] 中国专利申请CN101914494A公开了经血源性间充质干细胞分离培养，该方法包 括：收集月经血，加入两性霉素B、青/链霉素、EDTA-Na2K止病原微生物污染；采用密度梯 度离心法分离出单个核细胞；洗涤后离心，并培养传代。
[0007] 另外，周云帆等人（中国组织工程研宄与临床康复，第14卷第32期，5952-5956 页；2010年8月）公开了经血源性子宫内膜间充质干细胞的分离、培养与鉴定，其包括：收 集经血（约5mL)，将细胞转移到含有0. 2mL两性霉素B、0. 2mL青/链霉素，0.lmLEDTA-Na2 的磷酸盐缓冲液PBS中；以无菌磷酸盐缓冲液（PBS)等体积稀释后，用1.077g/mL的淋巴细 胞分层液进行密度梯度离心分离经血单个核细胞；接种、培养、传代，所用培养基为含体积 分数为20%的胎牛血清、1 %两性霉素、1 %青/链霉素的DMEM高糖培养基。
[0008] 严琰等人（中国细胞生物学学报，2014, 36 (7): 892 - 899)公开了经血源子宫内膜 干细胞培养、鉴定及体外分化潜能的研宄，但其仅详细描述间充质干细胞的培养和鉴定，而 未公开具体的收集分离方法。
[0009] 上述专利文献和非专利文献收集经血都是放入体内收集，这是因为现在普遍认为 体外采集容易受污染，体外收集时经血与收集容器存在的高度差大于体内收集，细胞与容 器之间的冲击会对细胞造成损伤，另外，体内与体外存在温差也可能对细胞产生损伤，这都 造成细胞得率低，细胞活性低。因此体内收集是目前的主流手段。
[0010] 但是，体内采集方法不仅对志愿者有一定的要求比如必须是已婚女性，还对志愿 者的身体有一定的损害。
[0011] 此外，尽管女性阴道从解剖学来看是体外结构，一般女性都不希望在阴道中植入 漏斗状的采集杯来收集经血，未婚女性更不愿外来物损坏处女膜，已婚妇女也担心插入采 集杯会伤害阴道结构，特别是顾虑因扩松阴道而影响性生活。其二，不同女性因体型大小和 年龄高低，很难选择到合适的采集杯，导致许多女性采集失败。其三，体内植入采集杯，很难 判断是否已收集足够的经血样品，往往因植入时间过长影响细胞活性。其四，初步研宄发 现，从年龄越轻女性经血样品中分离的经血间充质干细胞，其活力更好。但是如上所述，越 是年轻女孩，对介入性的体内采集就越心存顾虑，因此有活力的经血干细胞的来源成为问 题。
[0012] 因此现在急需一种操作简便且不影响细胞活性的经血干细胞采集培养方法。
【发明内容】
[0013] 本发明人通过深入研宄，克服了上述缺点，提供了一种操作简单、对供体无损害、 细胞活性高的新型的制备经血间充质干细胞的方法。
[0014] 具体而言，在第一方面，本发明提供一种新型的制备经血间充质干细胞的方法，其 特征在于，所述方法包括：
[0015] a.体外采集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；
[0016] b.从经血混合液分离单个核细胞；
[0017] c.贴壁培养所述单个核细胞，使之细胞扩增，随后进行贴壁纯化，得到经纯化的细 胞，即经血间充质干细胞。
[0018] 优选地，体外采集经血是通过尿液采集器（例如尿杯）进行的。示例性的尿杯如 图1所示。
[0019] 本发明所采用的制备经血间充质干细胞的方法对受试者而言具有良好的顺从性， 这是因为，与体内采集经血的途径相比，本发明的方法不会对受试者的身体产生任何的损 害。
[0020] 具体而言，本发明的方法对于未婚女性的受试者而言，不存在损坏处女膜的风险； 对已婚妇女而言，不会导致因插入采集杯而产生的阴道结构破损，因此也无需顾虑因扩松 阴道而影响性生活。
[0021] 另外，由于不同女性因体型大小和年龄高低，很难选择到合适的体内的经血采集 杯，导致许多女性采集失败；另一方面，体内植入采集杯，很难判断是否已收集足够的经血 样品，往往因植入时间过长影响细胞活性。而本发明的方法所选择的经血采集方法是体外 的，可以适用于各种年龄段、体形各异的女性；另外，在体外采集由于可视性较强，不会产生 因植入时间过长而导致的影响细胞活性的后果。
[0022] 再者，初步研宄发现，从年龄越轻女性经血样品中分离的经血间充质干细胞，其活 力更好。但是如上所述，越是年轻女孩，对介入性的体内采集就越心存顾虑。本发明的方法 对于从年轻女性（尤其是未婚女性）采集和分离经血间充质干细胞而言提供了便利，因此 解决了有活力的经血干细胞的来源问题。
[0023] 更重要的，本发明的制备经血间充质干细胞的方法能产生均一性强，细胞活力高， 体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点，并且比体内采集方法所获取的细胞密度更高。 此外，体外采集方法从年轻女性经血中分离的细胞更具有间充质干细胞的特征。
[0024] 因此，本发明还涉及尿液采集器（例如尿杯）在体外采集经血并进而用于制备经 血干细胞中的用途。
[0025] 在第二方面，所述方法还包括：
[0026] d.将步骤c中经纯化的细胞冻存在冻存液中得到冻存样品。
[0027] 优选的是，所述方法还进一步包括：
[0028] e.将步骤d中的冻存样品放入液氮中以长期保存。
[0029] 在第三方面，步骤a中使用尿杯体外收集经血。
[0030] 在第四方面，经血采集液为：在装有100mlHank's平衡盐溶液中，添加以下成分： 万古霉素约80yg/mL、头孢氨节约300yg/mL、卡那霉素约120yg/mL、庆大霉素约150yg/ mL、两性霉素B约3yg/mL及约450单位肝素，置4°C冰箱备用。
[0031] 其中，Hank's平衡盐溶液是常用的用于清洗或短时间保存新鲜采集的细胞和组织 样品的平衡盐溶液。在该溶液中加入以上适当浓度的抗生素用于清除所采集经血样品中的 常见微生物（主要是细菌和真菌）。万古霉素通过抑制细菌的生长和繁殖来杀死细菌，可抑 制细菌细胞壁的合成，对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌等作用强，对难辨校状