芽孢杆菌、炭疽杆菌、白喉杆菌等也有良好作用。头孢氨苄通过抑制细胞壁的合成，使细胞 内容物膨胀至破裂溶解，从而达到杀菌作用。该品为广谱抗生素。对革兰氏阳性菌和革兰 氏阴性菌均有抗菌作用。卡那霉素一种蛋白质生物合成抑制剂，对该抗生素敏感的细菌包 括大肠杆菌、克雷白杆菌、肠杆菌属、变形杆菌、结核杆菌和金黄色葡萄球菌的一些菌株。庆 大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。是一 类广谱性热稳定性的抗生素，因而广泛应用于培养基配置。两性霉素B为多烯类抗真菌抗 生素，通过影响细胞膜通透性发挥抑制真菌生长的作用。
[0032] Hank's平衡盐的配制是本领域公知的，例如可以参见司徒镇强主编的《细胞培养》 (P41 页）
[0033] NaCL8. 00g
[0034] KCL0. 40g
[0035] CaCL20. 14g
[0036] MgS04. 7H200. 20g
[0037] Na2HP04.H20 0? 06g
[0038] KH2P040. 06g
[0039] NaHC030 . 35g
[0040] 葡萄糖 1. 〇〇g
[0041] 酚红 0.02g
[0042] 加水至 1L，用NaHC03调PH至 7. 2 ~7. 4。
[0043] 优选的，本发明的经血采集液体还含有0. 5-1.OmM的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF 和低于0. 8mM的半胱氨酸蛋白酶抑制剂E- 64以及0. 3-0. 75mM金属蛋白酶抑制剂EDTA。 更优选的是，所述经血采集液还含有〇. 8mM的AEBSF和0. 5mM的E- 64以及0. 5mM金属蛋 白酶抑制剂EDTA。
[0044] 出乎意料的，上述蛋白酶抑制剂的添加使得通过本发明的方法获得的经血间充质 干细胞增殖能力明显增强。
[0045] 在第五方面，步骤a中的经血混合液保存在冷冻状态，并在72小时之内送往实验 室进行细胞分离。需要指出的是，经血样品与采集液混合后在冷冻状态下应保存至少24小 时，但应在72小时内完成样品处理。
[0046] 在第六方面，步骤b如下进行：将采集管中的经血混合液充分混匀后用100ym细 胞滤网进行过滤，以去除大部分粘液及凝块，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞。 例如，细胞滤网可以采用美国BD公司的货号352360的细胞滤网。
[0047] 优选的是，步骤b如下进行：
[0048] (1)、过滤后的经血样品通过密度梯度离心法来获取单个核细胞：将样本缓缓加入 人淋巴细胞分离液之上，样本与TBD分离液的体积比为2:1，室温或5 - 12°C条件下用台式 尚心机800g尚心15分钟；
[0049] (2)、吸取中央白膜层细胞即单个核细胞至另一洁净离心管中，加入PBS重复离心 洗绦2-3次；
[0050] (3)、去除上清液，留下最后洗涤所获得的单个核细胞，用完全培养基重悬细胞并 计数，以1X106细胞/ml的密度接种至T75(75cm2)培养瓶中，置于37°C、饱和湿度、体积分 数为5%的C02培养箱中进行培养，以获取经血间充质干细胞；
[0051](4)、在细胞培养3-4天后，更换完全培养基以弃除未贴壁细胞。初次换液后每天 观察细胞的生长情况，每3-4天全量换液一次。
[0052] 其中，人淋巴细胞分离液可以采用市售产品，例如TBD淋巴细胞分离液。
[0053] 在第七方面，步骤c中的培养所述单个核细胞是将步骤b(4)中获得的间充质干细 胞培养基进行重悬，放入175的培养瓶中进行培养，培养条件为37°C，5%C02。
[0054] 优选的是，步骤c中的细胞扩增和纯化过程为：将步骤b中获得的单个核细胞培养 的4~5天后，更换完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3~4天全量换液一次；待细胞 生长达到80%~90%融合时，用质量浓度为0. 25%的胰蛋白酶消化收集细胞，可选地进一 步按5000-6000个/cm2密度传代接种培养，并记为P1代，从而得到纯化的经血间充质干细 胞。
[0055] 在第八方面，步骤d如下进行：消化前用PBS洗3遍，用质量百分含量为0. 25%的 胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1~2*106/ml;用 细胞计数仪计数，将上述被冻存液重悬的细胞冻存。
[0056] 在第九方面，将被冻存液重悬的细胞用程序降温仪进行冻存，冻存步骤如下：
[0057] 第一步：4°C，等待；
[0058] 第二步 1. 0°C/ 分钟降至-3. 0°C;
[0059] 第三步5. 0°C/分钟降至-20. 0°C;
[0060] 第四步1. 0°C/分钟降至-40. 0°C;
[0061] 第五步5. 0°C/分钟降至-90. 0°C;
[0062] 第六步结束。
[0063] 需要说明的是，因经血来源的间充质干细胞形态较其他来源的间充质干细胞要 大，为避免速冻过程中对细胞的损伤，因此发明人将逐渐降温的速度减慢，第三步和第五步 由常用的10. 〇°C/分钟改为5. 0°C/分钟。
[0064] 在第十方面，所述冻存液为：7份完全培养基、2份血清/血清替代物和1份DMSO。
[0065] 在上述方面中，所述完全培养基为：在无菌条件下，在无菌容器中加入 65mLMEM_alpha培养基、20mLChangB基液、1~3mLChangC基液、1~3mL青霉素或者链 霉素、1~3mL浓度为200mM的L-谷氨酰胺、10~20mL的胎牛血清，充分混勾，置4°C冰箱 待用。
[0066] 有益效果
[0067] 本发明的方法克服了现有技术的缺点，通过在体外进行收集，对志愿者供体没有 严格的要求，并且避免了对志愿者供体可能带来的损害。因此，本发明的方法能让更多，特 别是年轻女性有机会收集经血，从年轻女性经血中获得的间充质干细胞更有活力和优势。
[0068] 另外，本发明人惊奇地发现，与现有技术的主流体内采集方法相比，通过本发明方 法分离得到的经血间充质干细胞具有均一性强，细胞活力高，体现在细胞扩增速度快，传代 次数高等特点，并且比体内采集方法所获取的细胞密度更高。此外，体外采集方法从年轻女 性经血中分离的细胞更具有间充质干细胞的特征。
【附图说明】
[0069] 图1 :体外采集经血所用的容器的示例性实例，尿液采集杯，即尿杯。
[0070] 图2 :用于放置经血采集液的容器的示例性实例，螺旋盖采集管。
[0071] 图3 :经血间充质干细胞形态学。图3(A):细胞培养传代P1代的经血干细胞，体内 采集方法。图3(B):细胞培养传代P1代的经血干细胞，体外采集方法。图3(C):细胞培养 传代P5代的经血干细胞，体内采集方法。图3 (D):细胞培养传代P5代的经血干细胞，体外 采集方法。P1 :细胞培养传代1代的经血干细胞，P5 :细胞培养传代5代的经血干细胞；体 内采集方法（A、C)，体外采集方法（B、D)。体外采集所获取的经血干细胞形态均一性好，比 体内采集方法所获取的细胞密度更高。
[0072] 图4 :经血干细胞核型分析。（左）体内采集方法，（右）体外采集方法。核型无 异常变化。
[0073] 图5 :致瘤性分析：（上）经血干细胞（5X106细胞）；（下）胃癌BGC823细胞株 (5父106细胞）。
【具体实施方式】
[0074] 以下通过实施例更为详细地说明本发明，但这并不意味着本发明的保护范围受这 些实施例限制。
[0075] 实施例1经血体外采集
[0076] 用尿杯进行体外经血的收集，主要流程如下：
[0077] 在此之前收集经血都是放入体内收集，此方法不仅对志愿者有一定的要求比如必 须是已婚女性，还对志愿者的身体有一定的损害，我们这个方法是在体外进行收集，即对志 愿者没有严格的要求。此方法要求志愿者在月经血流量比较多的情况下收集，月经期间，志 愿者在活动较少的情况下，积蓄一段时间后进行，用一次性尿液采集杯（如图1所示）于室 温下进行收集，将收集的经血倒入一管壁上有刻度并含有25ml经血采集液的螺旋盖采集 管（容量的为50ml，图2)中，每次大概需要收集20ml左右的月经血，倒入后立即旋紧盖子， 并晃动管子进行混合，目的是为了保存新鲜的经血，用于后续的干细胞的分离和培养。采集 的经血样品应保存在冷冻（4°C)状态，并在72小时之内进行细胞分离。
[0078] 经血采集液配制：在装有100mlHank's平衡盐溶液中，添加以下成分：万古霉 素80yg/mL、头孢氨苄300yg/mL、卡那霉素120yg/mL、庆大霉素150yg/mL、两性霉素B 3yg/mL及450单位