一种韦司梅拟盘多毛孢CAMT66351及其应用的制作方法

本发明涉及微生物技术领域，更具体地，涉及一种韦司梅拟盘多毛孢camt66351及其应用。

背景技术：

蝼蛄虫草是一种生长方式与冬虫夏草相似的菌体虫体复合体，即真菌感染蝼蛄虫体，分解虫体体内组织以及利用其营养物质以获得能量来源，进而形成蝼蛄虫草。蝼蛄虫草虽极为少见，但虫草中所含的有效活性物质具有医疗保健的功效。野生虫草生长于高海拔地区，虫草中含氨基酸、核苷、糖类、醇类和维生素及有机酸等15种微量元素。《本草纲目拾遗》提到，虫草“功与人参同”，此外，其药理功能包含治疗哮喘，支气管和炎症，对肾脏有利，治疗肾炎，免疫调节，治疗老人和病后的一般性衰弱。此外，前人通过建立动物模型，发现冬虫夏草提取物可降低淋巴结变，缓解蛋白尿和提高肾功能的作用。故虫草一直被视为珍贵的滋补品，与鹿茸、人参并称为“中药三大宝”。但随着近些年生态环境被破坏，虫草资源越来越贫乏，价格一路彪升，从上世纪九十年代中期的每斤六七百元猛涨到现在的十六七万。所幸，人们发现通过人工种植获得大量无性状菌株，单独培养后提取其中的活性物质，应用于食用药用行业可成为新型产品。

虫草内生菌种类繁多，与虫草菌共生、伴生或异生，同时分离产生代谢物，天然虫草及其微环境中含多种内生菌，有些内生菌的营养价值甚至高于虫草菌本身，成为虫草研究的一大方向，开发与冬虫夏草、蛹虫草具有相似营养价值的虫草新品种。可见，对虫草菌株形态研究是极其重要的。目前，关于虫草菌的文章报道较多，但是，关于蝼蛄虫草，特别是从中分离无性菌株的文章较少见。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种从蝼蛄虫草中分离获得的韦司梅拟盘多毛孢camt66351。

本发明的第二个目的是提供所述韦司梅拟盘多毛孢camt66351的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种韦司梅拟盘多毛孢camt66351(拉丁文名为pestalotiopsisvismiaecamt66351)，该真菌于2016年12月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60135。

优选地，该真菌的菌落不规则生长，表面干燥，乳白色，有孢子散落；有菌丝，无隔膜，孢子呈颗粒状。

优选地，该真菌的its序列如seqidno：1所示。

本发明还提供含有所述韦司梅拟盘多毛孢camt66351的微生物制剂。

本发明还提供所述韦司梅拟盘多毛孢camt66351在产核苷中的应用；优选地，所述核苷为腺苷、鸟甘、尿苷和肌苷。

本发明还提供一种生产核苷的方法，将所述韦司梅拟盘多毛孢camt66351接种于液体培养基中20℃恒培养一段时间即可。

更优选地，是将所述韦司梅拟盘多毛孢camt66351接种于大米液体培养基中，于20℃，无光照条件下培养7天左右即可。

具体地，所述液体培养基为大米培养基，所述大米培养基的组成为：大米45g，葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g、kh2po42g、mgso42g，加水至1000ml，ph值调至5.5。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种通过对虫草内生真菌的分离及性状变化分析，利用不同培养基对蝼蛄虫体、爪子进行培养分离、纯化，分离筛选出一种韦司梅拟盘多毛孢camt66351，该真菌于2016年12月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno：60135。该菌在大米培养基、20℃、无光照的条件下，生长状况最好，且能产含量较高的核苷，该真菌的发现有望实现体外核苷的大量发酵和生产，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为标准品的hplc图谱。

图2为camt66351的hplc图谱。

图3为camt66351的发育树。

图4为camt66351的镜检图(400倍)。

图5为camt66351的菌落形态图。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制；不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1菌株分离、筛选与鉴定

一、样品处理

蝼蛄虫草样品用尼龙-聚乙烯袋(7×10cm透明食品真空袋)包装完好，置于低温下保存，待用。先用自来水冲洗15min，再用无菌生理盐水淋洗3次，然后用75％的乙醇进行消毒，最后用无菌生理盐水冲洗干净即可。于无菌操作台上用已高温干燥灭菌的镊子和剪刀，把虫体跟爪子分开，并剪碎；称取虫体样品、爪子样品各5.0g，分别置于盛有45ml生理盐水的锥形瓶内，制成1：10的样品匀液，即虫体样品液、爪子样品液。

准备好盛有9ml生理盐水的无菌试管，用1ml无菌移液枪吸取1：10样品液1ml，沿着试管壁缓慢注入，充分震荡试管使样品液与生理盐水混合均匀，制成1：100的样品匀液，按同样方法制成1：1000样品匀液。

虫体样液：分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3三个梯度；密封置于冰箱中待用。

爪子样液：分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3三个梯度；密封置于冰箱中待用。

二、培养基配方

(1)大米培养基：大米称取45g，用蒸馏水浸泡至软化，放入研钵中研磨，至碾磨成小颗粒状或完全磨碎，用纱布过滤后，得浑浊大米水，加入葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g、kh2po42g、mgso42g，固态培养基加琼脂粉15g，加水至1000ml，ph值调至5.5。

(2)马铃薯培养基：马铃薯去皮后，称取45g，煮至完全软化，用纱布过滤除渣，得滤液；加葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g、kh2po42g、mgso42g，固态培养基加琼脂粉15g，同时加水至1000ml，将ph值调至5.5。

(3)pda培养基：按培养基说明书配制。

三种培养基煮至沸腾数分钟，待冷却至50℃，分装入三角瓶，用牛皮纸包扎完好放入立式压力蒸汽灭菌器中，调至121℃，20min进行灭菌，冷却50℃后倒平板备用。具体培养基配方见表1。

三、菌株分离及培养

(1)涂布平板法：将已灭菌培养基冷却至50℃倒入无菌平皿内，制成无菌平板，冷却凝固后，用1ml无菌移液枪分别取各个梯度的稀释液1ml，滴加在平板表面，用无菌涂布棒把样品液均匀地涂布开。

(2)稀释平板法：用1ml无菌移液枪分别取各个梯度的稀释液1ml，滴加在平皿上，将冷却至50℃的培养基倒入无菌平皿内，缓慢旋转，使样品液与培养基充分混合。

(3)平板划线法：将温度为50℃的培养基倒入无菌平皿内，制成无菌平板，冷却凝固后，用接种环蘸取各个梯度的稀释液，在无菌平板进行连续划线；待平板表面的菌液被吸收，翻转平板，置20℃恒温培养箱中培养，并观察记录菌落生长情况。

实验结果显示，马铃薯培养基与大米培养基所表现出的菌落形状无明显区别，但与pda培养基中的菌落差异明显，主要表现为菌落数量少，甚至不生长现象。其中大米培养基菌落数为12种，包含爪子与虫体分离所得菌落，马铃薯培养基为9种，pda培养基1种。

四、菌株纯化及传代培养

从培养基中选择具有典型虫草菌形态特征的菌落，进行纯化培养，即在相同的培养条件下，根据培养时间的变化，观察菌落形态的改变。由初次分离、纯化第二代、纯化第三代、纯化第四代至纯化第五代，直至菌落形态稳定状态。

统计菌落数，选取最具代表性的菌落进行传代培养。虫体样液、爪子样液中初步分离出的菌落有12种。初步分离出的菌落较杂乱，共有12种，分别命名为4#，5#，6#，7#，8#，9#，10#，11#，将初分所得的菌落进行纯化第一代培养，7天后显微镜观察，获悉，菌落4#、5#、6#为同种，菌落7#、8#、9#、10#、11#为同种，故纯化第二代所得菌落数为2种。培养至第三代，进行第四、第五代培养发现，菌落的形态无明显变化，趋于稳定态，菌落形态变化见表2。

表2菌落形态变化图

五、菌落的显微形态观察

选择生长良好的菌株进行显微镜观察，无菌操作台上进行，把接种环在酒精灯下烧红灭菌后，从固体培养基中选择生长良好的菌落，轻轻挑取或刮取菌丝，放在滴有染色液的载玻片上，轻轻将菌丝展开，染色液分别为棉酚蓝、结晶紫、75％酒精，用滤纸吸取多余的水分，盖上盖玻片，放于显微镜下观察。

镜检结果，4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、11#为同种菌落，命名为camt66351，用电子显微镜进行观察时，以结晶紫为染色剂，添加背景色便于观看，用油镜观察，所得结果见表2。

营养菌丝，气生菌丝，繁殖菌丝中，以气生菌丝较易观察，而营养菌丝生长在培养基的基质中，可于显微镜下观察其形态。前期采用了多种染色剂为背景，以结晶紫为染色剂观察到的菌丝最优。显微镜下可观察到明显的菌丝，有隔膜，局部菌丝有点状至透明现象。菌丝的产生过程是丝状真菌孢子落在适宜的培养基质上后，发生萌芽生长。pda培养基中未出现长菌丝得菌落，表明该培养基不适宜蝼蛄虫草内生真菌的生长。

表3菌落形态

六、菌株的分子鉴定

确定其its序列如seqidno：1所示，因此，该菌属于真菌门、真子囊菌亚纲、鹿角菌目、麦角菌科、虫草属，蝼蛄虫草种，无性型韦司梅拟盘多毛孢，拉丁文名为pestalotiopsisvismiaecamt66351(简称pv-51)。

将分离筛选得到的菌株camt66351保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址是广东省微生物研究所，保藏日期为2016年12月26日，保藏编号为gdmccno：60135。

实施例2菌株的发酵培养

将经过纯化的，并且形态稳定的菌株进行液态发酵培养。采用马铃薯液态培养基、大米液态培养基两种进行培养。先将纯菌种接种到试管液态培养基中，培养7天，将整支试管中的培养基及菌落倒入液态三角瓶培养基，于20℃恒温培养箱中培养，以获得高产量的菌丝，便于后期的营养素含量测定。

虫草菌内生真菌分离株在三种培养基中生长效果由好至差依次是：大米培养基，马铃薯培养基，pda培养基，可根据大米培养基配方的营养素含量设计更可观的培养基质，其中大米培养基与马铃薯培养基的生长效果相似，菌落形态无明显变异，表明天然氮源的培养基较好。

一、hplc测定营养素含量

样品制备：于研钵中将蝼蛄虫草内生菌磨碎，过60目筛，用分析天平精确称取0.500g样品，加水10ml，超声30min后离心，吸取出上清液后再加10ml提取试剂，超声30min，离心，合并上清液，用水定容至25ml，经0.45ul微孔膜过滤备用。

标准溶液制备：精密称取适量肌苷、腺苷、尿苷和鸟苷标准品，溶解于少量甲醇中，用水定容配制成0.3mg/ml的标准储备液。并逐级稀释成0.1，0.05，0.02，0.001，0.0005mg/ml的标准溶液备用。

测定条件：色谱柱：vp-ods(5um，φ4.6×250mm)，柱温：30℃，进样体积：10ul，流动相：甲醇：水＝75：25，流量：1ml/min，检测波长：260nm。

将camt66351进行液态发酵培养后，采用高效液相色谱技术检测核苷含量。由色谱图图1至图2可知，在大米培养基的条件下，菌株camt66351四种核苷均有一定含量，即说明具有虫草菌的活性成分，可能是虫草菌的无性状菌株。

表4待测菌株hplc检测四种核苷的含量

sequencelisting

<110>广东海洋大学

<120>一种韦司梅拟盘多毛孢camt66351及其应用

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<213>camt66351的its序列

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