一种兰州百合专用复合微生物菌剂及其制备方法与流程

本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种兰州百合专用复合微生物菌剂及其制备方法。

背景技术：

兰州百合(liliumdavidiivar.unicolor)为我国川百合的变种，是食用百合中的精品，集营养、药用与保健价值于一身，属全国名特蔬菜之一。兰州百合个大肥厚、色佳形美、养料优丰，在我国所有食用百合中品质最佳。兰州百合种植已成为当地农民经济的特色优势产业以及支柱产业，是农户收入的重要来源。

随着百合种植面积日益扩大，化学肥料和化学农药的使用量大、品种多。化学肥料和农药在提高百合产量，保障百合供应的同时，对百合种植土壤和水源的污染问题日益突出。因此，亟需开发高效的化学肥料和农药替代品用于兰州百合的种植。

复合微生物菌剂是一种环境友好型肥料，其选用的微生物菌种均是来自于植物组织（根、茎、叶、鳞茎等）和根际土壤的有益菌，能够促进植物生长，提高作物品质和产量，预防和治疗病虫害，改善土壤营养结构和理化性质，保持生态平衡，减少环境污染等。目前兰州百合施用的肥料以化学肥料为主，造成土壤板结，肥力下降等问题；病虫害的防治主要采用化学农药，不仅易产生抗药性，还会造成严重的环境污染等问题，而现有技术中还没有专门为兰州百合设计的复合微生物菌剂。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种符合兰州百合生长营养需求的兰州百合专用复合微生物菌剂及其制备方法。

本发明所述复合微生物菌剂用于协调营养，促进兰州百合生长，提高兰州百合品质、产量以及抗病抗逆性，达到改善土壤特性的目的。

一种兰州百合专用复合微生物菌剂，其特征在于该复合微生物菌剂为含有菌株bacillusthuringiensissms13、菌株bacillusjicheiformissmrs15、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusamyloliquefciensler08、菌株bacillusmegateriumfbs03和菌株bacillussubtilisfbrs14的发酵液；所述发酵液中bacillusthuringiensissms13、bacillusjicheiformissmrs15、bacilluslaterosporusles15、bacillusamyloliquefciensler08、bacillusmegateriumfbs03、bacillussubtilisfbrs14的群落总数依次为：8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml、8.0×10⁸～1.5×10¹⁰cfu/ml。

所述菌株bacillusthuringiensissms13保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：苏云金芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11830。

所述菌株bacillusjicheiformissmrs15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：地衣芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11831。

所述菌株bacilluslaterosporusles15保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：侧孢芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11832。

所述菌株bacillusamyloliquefciensler08保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：解淀粉芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11833。

所述菌株bacillusmegateriumfbs03保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：巨大芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11834。

所述菌株bacillussubtilisfbrs14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，中科学院微生物研究所，保藏日期为2015年12月7号，种名：枯草芽孢杆菌，保藏号为cgmccno.11835。

所述发酵液中bacillusthuringiensissms13、bacillusjicheiformissmrs15、bacilluslaterosporusles15、bacillusamyloliquefciensler08、bacillusmegateriumfbs03、bacillussubtilisfbrs14的群落总数依次为：2.3×10⁹cfu/ml、2.5×10⁹cfu/ml、6.1×10⁹cfu/ml、4.2×10⁹cfu/ml、4.6×10⁹cfu/ml、6.4×10⁹cfu/ml。

如上所述兰州百合专用复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）斜面培养：将菌株bacillusthuringiensissms13、菌株bacillusjicheiformissmrs15、菌株bacilluslaterosporusles15、菌株bacillusamyloliquefciensler08、菌株bacillusmegateriumfbs03和菌株bacillussubtilisfbrs14六种微生物菌株分别接种于固体培养基，活化菌株；

2）一级种子培养：将步骤1）活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，150-180rpm摇床培养；

3）混合发酵培养：将步骤2）一级种子接种于液体培养基中，进行复合菌剂摇床培养，即得兰州百合专用复合微生物菌剂。

步骤1）所述六种菌株的培养条件为：20℃～30℃在na固体培养基上培养2-3天。

步骤2）所述六种菌株的培养条件为：20℃～30℃在na液体培养基中摇床培养3-5天；用血球计数板计数，每种菌株浓度达1.0×10⁸cfu/ml以上。

步骤3）所述接种量为液体培养基的体积的0.5%-2%，优选1%。

步骤3）所述混合发酵培养条件：温度20-28℃；150-200rpm，优选180rpm；培养3-5天。

所述na培养基的成分为：牛肉膏5g、蛋白胨10g、nacl5g、蒸馏水1000ml，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min。

本发明所述复合微生物菌剂能促进兰州百合生长、提高抗旱抗逆性及改良作物土壤特性。本发明将复合微生物菌剂施用在种植兰州百合的根际土壤中，施用方法为穴施或沟施。

上述操作步骤如无特别说明，均按本领域常规操作。

本发明的有益效果：本发明的兰州百合专用复合微生物菌剂的菌株是来源于植物组织（根、茎、叶、鳞茎等）和根际土壤的有益菌，不会引入致病菌，不污染环境，无毒副作用；现有技术中多种菌复合容易出现菌株之间相互抑制，影响生长的现象，本发明经过长期摸索，选择的菌株之间不会相互抑制，在定殖生长、功能效果上还能互补。

本发明的兰州百合专用复合微生物菌剂能够为兰州百合生长提供营养。发酵过程中微生物产生多种有效代谢产物具有固氮、解磷、解钾的作用，从而提高兰州百合的生物产量和品质；由于大量的有益菌补充到土壤中后，在作物根系周围形成保护屏障，抑制有害菌的生长，繁殖，保护作物根系，同时抑制各种病虫害，从而提高兰州百合抗旱、抗病虫害等抗逆性；活菌在根际定殖后，能够改善种植土壤生态环境，改良土壤结构和理化性质，降低连作障碍。

本发明产品的各个组分配比，可根据具体的土壤条件和不同生育期的需求顾虑，进行适当的调整，以满足作物的生长。

附图说明

图1为不同处理兰州百合鳞茎重量统计结果。

图2为不同处理兰州百合发病率统计结果。

图3为不同处理兰州百合根总数量统计结果。

图4为不同处理兰州百合克隆株数统计结果，主要展示不同处理兰州百合平均克隆株数的情况。

图5为不同处理兰州百合鳞茎紧密度统计结果，主要展示不同处理兰州百合鳞茎紧密度的情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。

实施例1.

兰州百合专用复合微生物菌剂的组成：

苏云金芽孢杆菌菌株sms132.3×10⁹cfu/ml；

地衣芽孢杆菌菌株smrs152.5×10⁹cfu/ml；

侧孢芽孢杆菌菌株les156.1×10⁹cfu/ml；

解淀粉芽孢杆菌菌株ler084.2×10⁹cfu/ml；

巨大芽孢杆菌菌株fbs034.6×10⁹cfu/ml；

枯草芽孢杆菌菌株fbrs146.4×10⁹cfu/ml。

上述兰州百合专用复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1）斜面培养：将菌株sms13（bacillusthuringiensis）、菌株smrs15（bacillusjicheiformis）、菌株les15（bacilluslaterosporus）、菌株ler08（bacillusamyloliquefciens）、菌株fbs03（bacillusmegaterium）和菌株fbrs14（bacillussubtilis）六种微生物菌株分别接种于固体培养基，活化菌株；

2）一级种子培养：将步骤1）活化的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，180rpm摇床培养；

3）混合发酵培养：将步骤2）一级种子接种于液体培养基中，进行复合菌剂摇床培养，得到兰州百合专用复合微生物菌剂。

上述制备方法中，在步骤1）中，将六种菌株28℃条件下接种于na固体培养基上，培养3天；

在步骤2）中，六种菌株28℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3天；用血球计数板计数，每种菌株浓度达1.0×10⁸cfu/ml以上；

在步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的1%；

在步骤3）中，混合发酵培养条件：温度28℃；180rpm；培养5天。

实施例2

兰州百合专用复合微生物菌剂的组成：

苏云金芽孢杆菌菌株sms138.2×10⁸cfu/ml；

地衣芽孢杆菌菌株smrs158.6×10⁸cfu/ml；

侧孢芽孢杆菌菌株les158.9×10⁸cfu/ml；

解淀粉芽孢杆菌菌株ler089.0×10⁸cfu/ml；

巨大芽孢杆菌菌株fbs039.2×10⁸cfu/ml；

枯草芽孢杆菌菌株fbrs148.8×10⁸cfu/ml。

所述菌剂制备方法同实施例1。区别在于：

在步骤1）中，将六种菌株20℃条件下接种于na固体培养基上，培养3天；

在步骤2）中，六种菌株20℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3天；用血球计数板计数，每种菌株浓度达1.0×10⁸cfu/ml以上；

在步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的0.5%；

在步骤3）中，混合发酵培养条件：温度20℃；180rpm；培养4天。

实施例3

兰州百合专用复合微生物菌剂的组成：

苏云金芽孢杆菌菌株sms131.1×10¹⁰cfu/ml；

地衣芽孢杆菌菌株smrs151.0×10¹⁰cfu/ml；

侧孢芽孢杆菌菌株les151.4×10¹⁰cfu/ml；

解淀粉芽孢杆菌菌株ler081.3×10¹⁰cfu/ml；

巨大芽孢杆菌菌株fbs031.3×10¹⁰cfu/ml；

枯草芽孢杆菌菌株fbrs141.5×10¹⁰cfu/ml。

所述菌剂制备方法同实施例1。区别在于：

在步骤1）中，将六种菌株30℃条件下接种于na固体培养基上，培养2天；

在步骤2）中，六种菌株30℃条件下接种于na液体培养基中摇床培养3天；用血球计数板计数，每种菌株浓度达1.0×10⁸cfu/ml以上；

在步骤3）中，接种量为液体培养基的体积的2%；

在步骤3）中，混合发酵培养条件：温度28℃；150rpm；培养5天。

实施例4兰州百合专用复合微生物菌剂田间应用效果

试验效果：试验地点：甘肃省兰州市七里河区西果园乡兰州百合种植基地；供试品种：一年生兰州百合。

本试验设两个处理：（1）液体菌剂（按实施例1所述方法制得的兰州百合专用复合微生物菌剂）；（2）常规对照。

试验设计采用完全随机区组设计，共2个区组。种植密度为20000~22000株/亩，株距8~10cm，行距30~40cm，各处理间设2保护行。各种栽培管理措施按照当地高产优质兰州百合栽培技术精心管理。各处理兰州百合达到落叶期进行样品采集。试验效果如表1所示。

表1不同处理兰州百合各项指标数据统计

注：鳞茎发病率（%）=鳞茎发病株数/总鳞茎株数*100%。

试验结论：

（1）施用本发明所述兰州百合专用复合微生物菌剂处理的百合个体明显比常规对照组大，单个个体的重量也比常规对照高，两者达到显著差异，复合菌剂处理的百合产量比对照提高了16.6%；由此表明施用复合微生物菌剂能明显提高兰州百合的产量。具体见图1。

（2）施用本发明所述兰州百合专用复合微生物菌剂处理的百合发病率明显低于常规对照组，发病率降低了约13%，并且发病比常规对照轻微，明显抑制兰州百合病原菌，降低百合的发病率，提高百合产量。具体见图2。

（3）施用本发明所述兰州百合专用复合微生物菌剂对兰州百合的抗旱能力有很大的协同增强效应，对百合产量和品质提升起到很大的作用，复合微生物菌剂对兰州百合的抗旱能力有很大的协同增强效应，处理的百合鳞茎根数多，克隆个数多，而常规对照百合鳞茎根数少，克隆个数少，由此表明复合微生物菌剂对兰州百合产量和品质提升起到很大的作用。具体见图3、4。

另外，本发明所述兰州百合专用复合微生物菌剂处理的百合鳞茎紧密度明显提高，鳞茎片之间紧密包合，表明复合微生物菌剂能够显著提高兰州百合的品相，提升了兰州百合的市场竞争力。具体见图5。