一种采用甘薯淀粉废液制备硝酸盐污染土壤修复菌剂N4的方法与流程

本发明属于生物技术中微生物领域和环境工程中的废水资源化，特别涉及一种采用甘薯淀粉废液制备硝酸盐污染土壤修复菌剂n4的方法。

背景技术：

据报道，人体摄入的硝酸盐81.2％来自蔬菜，因此，降低蔬菜硝酸盐积累技术的研究已成为当前人们越来越关注的热点。蔬菜是一种容易富集硝酸盐的作物，农民为了获得高产而过量施用氮肥，导致硝酸盐积累、蔬菜品质下降。一般土壤的硝酸盐含量高，则蔬菜的硝酸盐含量也高，反之亦然，但两者之间不存在一一对应的关系，因此，控制土壤中硝酸盐的积累是一个迫切问题。生物修复技术是解决环境污染、恢复被人类活动破坏的生态系统、实现人类社会可持续发展的重要手段之一。近年来，我国生物修复技术研究与应用蓬勃发展，取得了显著成绩。其内容主要包括微生物修复技术、重金属污染的植物修复技术。与理化修复方法相比具有投资少、对环境影响小的优点。通过实验表明，在相同施肥水平下，与无机微肥或edta微肥相比，木质素螯合微肥均能降低生菜硝酸盐含量，其中沙培比土培下降的程度更大。土培冲施木质素螯合微肥盆栽生菜后，土壤酸化程度低，土壤盐分下降，铵态氮、有效磷、有效钾及有机质均有一定程度提高，土壤肥力增强，有利于无公害蔬菜生产。

由于土壤、气候等条件适宜尤其是产业化经营的拉动，甘薯已发展成为我国主要的栽培作物之一。甘薯淀粉废液富含可溶性糖类、淀粉、纤维素、蛋白质等多种营养物质，是微生物可以直接利用的天然培养基，为其生物转化提供了物质基础。根据甘薯淀粉废液中含有的污染物种类，探讨通过生物转化的途径，使含有大量的淀粉、多糖、果胶、蛋白等多种营养物质的废液作为一种天然的微生物培养基培养有益微生物——异养硝化菌n4，达到废液资源化的目的，并将其用于污染土壤的生物修复，最终实现循环经济。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种采用甘薯淀粉废液制备硝酸盐污染土壤修复菌剂n4的方法，通过本方法所培养出的转化菌剂n4可有效用于硝酸盐污染土壤的生物修复。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种采用甘薯淀粉废液制备硝酸盐污染土壤修复菌剂n4的方法，其步骤是：

(1)原料废液准备：原料废液为某甘薯淀粉加工厂排放废水；

(2)菌种选择：菌种n4是从硝酸盐污染的农田土壤中经过取样驯化、划线分离、菌种筛选、划线纯化后得到的一种异养硝化菌；具体方法在[杨宗政，王鑫等.异养硝化菌的分离及其强化活性污泥脱氮效果[j].中国给水排水，2006，22(21)：67-70]公开发表过；

(3)原料废液培养基：取上清液用双层医用纱布滤去杂质，灭菌，4℃冰箱中保存。试验前将废水于121℃，灭菌20min，灭菌后调节ph值在7.0左右；

(4)n4菌培养：

将原料废液培养基灭菌后调节ph为6-8，接种od660值为2.0的n4菌母液，置于25-45℃、200r/min的恒温空气摇床中振荡培养24h，发酵终点测定od600值；

(5)在原料废液培养基中接种5％的n4菌，进行摇床振荡培养24h，培养温度在25-45℃，初始ph为6-8，发酵终点测定od600值，即可获得甘薯淀粉废液土壤修复菌剂n4。

本发明的优点和积极效果：

1.甘薯淀粉废液培养基中的n4菌稳定期的最高浓度不及普通培养基的菌浓度，但是这两种培养基中菌的个数只是同一数量级中的差别，将甘薯淀粉废液作为n4菌的培养基是可行的。

2.n4菌对温度变化的适应力较强，在废液培养基中25-45℃范围内，菌株生长情况都较好，其40℃是n4菌的最适生长温度。ph为7-7.5时菌株的生长繁殖情况均良好，ph7.5时最适宜菌株生长，ph过高或过低均不利于菌株的生长。

3.n4菌能在土壤环境中发生硝化反应去除硝态氮，废液和普通培养基这两种培养方式对n4菌降解硝态氮没有影响。投菌30d后土壤中的硝态氮含量就低于或接近正常值，这对于降低种植地土壤中硝态氮的本底值，进而降低蔬菜中硝态盐残留有重要的意义。

4.n4菌能够使土壤中硝态氮降解的同时铵态氮含量略有提高，对促进植物的生长起到一定的积极作用。

5.本发明通过生物转化方法，使含有大量淀粉、多糖、果胶、蛋白等多种营养物质的废液作为一种天然的微生物培养有益微生物，最终实现循环经济。

附图说明

图1为本发明n4菌在两种培养基中的生长情况；

图2为本发明n4菌在不同温度下的生长情况；

图3为本发明不同初始ph值下n4菌的生长情况。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

一种采用甘薯淀粉废液制备硝酸盐污染土壤修复菌剂n4的方法，其转化步骤是：

(1)原料废液准备：原料废液为某甘薯淀粉加工厂排放废水，其cod为20000mg/l，ss为1600mg/l左右，ph值为4-6，整体呈酸性；

(2)菌种选择：菌种n4是从农田土壤中经过取样驯化、划线分离、菌种筛选、划线纯化后得到的一种异养硝化菌，具体方法在[杨宗政，王鑫等.异养硝化菌的分离及其强化活性污泥脱氮效果[j].中国给水排水，2006，22(21)：67-70]公开发表过，该n4菌的形态特征如表1所述：

表1n4菌的形态特征

(3)原料废液培养基：

取上清液用双层医用纱布滤去杂质，灭菌，4℃冰箱中保存。试验前将废水于121℃，灭菌20min，灭菌后调节ph值在7.0左右；。为验证本发明的先进性，另准备普通细菌培养基(g/l)进行对比实验，该普通细菌培养基的构成是：葡萄糖5.0，硫酸铵2.0，硫酸镁0.02，柠檬酸钠1.0，磷酸二氢钾4.0，磷酸氢二钾6.0，ph7.0-7.2，加琼脂2％(w/v)做成固体培养基。

(4)n4菌培养

将原料废液培养基和普通细菌培养基各100ml分别装入500ml三角烧瓶中，灭菌后调节ph约为7.0，接种od660值为2.0的n4菌母液，置于28℃、200r/min的恒温空气摇床中振荡培养，每隔4h后用血球板计算菌数；

(5)分别在上述两种培养基中接种5％的n4菌，进行摇床振荡培养，培养温度在25-45℃范围内，初始ph为6-8，每隔4h用血球板做菌的计数。

两种培养基中n4菌的生长情况如图1所示，废液培养基中的n4菌较普通培养基中的对数增长期略有提前且稳定期长。n4菌在稳定期的最高浓度较普通培养基中的最高浓度低，可能是由于废液中的氮源略有不足，但是这两种培养基中菌的个数只是同一数量级中的差别，将废液作为n4菌的培养基是可行的。

在废液培养基中，不同温度下培养24h，测定菌株生长情况，结果如图2所示，n4菌在废液培养基中，不同培养温度条件下，菌株生长量有较大差异，40℃时菌体生长明显好于其他温度，这是因为细菌生长是由一系列酶促反应组成，在最适温度范围内，随着温度升高，酶活性增强，细菌生长代谢速率加快。在超过最适温度以后，酶很快失活，代谢速率降低。

将废液培养基调节不同的ph值，再分别接种n4菌，培养24h，在不同的ph下菌株的生长情况如图3所示，初始ph为7.0～7.5时n4菌的生长繁殖情况良好，其中ph为7.5时菌的浓度最高，随着ph的降低，菌株的数量急剧减少，说明培养基过酸时，可较大程度地抑制菌体生长，培养基过碱时也不利于菌体的形成，这是由于氢离子影响细胞膜的通透性和细胞液中酶活力，n4菌适宜在中性偏碱性环境中生长繁殖，并且ph值为7.5是它们的最适生长ph。

以上所述仅为本发明的较佳实施案例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。