一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法，属于仪器检测技术领 域。
【背景技术】
[0002] 椰毒伯克霍尔德氏（Burkholderia cocovenans)简称椰酵伯氏菌，是中国发现的 一种新的食物中毒菌，它存在于谷类发酵制品（包括发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、玉米淀粉 等）、变质银耳、高粱米面制品、薯类制品（如马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等）以及周围 环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。该菌产生的毒素，对人和动物细胞具有毒性 作用。一般的烹调方法不能破坏，通过消化道吸收散布到全身，潜伏期短，为20min~24h， 患者开始感到胃部不适，全身无力，少数患者出现腹泻，但胃肠症状轻微；呕吐物多为咖啡 色，严重者出现黄疸、昏迷、谵语、四肢抽搐、血尿、便血、肝大等症状，肝功能有明显改变。急 性中毒者发病急，呈现中毒休克，平均病死率高达41. 80%。
[0003] 椰酵伯氏菌产生两种毒素：米酵菌酸和毒黄素，是其致病原因。毒黄素 (Toxflavin，TXF)是水溶性小分子脂肪酸类毒素，毒性极强，其化学毒性达到强毒化学品 标准。毒黄素的分子式为C 7H7N5O2，分子质量是193. 17,结构为1，6-二甲基一 5, 7-二 氧-1，5, 6, 7-四氢嘧啶基（5, 4e)非对称三嗪。纯的毒黄素为亮黄色片状结晶，172-173Γ分 解，紫外吸收峰在256. 7nm和394nm( ε = 16400, 2500)。小鼠 LDm静脉注射为I. 7mg/kg， 口服为 8. 4mg/kg。
[0004] 目前，关于毒黄素的研究主要集中在生理生化特性以及中毒解毒机制。有关毒黄 素在食品中的提取和检测方法的研究尚属空白，因此建立一种快速可靠的酵米面中毒黄素 的检测方法，对保证谷类米面食品的安全性，促进生产企业的技术创新，提高食品质量和档 次，保障人民群众的身体健康具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便、定性定量能力较强的毒黄素 的液相色谱-串联质谱检测方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供的毒黄素的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：
[0008] (1)样品前处理
[0009] 准确称取经过粉碎、均质过的酵米面I. 0g，用5mL超纯水溶液提取毒素，200rpm摇 床震荡30min，20°C以下8000rpm离心10min，取上清液，以2mol/L甲酸调节上清液pH值至 6~7 ;用5mL超纯水重复提取一次，合并两次上清液，用超纯水定容至10mL。此时得到较 为纯净的粗提液。
[0010] ⑵富集和净化
[0011] 富集净化使用固相萃取柱，固相萃取柱为弱阳离子交换柱，带有弱阳离子交换作 用机制的聚合物吸附剂，可以在高和低pH条件洗脱。粒径33 μπι，孔径85 μπι，表面积800m2/ g，离子容量I. 〇meq/g。
[0012] 首先以ImL甲醇和ImL超纯水活化离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒， 取2mL粗提液注入离子交换柱进行净化富集，流速控制在1滴/秒，接着用ImL超纯水淋 洗离子交换柱，以去除杂质，最后以1.0 mL甲醇溶液分两次洗脱毒黄素，氮气吹至近干，以 50%乙腈水溶液定容至0.411^，待液相色谱-串联质谱仏(：-15/^5)检测；
[0013] ⑶ LC-MS/MS 检测
[0014] 液相条件 Phenomenex Gemini C18 色谱柱（3. OmmX 150mm，5 μ m)，柱温 30°C;进样 量20yL ;流动相A为水（含有0· 1%甲酸，5mmol/L甲酸铵），B为95%乙腈（含有0· 1% 甲酸，5mmol/L甲酸铵）；梯度洗脱条件见表1 :
[0015] 表1梯度洗脱条件
[0017] 质谱条件离子化方式为电喷雾离子化负模式（ESI-);多反应监测模式（MRM);碰 撞气压力（CAD) :6 ;气帘气压力（CUR) :10 ;电喷雾电压（IS) :-4500V ;离子源温度（TEM): 600。。。
[0018] 化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数如表2所示。
[0019] 表2化合物的多反应监测离子对及质谱相关参数表
[0021] *为定量离子
[0022] 液相色谱-质谱检测时，由于基质效应的影响，导致目标化合物发生离子增强或 抑制作用，采用不含目标待测物得基质空白溶液配制梯度混合标准品溶液（〇. 1，〇. 2,0. 5， 1.0, 2. Omg/kg)。按照上述分析条件测定，以峰面积对浓度线性回归。超出线性范围的样品 需要稀释后重新测定。标准曲线见图5、6。
[0023] 表3标准曲线及线性关系
[0025] 试样中毒黄素色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围 应在±2. 5%之内。毒黄素的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3 (S/N多3)， 定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于l〇(S/N多10)。毒黄素的检测低限为 0·2mg/kg。
[0026] 有益效果：
[0027] 本发明的方法操作简便、定性定量能力较强，可作检测酵米面质量和评估食品安 全风险的可靠方法。
【附图说明】
[0028] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0029] 图1为毒黄素的[M-Η]母离子质谱图。
[0030] 图2为毒黄素的[M-Η]为母离子产生的特征子离子碎片谱图。
[0031] 图3为毒黄素的总离子流图。
[0032] 图4为毒黄素的选择子离子流图。
[0033] 图5离子对192. 1/107. 8的标准曲线。
[0034] 图6离子对192. 1/163. 7的标准曲线。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1母离子的选择
[0036] 有关毒黄素的检测方法尚属空白，本发明比较了毒黄素的[M-Η]与[M-2H] 2二级 碎片离子的响应值，结果表明毒黄素的[M-Η]离子作为母离子可以得到响应更强的二级离 子碎片，本发明最终选择[M-Η]离子作为毒黄素母离子，其质谱检测灵敏度明显高于现有 检测方法。毒黄素的母离子选择带一个负电荷的[M-Η]离子。
[0037] 图1为毒黄素的[M-Η]母离子质谱图。图2为毒黄素的[M-Η]为母离子产生的特 征子离子碎片谱图。在对质谱参数进行优化后进行二级碎片扫描，发现毒黄素的[M-Η]离 子作为母离子可以得到响应更强的二级离子碎片。毒黄素以[M-Η]离子作为母离子情况 下，确定两对离子对，192. 1/163. 7和192. 1/107. 8 ;对以上两类离子对分别进行MRM优化和 离子源优化后，在各自的最优条件下对相同浓度的MC-LR标准品进行液相色谱-串联质谱 检测，通过对质谱图的比较分析，发现毒黄素以[M-Η]离子作为母离子情况下确定的两对 离子对具有更强的响应值，灵敏度更高。
[0038] 实施例2样品前处理条件
[0039] 样品前处理
[0040] 本发明是以酵米面为基础，酵米面的基质比较复杂，富集净化前处理要求更高。
[0041] 准确称取经过粉碎、均质过的酵米面I. 0g，用5mL超纯水溶液提取毒素，200rpm摇 床震荡30min，20°C以下8000rpm离心10min，取上清液，以2mol/L甲酸调节上清液pH值至 6~7 ;用5mL超纯水重复提取一次，合并两次上清液，用超纯水定容至10mL。此时得到较 为纯净的粗提液。
[0042] 富集和净化
[0043] 首先以ImL甲醇和ImL超纯水活化离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒， 取2mL粗提液注入离子交换柱进行净化富集，流速控制在1滴/秒，接着用ImL超纯水淋 洗离子交换柱，以去除杂质，最后以1.0 mL甲醇溶液分两次洗脱毒黄素，氮气吹至近干，以 50%乙腈水溶液定容至0.411^，待液相色谱-串联质谱仏(：-15/^5)检测。
[0044] 实施例3 LC-MS/MS检测条件的确定
[0045] 按照CAC和EU第657/2002/EEC号决议中有关规定，选择两对离子进行MRM监测 即可满足，同时子离子的选择主要考虑其中母