本发明属于青贮饲料调制加工领域，具体涉及植物乳杆菌及其应用。
背景技术：
青贮饲料是指将新鲜的青饲料切短装入密封的青贮设施(窖、壕、塔、袋等)中，经过微生物发酵作用，制成一种具有特殊芳香气味、营养丰富的多汁饲料。乳酸菌是优质青贮饲料的优势菌群，厌氧条件下大量繁殖，产生大量的乳酸，抑制有害菌的生长，从而制成优良的青贮饲料。青贮饲料发酵初期，明串珠菌、肠球菌等迅速繁殖，产生了一定量的乳酸，ph下降，为其他乳酸菌和消化球菌创造条件；发酵中后期，植物乳杆菌占优势，还有其他一些乳酸菌，如l.casei、l.brevis、l.buchneri、l.fermentum、l.acidophilus和l.salivarium等。乳酸菌因其独特的生物学功能，在青贮饲料制造中起着不可替代的作用，优良菌株的筛选、生产越来越引起研究者的重视。
市售菌剂在苜蓿青贮过程中产酸少，生长慢，最终达到的酸度偏高，产乳酸量、乳酸与乙酸比值都不是很高。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中青贮饲料制备过程中乳酸菌生长慢、产酸少而导致苜蓿青贮品质低的问题，提出一种可以快速降低ph值，加速发酵过程，有效提高苜蓿青贮品质的植物乳杆菌。
为此，本发明的具体技术方案如下：
一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，菌株为cau-f1，保藏号为cgmccno.13610。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1来源于荷斯坦中产期奶牛粪便。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的16srdna序列如seqidno.1所示。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的生物学特性为：革兰氏阳性杆菌，葡萄糖同型发酵，耐酸性强(在ph3.0可以正常生长)，生育温域宽(可以耐受5℃低温及50℃高温)。
一种青贮饲料添加剂，其活性成分为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1。
所述青贮饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1在mrs培养基上培养，得到青贮饲料添加剂。
所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1在青贮饲料制备中的应用。
上述应用中，所述青贮饲料为苜蓿青贮饲料。
一种青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：
1)将待发酵饲料切断，混合均匀；
2)向步骤1)中加入所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1；
3)将步骤2)中饲料真空密封，贮藏，发酵产物即为青贮饲料。
步骤1)中待发酵饲料为苜蓿。
步骤1)中待发酵饲料切断长度为1～2cm。
步骤2)中每克待发酵饲料接种5～8logcfu所述的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1。
步骤3)中贮藏条件为：温度15～25℃，时间30～60d。
本发明的有益效果为：
1、本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1可用于制备青贮饲料，尤其是制备苜蓿青贮饲料。
2、本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1可快速降低青贮饲料的ph值，加速发酵过程，提高青贮速率；可抑制不良微生物的繁殖，提高苜蓿青贮品质，较好地保存了苜蓿营养，克服了苜蓿发酵困难的问题，增加青贮饲料的体外消化率。
3、用本发明的植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1制备的青贮添加剂青贮效果比市售乳酸菌添加剂更佳，且成本低、安全、易于利用。
生物材料保藏证明
分类命名：lactobacillusplantarum；菌株编号：cau-f1
保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏机构简称：cgmcc
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2017年1月13日
保藏中心登记入册编号：cgmccno.13610
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限于本发明。下述实施例中如无特殊说明，均为常规方法。
gfg(商业菌剂)，购自四川高福记生物科技有限公司，fg1(商业菌剂)，由日本畜产草地研究所提供。培养基均从北京奥博星生物科技有限公司(北京)购买。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的分离与菌株鉴定
1、菌株的分离
采用稀释平板法分离植物乳杆菌：称取荷斯坦中产期奶牛粪便样品0.5g，置于装有4.5ml灭菌生理盐水的试管中，充分震荡，使其混合均匀，此试管的稀释度为10-1，然后吸取0.5ml至下一只试管中，将样品依次稀释至10-6，然后吸取该稀释度的样品0.1ml涂布到mrs培养基平板上，置于厌氧培养箱30℃培养48h，在菌落密度合适的平板上挑取形态、颜色等不同的菌落，继续划线培养至菌落形态单一，挑取典型菌落，进行过氧化氢酶活性测定、革兰氏染色和镜检试验。凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的菌株即可初步确定为乳杆菌，将其在mrs培养基上继续分离纯化培养，将其保存在加入10％二甲基亚砜的1mlnb培养基中，在-80℃超低温冰箱保存。
mrs培养基：蛋白胨(proteosepeptoneno.3)10.0g，牛肉膏(beefextract)10.0g，酵母提取物(yeastextract)5.0g，葡萄糖(dextrose)20.0g，吐温(polysorbate80)1ml，柠檬酸铵(ammoniumcitrate)2.0g，醋酸钠(naac)5.0g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.1g，硫酸锰(mnso4·4h2o)0.05g，磷酸氢二钾(k2hpo4)2.0g，蒸馏水(h2o)1000ml，固体培养基再加20g/l琼脂(agar)，121℃，灭菌15min。
2、筛选高产酸、生长速度快的乳杆菌
对从奶牛粪便中分离的乳杆菌进行生理生化检测，生理性状测定包括：耐盐(nacl)浓度、ph范围生长、温度范围生长试验等；生化性状测定包括：过氧化氢酶试验、发酵葡萄糖产气试验(同型或异型发酵试验)、碳源发酵试验等。
生理生化试验方法如下：
(1)革兰氏染色参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。
(2)植物乳杆菌生长ph调节使用2mol/lnaoh和2mol/lhcl。
(3)过氧化氢酶测定试验：将实验菌株接种在mrs培养基上并在厌氧培养箱培养48h，挑取单菌落涂布在滴加了3％(w/w)过氧化氢溶液的培养皿上，观察是否有气泡产生，产生气泡的为过氧化氢酶阳性，不产生气泡的则为阴性。
(4)发酵葡萄糖产气测定试验：将实验菌株接种在mrs培养基上并在厌氧培养箱培养48h，挑取单菌落接种于含有5mlmrs液体培养基(ph6.5)的试管中(杜氏小管倒扣在试管内)，放置于普通恒温培养箱37℃培养48h，观察并记录结果，产生气泡的记为阳性，不产生气泡的则为阴性。
(5)碳源发酵测定试验：对于革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性的实验菌株，采用含有8种碳源的生化鉴定套装，对照为一支麦氏浊度比浊管，试验方法依据说明书进行，37℃恒温培养48h，记录试验结果。
(6)苜蓿榨汁培养方法：将切碎的新鲜苜蓿与蒸馏水按照1：3的比例混合榨汁并过滤，将滤液121℃灭菌处理15min，以此作为培养基筛选能够适应苜蓿生境并快速产酸的菌株。
用生理生化方法，筛选出高产酸、生长速度快的植物乳杆菌cau-f1。
结果表明，植物乳杆菌cau-f1接种于苜蓿汁培养基中生长良好，产酸快速(表1)，能够较好的适应苜蓿生境。植物乳杆菌cau-f1为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，在5～50℃和ph3.0～9.0条件下皆可生长，能较好的耐酸耐碱耐盐耐高温耐低温(表2)；可发酵大多数糖类(表3)。
表1菌株cau-f1在苜蓿汁中发酵24h后ph及有机酸含量(mg/ml)
表2植物乳杆菌cau-f1的菌落形态及生理生化特性
注：-，不生长；+，正常生长。
表3植物乳杆菌cau-f1的碳源发酵实验结果
注：-，不生长；w，长势微弱；+，正常生长。
3、菌株的鉴定
将筛选的植物乳杆菌接种在0.5mlmrs液体培养基中，30℃，180rmp培养过夜，利用菌液pcr进行菌种鉴定。
引物选用细菌的16srdna基因扩增的通用引物：
27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’
1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’
pcr反应体系(40μl)：
反应条件：
扩增产物送美吉生物科技有限公司测序，16srdna序列如seqidno.1所示，在ncbi上进行序列比对，结合菌株的生理生化数据，最终确定分离的菌株属于植物乳杆菌lactobacillusplantarum，命名为cau-f1。
实施例2：苜蓿青贮饲料的制备
苜蓿青贮饲料的制备包括如下步骤：
(1)将苜蓿晾干至水分含量60％左右，并切断至1cm～2cm，混合均匀；
(2)向步骤(1)苜蓿中按照6logcfug-1接种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1，并以无添加(control)、gfg(商业菌剂)、fg1(商业菌剂)为对照，每个处理3个重复；
(3)将步骤(2)苜蓿装入30cm×20cm的聚乙烯青贮袋，每袋装入100g，用真空密封机抽气、密封，置于室温贮藏60d。
苜蓿青贮后进行营养品质、发酵品质、微生物分析及体外消化实验。
1、青贮饲料营养品质和发酵品质的测定：
青贮后，称取代表性样品10g，加入90ml蒸馏水，混合均匀，浸泡12h后得到浸出液，用ph计测定浸出液的ph值，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，装入10ml离心管中，放入-20℃备用，用以测定有机酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)及氨态氮(nh3-n)含量。有机酸测定采用岛津gc-14型高效液相色谱仪(色谱柱：kc-811column，shimadzu，日本；检测器：spd-m10avp，流动相：3mmoll-1高氯酸，准确称取0.8493g的高氯酸，定容到2l的容量瓶中，流速1mlmin-1；柱温50℃；检测波长210nm，进样量5μl)，将剩余青贮样品置于65℃烘箱中烘48h，测定干物质(dm)含量。将烘干的样品粉碎过1mm筛后放入自封袋中保存，用于测定常规化学成分及体外消化实验。粗蛋白(cp)含量的测定采用凯氏定氮法；中性洗涤纤维(ndf)、酸性洗涤纤维(adf)的测定采用范氏纤维分析法；半纤维素是中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维的差值；可溶性糖(wsc)的测定采用蒽酮-硫酸比色法。
苜蓿青贮后的营养成分如表4所示。粗蛋白和可溶性糖含量各处理之间差异不显著，但添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的青贮饲料干物质损失量最低，且中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和半纤维素含量略低于control、efg和fg1，因此，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的苜蓿青贮饲料的营养品质略高。
表4苜蓿青贮后营养品质
注：表中同列数据不同小写字母表示差异显著(p<0.05)；dm，干重；fm，鲜重。
苜蓿青贮后发酵品质如表5所示，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的苜蓿青贮饲料，其ph值最低，氨态氮含量最低，乳酸含量、乳酸与乙酸的比值要高于空白对照组。梭菌是青贮中的有害微生物，其产生丁酸和氨，降低青贮饲料品质，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1的苜蓿青贮饲料丁酸成分很低，综合考虑，植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1可提高苜蓿青贮品质。
表5苜蓿青贮后发酵品质
注：表中同列数据不同小写字母表示差异显著(p<0.05)；dm，干重；fm，鲜重。
2、微生物分析：
微生物含量测定采用涂布平板计数法，称取10g青贮样品加入灭菌的90ml蒸馏水中，混匀后，10倍梯度稀释，然后分别取10-1、10-3和10-5倍样品稀释液各20μl涂布在mrs、伊红美蓝、孟加拉红培养基上，分别用于检测乳酸菌、大肠杆菌、霉菌及酵母；将10-1和10-2倍样品稀释液1ml在75℃水浴锅水浴15min后，分别取20μl涂布在营养琼脂培养基上用于检测芽孢杆菌，将这些涂布好的平板30℃培养48h，其中mrs培养基应放置于厌氧培养箱，其它培养基放置于普通恒温培养箱即可。
营养琼脂培养基(nb)也称nutrient肉汤培养基：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，氯化钠5g，蒸馏水1l，ph值7.2±0.2。121℃高压蒸汽灭菌15min。
伊红美蓝培养基成分(g/l)：蛋白胨10g；牛肉浸粉3g；乳糖10g；氯化钠5g；曙红钠0.4g；亚甲蓝0.065g；琼脂14g。
孟加拉红培养基成分(g/l)：蛋白胨5g；磷酸氢二钾1g；硫酸镁0.5g；葡萄糖10g；氯霉素0.1g；孟加拉红0.033g；琼脂18.5g。
苜蓿青贮后微生物指标如表6所示，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1可以显著降低苜蓿青贮饲料中大肠杆菌及芽孢杆菌等不良微生物的含量。
表6苜蓿青贮后微生物数量
注：表中同列数据不同小写字母表示差异显著(p<0.05)；dm，干重；fm，鲜重。
3、体外消化实验：
瘤胃液取自3头安装有永久性瘘管的奶牛，于晨饲前1h采集瘤胃液，采集后等量混合并经四层纱布过滤，39℃水浴保温，不断通入co2保持厌氧环境。将0.220g样品装入送入100ml玻璃注射器内，加入瘤胃液和预热的缓冲液，混合均匀，接种于agrs-ⅲ型微生物发酵微量产气自动记录仪，39℃连续培养72h，记录产气量。每个处理3个平行，另外设3个空白。发酵结束后，尼龙袋用自来水漂洗至水清澈，然后用蒸馏水清洗2次，65℃烘干至恒重，计算干物质消化率。
苜蓿青贮后体外消化实验结果如表7所示，与control、gfg、fg1相比，添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1可以显著增加苜蓿青贮饲料的干物质消化率，可以显著提高产气量，说明添加植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)cau-f1对青贮饲料的消化有益。
表7苜蓿青贮饲料72h体外消化产气动力学及干物质体外消化率
注：ivdmd，干物质体外消化率；gp，产气量；a,理论最大产气量；c，产气速率；lag，产气延滞时间；agpr，平均产气速率。
sequencelisting
<110>中国农业大学
<120>植物乳杆菌及其应用
<130>2017
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<213>植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）
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