一种致病菌拮抗剂及其应用的制作方法

本发明属于益生菌领域，具体涉及一种致病菌拮抗剂及其应用。

背景技术：

沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、单核细胞增生性李斯特菌是人体与动物肠道中的常见致病菌，感染力强，少量的该菌就可以导致人腹泻等肠道疾病，且被该菌感染后治疗困难，尤其是艰难梭菌。大肠杆菌中的部分菌株也可以引起肠道疾病，它的数量稳定对肠道的平衡也有着重要的意义。部分益生菌对肠道中的致病菌具有一定的抑制作用，其抑制机理比较复杂。体外研究单一菌体对以艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制能力，为它们体内对肠道条件治病菌的抑制提供借鉴。

技术实现要素：

本发明的发明人经过不断实验，从一种传统的乳制品中分离一对天然互惠共生乳酸菌，共生体益生菌sr-19与cr-29，都为革兰氏阳性，兼性厌氧菌，其在致病菌拮抗方面产生了预料不到的效应，可以作为本发明致病菌拮抗剂，本发明即是基于以上发现而完成。

本发明的第一个方面是公开一种致病菌拮抗剂，其包括cgmcc编号11870的耐久肠球菌cr-29(enterococcusduranscr-29)和cgmcc编号11869的肠膜明串珠菌肠膜亚种菌sr-19(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidessr-19)。

优选的，所述致病菌拮抗剂中，耐久肠球菌cr-29与肠膜明串珠菌肠膜亚种菌sr-19的cfu/g比例为1:10-10:1。

优选的，所述致病菌为对肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大肠杆菌(escherichiacoli)。

本发明的第二方面是公开致病菌拮抗剂的培养方法，

采用液体培养基，肠膜明串珠菌肠膜亚种均sr-19与耐久肠球菌cr-29的接种量分别为5％与7％，初始ph6.8；

初始培养温度为44℃(1.0-1.5小时)；中段培养温度为42℃(2.0-2.5小时)，发酵中段为ph5.9；末段培养温度为38℃(1.5-2.0小时)；

振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后添加补充营养物质继续培养，至活菌数不小于1010cfu/ml收获；

培养出的活菌体可通过低温离心分离获得；

所述液体培养基，即工业培养基，的配方为：脱脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，柠檬酸钠2g/l,醋酸钠0.5g/l，ph6.8-7.2；所述补充营养物质的配方为：牛肉膏与胡萝卜原汁2:1体积混合溶液。

本发明的第三个方面是公开一种致病菌拮抗剂的菌粉，通过以下方法制成：

活菌数不小于1010cfu/ml益生菌共生体发酵液经过滤或离心，利用冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制得致病菌拮抗剂益生菌菌粉；以上操作均在无菌条件下进行。

本发明的第四个方面是公开一种致病菌拮抗剂，含有第一二三方面的致病菌拮抗剂和药学上可以接受的辅料。

本发明的第五个方面是公开致病菌拮抗剂在制备致病菌拮抗剂中的应用。

本发明的第六个方面是公开致病菌拮抗剂在制备耐胃酸、耐肠液、耐胆汁的致病菌拮抗剂中的应用。

本发明的第七个方面是公开述致病菌拮抗剂在制备预防和/或治疗腹泻药物中的应用。

本发明的第八个方面是公开致病菌拮抗剂在制备耐胃酸、耐肠液、耐胆汁的预防和/或治疗腹泻药物中的应用。

在一些实施例中，该共生体益生菌的生产过程是通过：接种、复壮、发酵培养、分离、冻干等步骤。具体的，

共生体益生菌肠膜明串珠菌肠膜亚种sr-19与耐久肠球菌cr-29的接种量5％与7％，培养基为：牛奶(羊奶或马奶)、脱脂奶粉、乳清蛋白、维生素k、矿物元素为原料，初始培养温度为44℃(1.0-1.5小时)；中段培养温度为42℃(2.0-2.5小时)；末段培养温度为38℃(1.5-2.0小时)。初始ph6.8，发酵中段为ph5.9，振荡频率140r/min的条件下培养，培养4h后以补料速度6.3m/h补充营养物质(牛肉膏与胡萝卜汁2:1混合溶液)继续培养至收获可使益生菌菌活菌数不小于1010cfu/ml以上。培养出的活菌体可通过低温离心分离(6000r/min)获得，利用海藻酸钠、木糖醇、初乳蛋白(2:1:1)作为冻干保护剂进行真空冷冻干燥，冻干曲线为：起始温度-42℃，预冻4小时，-42℃至-5℃每小时升温5℃；-5℃至11℃每小时升温2℃，从10℃至40℃每小时升温5℃；从40℃至50℃每小时升温2℃，在30小时内完成冻干制备，制的共生体益生菌菌粉。

所述培养基与冻干保护剂配方：

益生菌共生体的培养基详细配方，包括各组分和含量；

实验室培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，琼脂15g，加蒸馏水至1000ml，ph6.4。

工业化培养基组成为:脱脂奶粉100g/l,酵母粉10g/l，蔗糖50g/l，柠檬酸钠2g/l,醋酸钠0.5g/l，ph6.8-7.2。补充营养物质：牛肉膏beefextract与胡萝卜原汁2:1混合溶液按发酵总量的0.8％补充；

培养基121℃湿热灭菌，备用。

冻干保护剂：海藻酸钠50％、木糖醇25％、初乳蛋白25％(2:1:1)作为冻干保护剂按1:10比例与发酵液干物质混合。

本发明涉及的主要仪器及设备：

4℃冰箱sc-276，海尔集团；-86℃冰箱dw-fw3_51，中科美菱低温科技有限公司；电子天平ja2003，上海精密科学仪器有限公司；数显酸度计phs-2_5，上海仪电科学仪器股份有限公司；无菌超净工作台sw-cj一1f，苏净airtech；高压灭菌锅ldzx-30kb，上海三申医疗器械有限公司；恒温培养箱jb202，上海锦屏仪器仪表有限公司；无菌过滤装置250ml，美国nalgene公司；数显恒温水浴锅hh-2，金坛市富华仪器有限公司；hitachiu-2000型紫外可见分光光度计；eppendorftgl-168高速台式离心机；olympusbx50型光学显微镜；olympusbx50型摄像系统；722型分光光度计；厌氧罐(bblgaspark)；olympuspm-20型摄像系统；250m1聚丙烯离心管、(gilson)、涂菌平皿为国产；巴斯德吸管、吸管、微量加样器8道排枪，eppendorf公司。

主要实验材料：耐久肠球菌cr-29，肠膜明串株菌sr-19，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，编号分别为cgmcc编号11870、和cgmcc编号11869。

保加利亚乳杆菌，嗜酸乳杆菌来自长春中俄科技园中俄生物工程与技术联合研发中心；青春双歧杆菌来自俄罗斯莫斯科大学；粪肠球菌f-3由俄罗斯圣彼得堡国立大学基础医学与医疗技术系提供。肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大肠杆菌(escherichiacoli)由吉林大学公共卫生学院提供。

本发明中致病菌拮抗剂和益生菌共生体含义一致。

附图说明：

图1为sr-19和cr-29益生菌共生体发酵上清液与福氏志贺氏菌共同培养下(5ml,37℃)电子显微镜照片；

1)为对照,2)为上清液作用30min后致病菌细胞出现膨胀与胞膜穿孔的现象3)60mi后细胞裂解的情况。

图2为sr-19和cr-29益生菌共生体发酵上清液与金色葡萄球菌共同培养下(5ml,37℃，4):60min；5):90min；6):30min)电子显微镜照片；

1),2)，3)为对照组；4)，5)，6)为实验组。4)，5)为透射电子显微镜下基色葡萄球菌菌体破碎的情况；6)为扫描电子显微镜图像，显示受测菌体的表面出现凹凸不平的现象，疑似被益生菌细菌素作用下裂解的结果。

图3为4℃下不同益生菌的保藏活菌数变化情况；

图4为20℃下不同益生菌的保藏活菌数变化情况；

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但足本领域技术人员将会理解，下列实施例仅于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1益生菌共生体对代表性肠道致病菌的体外抑制测定

通过测量抑菌圈直径的大小测量单一益生菌菌体与益生菌共生体体外对代表致病菌的体外抑制程度。体外实验：单一益生菌菌体与益生菌共生菌对肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大肠杆菌(escherichiacoli)的抑制效果，具体方法如下：

1)分别将活化好的单一益生菌菌体与益生菌共生体点接到mrs培养基平板上，厌氧培养24小时，然后将活化好的肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)1％接菌量接菌到50℃左右液状的bs琼脂培养基，并分别将培养基快速均匀的倒在已培养益生菌的平板上，37℃倒置培养24小时。

2)分别将活化好的单一益生菌菌体与益生菌共生体点接到mrs培养基平板上，厌氧培养24小时，然后将活化好的福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)1％接菌量接菌到50℃左右液状的lb培养基，并分别将培养基快速均匀的倒在已培养益生菌的平板上，37℃倒置培养24小时。

3)分别将活化好的单一益生菌菌体与益生菌共生体点接到mrs培养基平板上，厌氧培养24小时，然后将活化好的单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)1％接菌量接菌到50℃左右液状的lb培养基，并分别将培养基快速均匀的倒在已培养益生菌的平板上，37℃倒置培养24-36小时。

4)分别将活化好的单一益生菌菌体与益生菌共生体点接到mrs培养基平板上，厌氧培养24小时，然后将活化好的金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)1％接菌量接菌到50℃左右液状的tsp琼脂培养基，并将培养基快速均匀的倒在已培养益生菌菌的平板上，37℃倒置培养24-30小时。

5)分别将活化好的单一益生菌菌体与益生菌共生体点接到mrs培养基平板上，厌氧培养24小时，然后将活化好的艰难梭菌1％接菌量接菌到50℃左右液状的bhi琼脂培养基，并将培养基快速均匀的倒在已培养益生菌的平板上，37℃倒置厌氧培养24-48小时。

6)分别将活化好的单一益生菌菌体与益生菌共生体点接到mrs培养基平板上，厌氧培养24小时，然后将活化好的大肠杆菌1％接菌量接菌到50℃左右液状的紫红胆盐琼脂培养基，并将培养基快速均匀的倒在已培养乳酸菌的平板上，37℃倒置培养18-24小时。

通过测量各个平板上点种的益生菌的抑菌圈直径，比较单一益生菌菌体与益生菌共生体的抑菌能力大小。结果见表1

表1益生菌的抑菌圈直径

在pointagar测试中单一益生菌菌株对肠道沙门氏菌、福氏志贺氏菌、单核细胞增生性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌、大肠杆菌均显示一定的抑制作用，而益生菌共生体的抑菌能力明显高于单一菌株，对艰难梭菌的抑菌直径达11mm,对大肠杆菌直径高达17mm,并且两个益生菌菌株表现出极强的抑菌协同作用，其协同机理有待进一步研究。这可能是营养竞争、产生h202以及细菌素等多方面综合作用的结果。

益生菌共生体对致病菌的抑菌机理的初步研究

利用扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)研究益生菌共生体对上述致病菌的抑菌机理。从而进一步确认益生菌共生体对致病菌的抑菌有效性；通过电镜照片从细胞形态学上研究益生菌的代谢产物拮抗致病菌的抑菌机理。具体方法如下：

1)益生菌上清液的制备:分别取单一益生菌sr-19、cr-29与及共生体的培养24h后的菌液，在无菌条件下离心(8000r/min,40c,20min)。收集离心上清液于无菌的4.0mlep管中，40c冰箱保存备用。沉淀用0.5ml生理盐水洗脱，收集在无菌的1.5mlep管中，并保藏于40c冰箱备用。

2)实验方法：将肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytonenes)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、大肠杆菌(escherichiacoli)分别在对应的培养基与生长条件下平板培养出菌落，在无菌箱内挑取于1ml的无菌pbs内，充分震荡成菌体浑浊液，而后分别加入4ml上述益生菌上清液于对应致病菌的有氧或厌氧条件下混合培养(370c，30min,60min,90min,120min)后，按照扫描电子显微镜(sem)和透射电子显微镜(tem)的要求制作重金属与切片标本，进行电镜观察。

表2在益生菌上清液作用下致病菌细胞裂解(或凋亡)的比例

注：数值为单位电镜视野照片内致病菌细胞裂解(或凋亡)占所有细胞的百分比(p<0.05),每组为50张照片。

通过电子显微镜研究抑菌细胞形态可知，sr-19和cr-29益生菌共生体上清液与其单一益生菌的发酵上清液相比具有更强的抑菌活性，这与之前的pointagar法的实验结果一致。通过对大量的不同致病菌的抑菌电镜照片(>400张)研究表明，受测的致病菌细胞有明显的胞膜穿孔，细胞液外溢的现象，在很大程度上，这是益生菌上清液中细菌素的作用结果，但需利用不同方法进一步研究与验证。

实施例2

本混合体微生物能够在胃酸中、碱环境和人体肠酶中保持生命活性；

单菌株与双联共生体菌株外耐受性检测方法与结果

益生菌必须是活体进入并定植于肠道才可发挥其益生功能，外界温度与去存放时间对益生菌的活性有直接的影响，并且其进入肠道则必须通过口腔，经过胃后到达肠道，其中胃中的胃酸及胃蛋白酶和小肠中胆盐及胰蛋白酶都具有抗菌作用，会影响活菌数目，从而影响益生菌发挥其效用。因此考量外界因素对菌活的影响与通过消化道且存活并定植于肠道是益生菌的筛选重要标准之一。

1.不同温度下共生体益生菌比人工混合益生菌的保藏特性比较

将已活化好的四种株益生菌以10％接种量分别接入5ml灭菌的mrsbroth培养基中，分别将肠膜明串株菌sr-19与耐久肠球菌cr-29及混合接种液置于42℃水夹套恒温培养箱中培养至其对数生长末期，将保加利亚乳杆菌与嗜酸乳杆菌及其混合接种液置于38℃水夹套恒温培养箱中培养至其对数生长末期，分别放入冰箱4℃和恒温箱20℃保存，每组重复三个平行，分别在第0,2,4,7,10,14,21.28d进行活菌平板计数。

由于不同的益生菌遗传因素不同，即使处于相同环境中的不同产品存放相同时间，活菌数也不同。4℃是常用的保藏食品的温度，20℃是一般的室内温度，由图1、图2可以看出，三株菌在4℃下和20℃保藏期间活菌数是有一定程度的下降，这可能是由于保藏时培养基含有的代谢产物的抑制作用及在酸性环境下的“酸损伤”作用等所造成的。但4℃下总体上这四株菌在28天后单株或混合的情况下仍然有很高的存活率，其活菌数仍高达10⁸cfu/ml左右，其中肠膜明串株菌sr-19与耐久肠球菌cr-29的共生体混合液的活菌降低最少，28天后菌的存活仍在10⁹cfu/ml以上，并且20℃下存放28天亦含有10⁷cfu/ml活菌量，显示了该益生菌共生体极强的稳定特性。

2.耐胃酸能力测定

对于调节肠道菌群的乳酸菌而言，必须进入人的肠道才能发挥其疗效功能，然而，在从口腔到肠道的过程中，乳酸菌必须经过人体的胃，因此研究乳酸菌在胃液中的耐受性就十分必要。在空腹时，胃液的ph值是1.5至1.8之间，在进食过程中，由于食物成分、进食量以及个体之间的差异，一般胃液的ph值在1.8至5.0之间波动，通常在3.0左右，食用酸性食品可达1.5，食用碱性食品时可达4至5；此外，不同食物形态也影响其在胃中的消化时间，流体食物通常在胃中的平均消化时间是1.5-2h。

实验采用sr-19与cr-29的单一菌株与其组成的益生菌共生体在不同ph值的人工胃液中，在不同时间测定其活菌数。

(1)人造胃液的配制。取浓度为lmol/l的稀盐酸，加水稀释，将ph值分别调至1.5,2.0,2.5,3.5，每100ml液体中加入1g胃蛋白酶(酶活力453u/mg),混匀，用0.20μm的无菌滤器过滤待用。

(2)实验方法:将活化好的三种益生菌液以1％接种量分别接入上述不同ph值的人造胃液中，37℃恒温水浴培养，在0,0.5,1,1.5,2,3h进行活菌平板计数。每组重复三个平行，求代数平均值。

单一益生菌与其组成的益生菌共生体在不同ph下人造胃液下的存活状况结果如下表所示:

表3不同ph值下单一菌体与共生体的人造胃液实验结果(lgcfu/ml)

结果表明:在ph＝1.5时，受测的单一菌株和两种菌株组成共生体均不能存活；在ph＝2.0时，三株乳杆菌均可以存活，但在较短时间内检测的存活菌数明显高于较长时间点的存活菌数；在ph值为2.5及以上时，人造胃液对单一菌株的有一定的影响，但对sr-19与cr-29菌株组成益生菌共生体的影响极小，这显示该共生体的良好耐酸稳定性。在ph值2.5以上时有的菌甚至出现了生长，这可能是因为：1)人工胃液在该ph值下几乎对该菌没有影响，2)1％的接菌量带进了一定的营养物质；3)所取菌种是处于对数生长期的生长旺盛的菌。

以上结果表明，共生体的耐酸能力强于单一菌株，共生体菌株具有协同作用。

3.耐肠液能力测定

在小肠内生存着大量的微生物，不仅数量大，而且种类繁多，也是各种口服益生菌发挥作用的场所，无论怎样，保持一定数量的存活菌数是其发挥作用的先决条件。小肠液的作用、小肠的蠕动等是影响益生菌数量的因素。小肠液的ph值约为7.6，食物通过小肠的平均时间约为1.5h。

实验采用三株菌在不同ph值的人工肠液中，37℃恒温水浴培养在不同时间测定其活菌数。

(1)人造肠液的配制:取磷酸二氢钾0.8g，加水500ml溶解，用质量分数为0.4％的氢氧化钠溶液调ph值至6.8，加水稀释至1000ml，每100ml液体中加入1g胰蛋白酶(酶活力11800u/mg)，混匀，用0.20μm的无菌滤器过滤待用。

(2)实验方法:将活化好的三种益生菌液以1％接种量分别接入上述不同ph值的人造肠液中，37℃恒温水浴培养，在0,0.5,1,1.5,2,3h进行活菌平板计数。每组重复三个平行，求代数平均值。

根据实验条件得到结果如下表所示:

表4单一菌体与其共生体在不同时间的人造肠液耐受性试验结果(lg(cfu/ml))

结果表明：单一菌体在人工肠液中均有较高的存活数，并且对单一菌体组成的共生体来说，人造肠液在时间变化过程中几乎对活菌数没有影响。因此，在模拟人体肠液环境下，sr-19与cr-29菌株组成益生菌共生体具有优良的耐受性能。

以上结果表明，共生体的耐肠液能力强于单一菌株，共生体菌株具有协同作用。

4.耐胆盐能力测定

胆汁耐受力是乳杆菌重要的特征之一，乳杆菌要到达并定殖于人的肠道，必须对胆盐有一定的耐受性，其耐受力的高低意味着该菌株在肠道中的存活能力的高低。人体小肠中胆汁盐含量在0.03％—0.3％范围内波动。

在mrsbroth培养基中加入猪胆酸盐，使其质量分数分别为0.15％,0.2％,0.25％,0.3％,0.35％,0.4％，分装于离心试管中，每支3ml，每个浓度5支，以质量分数为0.4％溴钾酚紫为指示剂。在121℃灭菌15min。将已活化好的三种益生菌液以1％接种量接入上述已处理好的培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h，每组重复三个平行，观察其颜色的变化。

表5单一菌体与共生菌体在不同浓度胆盐中的生长情况

注:“-”不生长；“+”生长；“++”生长良好；“+++”生长非常好

该实验结果显示了单一与共生菌体在不同浓度牛胆汁盐中的生长情况，可以看出，单一菌体具有优良的耐胆汁酸能力，而共生菌体耐受胆盐能力极强，在0.2％时可生长旺盛，在胆盐浓度0.4％时仍可以生长，sr-19和cr-29能生长的最高胆盐浓度为0.25％和0.3％。

以上结果表明，共生体的耐胆汁能力强于单一菌株，共生体菌株具有协同作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。