一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂及其应用的制作方法

本发明涉及家畜配子胚胎工程技术领域，具体涉及一种牛卵泡膜细胞体外调节剂及其应用。

背景技术：

卵泡膜细胞作为卵巢中组成卵泡的3种主要细胞之一，在卵巢的各项功能如甾体合成、卵泡发育和卵泡闭锁中都发挥了一定的作用。卵泡膜细胞起源于卵巢中类似成纤维细胞样的基质细胞，其可分泌雄激素，与卵泡刺激素(fsh)相互作用促进颗粒细胞增殖，促进卵泡的发育。

褪黑激素，n-乙酰基-5甲氧基色胺(melatonine，mt)，主要由松果体分泌，其生物学功能多样，包括调控生物周期节律、睡眠机能、繁殖和抗氧化应激功能等。有研究表明，在哺乳动物，褪黑激素通过结合下丘脑-垂体-性腺轴系上的结合位点、活化其受体进而影响性发育和繁殖功能(clemens等，lifesciences，2001，69：27-35；hu等，generalandcomparativeendocrinology，2017，242：101-107)。在雄性动物，褪黑激素能通过调控gnrh、lh的分泌、睾酮的合成以及睾丸的成熟影响季节性和非季节性繁殖动物的繁殖功能(tian等，journalofpinealresearch，2014，57：239-247)。褪黑激素能够促进绵羊、猪、牛、小鼠和人卵母细胞和胚胎的发育(mayo等，celluarandmolecularlifesciences，2002，59：1706-1713；he等，animalreproductionscience，2016，172：164-172)，另一方面，褪黑激素表现出极强的抗氧化和抗凋亡能力，可以添加在培养基中提高体外培养卵母细胞的受精率和胚胎早期发育率(ishizuka等，journalofpinealresearch，2000，28：48-51；voiculescu等，journalofmedicineandlife，2014，7：488-492)。

褪黑激素对卵巢细胞类固醇激素合成的影响研究较少，在大鼠颗粒细胞，褪黑激素能促进孕酮的合成(fiske等，endocrinology，1984，114：407-410)，也有研究证明褪黑激素对孕酮合成无影响(nakamura等，thejournalofsteroidbiochemistryandmolecularbiology，2014，143：233-239)。褪黑激素对膜细胞增殖的影响无文献报道。近期，褪黑激素被认为是人子宫内膜的一种生长因子(arjmand等，molecularbiotechnology，2016，58：684-694)。目前，没有文献报道褪黑激素对牛卵泡膜细胞基因表达的影响，仅有报道表明褪黑激素抑制未成熟睾丸间质细胞lh刺激的雄激素的合成，原因是下调了cyp11a1和cyp17a1基因的表达(qin等，reproductivebiomedicineonline，2015，31：638-646)。褪黑激素能够促进颗粒细胞类固醇激素合成(webley和luck，journalofreproductionandfertility，1986，78：711-717；wang等，theriogenology，2012，78：1517-1526)。迄今为止，没有有关褪黑激素对牛卵泡膜细胞影响的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂。

本发明另一目的是提供一种促进牛卵泡膜细胞体外培养增殖的方法。

本发明再一目的是提供褪黑激素在抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成的应用及褪黑激素在制备用于促进牛卵泡膜细胞体外膜细胞增殖/抑制膜细胞类固醇激素合成药物中的应用。

一种牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，以牛卵泡膜细胞体外培养液为基质，在所述基质中含有褪黑激素。

如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述褪黑激素浓度为0.023μg/ml-2.3μg/ml，更优选，所述褪黑激素浓度为0.23μg/ml-2.3μg/ml。

如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述基质为按体积比为1:1的混合ham′sf-12和dmem的培养基，其中，含有体积比为10％的胎牛血清，浓度为2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的庆大霉素和38.5mmol/l的碳酸氢钠，及含有30ng/ml的促黄体生成素(lh)。

如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述基质为按体积比为1:1的混合ham′sf-12和dmem的培养基，其中，含有体积比为10％的胎牛血清，浓度为2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的庆大霉素和38.5mmol/l的碳酸氢钠，及含有30ng/ml的促黄体生成素(lh)30ng/ml的类胰岛素一号增长因子(igf1)。

如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂，优选地，所述基质为按体积比为1:1的混合ham′sf-12和dmem的培养基，其中，含有体积比为10％的胎牛血清，浓度为2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的庆大霉素和38.5mmol/l的碳酸氢钠，及30ng/ml的类胰岛素一号增长因子(igf1)。

一种促进牛卵泡膜细胞体外培养增殖的方法，其是将牛卵泡膜细胞在如上所述的牛卵泡膜细胞体外培养调节剂中培养。

优选地，所述牛卵泡膜细胞分离自8～22mm的大卵泡。

进一步，本发明提供了褪黑激素在促进牛卵泡膜细胞增殖的应用。

进一步，本发明提供了褪黑激素在抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成的应用。

进一步，本发明提供了褪黑激素在制备用于促进牛卵泡膜细胞体外增殖合成药物中的应用。

进一步，本发明提供了褪黑激素在制备用于抑制牛卵泡膜细胞类固醇激素合成药物中的应用。

进一步，所述类固醇激素为孕酮。

本发明的有益效果为：

本发明中，在牛卵泡膜细胞进行体外培养时，促黄体生成素(lh)诱导下褪黑激素对膜细胞孕酮的合成无影响，促黄体生成素(lh)单独的具有细胞增殖作用，在辅助有igf1存在的情况下，褪黑激素能呈剂量依赖性刺激牛膜细胞增殖，igf1能增加膜细胞对褪黑激素的敏感性。lh+类胰岛素一号增长因子(igf1)诱导下褪黑激素可呈剂量依赖性抑制膜细胞孕酮等类固醇激素的合成。褪黑激素抑制lh+igf1诱导的star和casp3表达，但对cyp11a1和cyp17a1表达无影响。但是，褪黑激素能够促进牛卵泡膜细胞增殖，褪黑激素作为牛卵巢功能的内分泌调控因子，通过下调类固醇激素的合成抑制lh和igf1的效应，进而延缓膜细胞分化。

将褪黑激素应用在牛卵泡膜细胞的促进膜细胞增殖或抑制类固醇合成的制剂中，具有良好的应用价值。褪黑激素可作为新型的牛卵泡膜细胞促进膜细胞增殖药物制剂在家畜胚胎工程上推广应用。

附图说明

图1为不同浓度的褪黑激素在加lh与加lh和igf1处理时，膜细胞增殖情况的比较图。

图2为不同浓度的褪黑激素在加lh与加lh和igf1处理时，孕酮合成情况的比较图。

图3为全部加有lh和igf1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞star基因的表达结果图。

图4为全部加有lh和igf1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞casp3基因的表达结果图。

图5为全部加有lh和igf1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞cyp11a1基因的表达结果图。

图6为全部加有lh和igf1时，在不加与加褪黑激素处理时，膜细胞cyp17a1基因的表达结果图。

其中，图中不同小写字母表示存在差异(p<0.05)

具体实施方式

本发明经过发明人大量的研究发现，在igf1存在的情况下，褪黑激素能呈剂量依赖性抑制孕酮的合成，还可刺激牛卵泡膜细胞增殖，单独褪黑激素对细胞增殖的刺激能力有限，igf1能增加膜细胞对褪黑激素的敏感性。褪黑激素可显著抑制膜细胞孕酮的合成。研究还发现了，褪黑激素处理牛膜细胞可下调casp3的表达。褪黑激素具有抑制膜细胞类固醇激素合成和抗凋亡的作用；褪黑激素能够调控牛卵巢膜细胞功能，通过下调类固醇合成相关酶基因(star)的表达抑制类固醇激素的合成，并通过下调细胞凋亡相关基因(casp3)的表达抑制细胞凋亡，进而刺激膜细胞增殖。了解褪黑激素的作用机理有助于解密这种抗分化因子对正常和异常卵巢功能(如卵泡囊肿)是如何调控的。

下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用试剂和激素的来源可为如下：ham′sf-12(f12)、dmem培养基、庆大霉素、碳酸氢钠、台盼蓝、蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、lh购自sigma(北京)，胎牛血清(fbs)购自gibco(上海)，重组人igf-1购自sciencell(sandiego，ca)。

elisa测定试剂：牛孕酮(bim，sanfrancisco，ca)。

rna检测试剂：一链合成试剂盒，荧光定量试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)。

实施例1褪黑激素对牛大卵泡膜细胞类固醇合成的影响

1.细胞培养

未妊娠牛的卵巢采集自北京远郊某大型屠宰场，采集后保存于含1％青链霉素的0.9％生理盐水中，冰上运输1小时内到达试验室。膜细胞分离自直径8～22mm的大卵泡，要求卵泡血管清晰、卵泡液透明。大卵泡抽取卵泡液后用手术刀纵向切开，用钝性分离法刮去残留颗粒细胞。膜细胞用显微解剖法分离并置于37℃摇床消化1小时。未消化的膜细胞用149μm滤器过滤。膜细胞在4℃50g离心7分钟，用培养基(体积比为1:1的dmem和f12，其中包含2.0mmol/l的谷氨酰胺、0.12mmol/l的庆大霉素和38.5mmol/l的碳酸氢钠)洗涤2次，用不含血清的培养基(包含1.25mg/ml胶原酶和0.5mg/mldnase)重悬，防止铺板之前细胞凝集。膜细胞的纯度应大于90％。

膜细胞生存能力用台盼蓝法评估，平均为92％。大约铺4.0×10⁵个细胞/孔，用2ml含体积比为10％胎牛血清(fbs)的培养基在5％co2和95％空气条件下培养48小时，每个孔用1ml无血清的培养基洗涤2次后获得膜细胞。

2.igf1和褪黑激素对牛大卵泡膜细胞的处理

步骤1获得的膜细胞在含体积比为10％fbs的培养基(体积比为1:1的dmem和f12，其中包含2.0mmol/l谷氨酰胺、0.12mmol/l庆大霉素和38.5mmol/l碳酸氢钠)中培养48小时后，分别用0、0.023(0.1μmol/l)、0.23(1.0μmol/l)或2.3μg/ml(10μmol/l)含褪黑激素的含10％fbs的培养基处理48小时，加或不加30ng/ml的igf1。培养基每24小时更换一次。结束培养后，收集培养基用于测定孕酮含量，收集细胞用于细胞计数。因为孕酮的合成在lh缺失的情况下无法被igf1诱导，所以所有的处理都包含30ng/mllh。此实验设计3个不同的重复。每一个重复的膜细胞来源于4-6头牛卵巢上的5-7个大卵泡。

3.检测方法

孕酮采用elisa试剂盒(bim)推荐的方法进行测定，每个样品测定2次。测定批次内的变异系数分别为9.6％和8.7％。

细胞计数用tz20^tm计数器(bio-rad，上海，中国)进行。具体如下：在胰蛋白酶(0.25％，0.5ml)消化前用0.5mlpbs洗涤2次，消化5分钟，吹打后吸10μl测量。

4.检测结果

细胞计数和孕酮激素分泌用spss软件中的2×4因子anova分析。不同平均数用tukey法比较，数据用平均数±标准误表示。结果表明，褪黑激素单独处理，添加量为0.23μg/ml和2.3μg/ml时能够刺激膜细胞增殖1.12倍和1.13倍(p<0.05)，但添加量为0.023μg/ml时褪黑激素对细胞增殖无影响。当igf1存在时，褪黑激素添加量为0.023μg/ml、0.23μg/ml和2.3μg/ml时，可增加细胞数分别为1.12、1.16和1.14倍(p<0.05)。结果见图1。孕酮素表示为pm/10⁵cells。对孕酮含量的检测，结果见图2，说明褪黑激素呈剂量依赖性降低了lh和igf1诱导的孕酮合成，如0.23μg/ml和2.3μg/ml褪黑激素抑制孕酮合成25.3％和32.2％(p<0.05)。在缺乏igf1而lh存在时，褪黑激素对孕酮的产生没有影响(p>0.05)。

实施例2褪黑激素对cyp11a1、cyp17a1、casp3和starmrna表达的影响

1.细胞培养

按实施例1中细胞培养的获得膜细胞，在含10％fbs的培养基中培养24小时后，使用3个处理：对照、igf1(30ng/ml)和褪黑激素(2.3μg/ml)+igf1(30ng/ml)，所有的处理均包括30ng/mllh。培养24小时结束后，吸取培养基，细胞裂解后用于rna提取。实验设计3个不同的重复。每一个重复的膜细胞来源于4-6头牛卵巢上的5-7个大卵泡。

2.rna提取和rt-pcr定量测定表达量

培养结束后，吸取每孔的培养基；在孔中加入0.5mltrnzol试剂(天根生化科技有限公司，北京)，并提取rna。每个处理包括2个rna样品。rna样品用nanodropnd-1000分光光度计(nanodroptechnologies，inc.，wilmington，de)测定260nm处的吸光度值，rna样品用depc水稀释，保存与-80℃。

cyp11a1、cyp17a1和star基因引物见已发表文献(spicer等，biologyofreproduction，2008，78：243-253)。caspase3(casp3)基因引物序列为：上游引物：cttccacgaaaatactggcatg，下游引物：tgaatgtttccctgaggtttgc，探针：tcgatctggtacagacgtg。对所有rt-pcr而言，设置一个不加模板和一个没有反转录的对照，确保pcr反应无dna或其他污染。pcr反应结束后用琼脂糖凝胶确定目的基因片段的大小。目的基因表达用持家基因18s核糖体rna做标准化处理(spicer等，biologyofreproduction，2008，78：243-253)，相对表达量用2^-△△ct法计算。

3.检测结果

基因表达等用spss软件中的anova分析，不同平均数用tukey法比较，数据用平均数±标准误表示。

结果如图3-6所示，其中，star基因编码类固醇激素急性调节蛋白，可作用于线粒体外膜,介导并促进类固醇的底物——胆固醇经线粒体外膜转运至内膜，继而在胆固醇侧链裂解酶p450scc等的作用下逐级合成类固醇激素。cyp11a1基因编码p450scc，是催化雌激素合成过程中的第一步，即将胆固醇转化为孕烯雌酮，是雄激素、雌激素生物合成的关键限速酶。cyp17a1基因编码细胞色素酶p450c17，可将孕烯雌酮和孕酮转化为17-羟孕烯雌酮和孕酮。star，cyp11a1，cyp17a1均是孕酮合成过程中的限速酶。casp3基因表达的caspase3是细胞凋亡一个主要的下游效应器和颗粒细胞凋亡的标记。

结果表明，lh和igf1处理膜细胞，cyp11a1和cyp17a1基因表达不受褪黑激素影响。但是，2.3μg/ml褪黑激素可抑制star和casp3基因表达(p<0.05)。由此可见，褪黑激素能够调控牛卵巢膜细胞功能，通过下调类固醇合成相关酶基因(star)的表达抑制类固醇激素的合成，并通过下调细胞凋亡相关基因(casp3)的表达抑制细胞凋亡，进而刺激膜细胞增殖。