本发明属于胚胎工程
技术领域：
，具体地，涉及一种提高体外培养猪卵母细胞发育潜力的培养液及其培养方法。
背景技术：
：哺乳动物卵母细胞体外培养技术（invitromaturation，ivm）是胚胎工程的重要组成部分，指将卵泡内取出的未成熟卵母细胞经过体外成熟培养，发育至减数第二次分裂中期，可以进行体外受精并分裂成胚胎的技术。猪作为一种常用模式生物，对其卵母细胞体外成熟的研究始于20世纪80年代末，经过多年来的发展，虽已取得了较大的进展，但是体外成熟的猪卵母细胞，其成熟质量和发育潜力与体内相比仍有较大差距。因此，开发提高卵母细胞发育潜力的培养液，完善体外成熟培养体系，仍需要我们的继续努力。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中猪卵母细胞体外培养时成熟质量与发育潜力差的缺陷和不足，提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液及培养方法，所述培养液可有效地提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力，且制备简单，培养方法简便易行，具有较大的应用前景。本发明的目的是提供一种猪卵母细胞体外成熟促进剂。本发明另一目的是提供添加有上述促进剂的猪卵母细胞体外成熟培养液。本发明的再一目的是提供利用上述培养液提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力的培养方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种猪卵母细胞体外成熟促进剂，所述促进剂由3～7μmol/l毛喉素与3～7μmol/lroscovitine组成。本发明的毛喉素（forskolin）是一种腺苷酸环化酶激活剂，通过刺激腺苷酸环化酶生成大量camp，camp延迟卵母细胞核成熟，使卵母细胞细胞质得到充分生长，最后达到提高卵母细胞发育潜力的效果，临床多用于抑制肿瘤生长，同时也在辅助生殖领域得到广泛重视。roscovitine是一种腺嘌呤衍生物，作用于细胞周期蛋白激酶时具有高效性和特异性，可以选择性抑制cdc2、cdk2和cdk5等细胞周期依赖性激酶活性，可以有效抑制猪、牛、马和山羊等物种卵母细胞减数分裂的恢复。研究发现，猪卵母细胞体外成熟存在的一个最大问题就是核质成熟的不统一，本发明选用的两种药品forskolin和roscovitine，皆有抑制核成熟的效果，单一高浓度添加虽会对核成熟有一定的延迟效应，但同时也会给卵母细胞造成不可知的影响。本发明通过将毛喉素与曲古抑菌素a分别进行各单一药品、组合药品的多种浓度及添加培养时间尝试后，发现forskolin和roscovitine组合用药在一定的浓度及添加时间下具有显著的协同增效，可有效提高卵母细胞的体外发育潜力，大大提升胚胎得率，避免了单一用药带来的缺陷。本发明的猪卵母细胞体外成熟促进剂可提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力，因此，所述促进剂可被添加到猪卵母细胞体外成熟培养液中。一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述培养液包括以下组分：毛喉素3～7μmol/l，roscovitine3～7μmol/l，tcm-1998～12g/l，nahco31～4g/l，d-葡萄糖0.4～0.7g/l，丙酮酸钠0.05～0.15g/l，青霉素钠盐0.05～0.1g/l，链霉素硫酸盐0.03～0.07g/l，聚乙烯醇1～4g/l，促黄体素0.3～0.7μg/ml，促卵泡素0.3～0.7μg/ml，表皮生长因子8～12ng/ml，l-半胱氨酸0.3～0.7mmol/l，卵泡液8～12%优选地，所述培养液包括以下组分：毛喉素4～6μmol/l，roscovitine4～6μmol/l，tcm-1999～11g/l，nahco32～3g/l，d-葡萄糖0.5～0.6g/l，丙酮酸钠0.08～0.12g/l，青霉素钠盐0.06～0.09g/l，链霉素硫酸盐0.04～0.06g/l，聚乙烯醇1～3g/l，促黄体素0.4～0.6μg/ml，促卵泡素0.4～0.6μg/ml，表皮生长因子9～11ng/ml，l-半胱氨酸0.4～0.6mmol/l，卵泡液9～11%。再优选地，所述培养液包括以下组分：毛喉素5μmol/l，roscovitine5μmol/l，tcm-1999.87g/l，nahco32.2g/l，d-葡萄糖0.5496g/l，丙酮酸钠0.1g/l，青霉素钠盐0.075g/l，链霉素硫酸盐0.05g/l，聚乙烯醇1g/l，促黄体素0.5μg/ml，促卵泡素0.5μg/ml，表皮生长因子10ng/ml，l-半胱氨酸0.57mmol/l，卵泡液10%。上述猪卵母细胞体外成熟培养液在提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力中的应用亦在本发明保护范围内。一种提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力的方法，将上述任一培养液作为培养液a，将猪卵母细胞在培养液a中培养22～24h后转入到培养液b中继续培养22～24h；所述培养液b括以下组分：tcm-1998～12g/l，nahco31～4g/l，d-葡萄糖0.4～0.7g/l，丙酮酸钠0.05～0.15g/l，青霉素钠盐0.05～0.1g/l，链霉素硫酸盐0.03～0.07g/l，聚乙烯醇1～4g/l，表皮生长因子9～11ng/ml，卵泡液9～11%。优选地，所述培养液a或/和培养液b配制好后需置于co2培养箱平衡过夜。优选地，所述co2培养箱中的条件为38.6°c，5%co2，相对湿度100%。上述培养方法可有效提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力，而体外培养的猪卵母细胞是猪克隆胚胎的重要原材料，因此上述培养方法在猪克隆胚胎培养中的应用也在本发明保护范围内。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明提供了一种猪卵母细胞体外成熟促进剂。（2）本发明提供了一种可提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力的培养液。（3）本发明提供了一种可提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力的培养方法。（4）本发明的促进剂、培养液以及培养方法可提高猪卵母细胞的卵裂率、囊胚数及囊胚细胞数，有效地提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力，且制备简单，操作方便，具有较大的应用前景。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液（1）毛喉素（forskolin）：用2.44mldmso溶解1mgforskolin，得终浓度为1mm的储备液，置于-20℃保存；再用ddh2o稀释为10μm的工作液，4℃保存备用。（2）核抑制剂roscovitine：用2.83mldmso溶解1mgroscovitin，得终浓度为1mm的储备液，置于-20℃保存；再用ddh2o稀释为10μm的工作液，4℃保存备用。（3）0～22h培养液：取9.87gtcm-199，2.2gnahco3，0.5496gd-葡萄糖，0.1g丙酮酸钠，0.075g青霉素钠盐，0.05g链霉素硫酸盐，1g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混匀后，加入0.5μg/mllh，0.5μg/mlfsh，10ng/mlegf，0.57mml-半胱氨酸，10%pff；再充分混匀，抽滤除菌，置于co2培养箱平衡过夜。（4）22～44h培养液：取9.87gtcm-199，2.2gnahco3，0.5496gd-葡萄糖，0.1g丙酮酸钠，0.075g青霉素钠盐，0.05g链霉素硫酸盐，1g聚乙烯醇，溶于1lddh2o中，充分混匀后，加入10ng/mlegf和10%pff，抽滤除菌，置于co2培养箱平衡。（5）卵母细胞操作液：将9.5gtcm-199，0.05gnahco3，1.755gnacl，3.0gbsa，0.75ghepes，0.06g链霉素，0.05g青霉素溶于1lddh2o中，充分混匀后，测量ph，抽滤除菌，分装，置于4℃冰箱保存备用。（6）融合液：取0.0203gmgcl2-6h2o，0.147gcacl2-2h2o，54.66g甘露醇，0.119ghepes溶于1lddh2o中，抽滤除菌，分装，置于-20℃冰箱保存备用。（7）胚胎培养液：取6.312gnacl，0.746gkcl，0.048gkh2po4，0.098gmgso4-7h2o，2.106gnahco3，3.0gbsa，0.1460gl-谷氨酰胺，0.546g亚牛磺酸，0.05g庆大霉素，0.022g丙酮酸钠，20ml必需氨基酸，10ml非必需氨基酸依次加入ddh2o中，待药物完全溶解后，测量ph，抽滤除菌，分装，置于4℃冰箱保存备用。2、猪卵母细胞体外培养（1）单独添加forskolin：将毛喉素（forskolin）添加至0～22h培养液中，使其终浓度为5μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（2）单独添加roscovitine：将核抑制剂roscovitine添加至0～22h培养液中，使其终浓度为5μm；将猪卵母细胞在上述添加有roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（3）同时添加forskolin+roscovitine：将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin与roscovitine终浓度均为5μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（4）阳性对照组：将猪卵母细胞培养在含有100nm左右dmso的0～22h培养液中培养24h后，转入到无dmso的22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（5）阴性对照组：将猪卵母细胞培养在正常0～22h培养液中培养24h后，转入到正常的22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。3、结果结果如表1所示，通过考察猪卵母细胞的形态正常率、卵裂率以及囊胚率发现，猪卵母细胞在只单独添加forskolin的培养液中培养后的发育潜力反而不如对照组，且差异显著；猪卵母细胞在只单独添加roscovitine的培养液中培养后的发育潜力与对照组无显著差异；猪卵母细胞在添加5μmforskolin和5μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率与对照组无显著差异，但卵裂率和囊胚率与对照组差异显著，尤其是囊胚率较对照组大大提高。表1forskolin处理后猪卵母细胞的发育潜力（孤雌激活）组别卵母细胞数形态正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）实验组forskolin38085.4(324/390)66.2(214/324)a17.5(37/214)a实验组roscovitine29083.4(242/290)44.6(108/242)a18.5(20/108)a促进剂组forskolin+roscovitine31886.5(275/318)84.4(232/275)59.9(138/232)a阳性对照组32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)b阴性对照组30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)b注：同列字母不同表示差异有显著性(p＜0.05)，无字母表示无显著性差异(p＞0.05)。实施例2猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液与实施例1相同。2、猪卵母细胞体外培养（1）将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin终浓度为3μm，roscovitine终浓度为7μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（2）设置对照组，与实施例1相同。3、结果结果如表4所示，通过考察猪卵母细胞的形态正常率、卵裂率以及囊胚率发现，猪卵母细胞在添加3μmforskolin和7μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率与对照组无显著差异，但卵裂率和囊胚率与对照组差异显著，尤其是囊胚率较对照组大大提高。表43μmforskolin和7μmroscovitine处理后猪卵母细胞的发育潜力（孤雌激活）组别卵母细胞数形态正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促进剂组31085.6(272/318)85(231/272)a54.3(125/231)a阳性对照组32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)b阴性对照组30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)b注：同列字母不同表示差异有显著性(p＜0.05)，无字母表示无显著性差异(p＞0.05)。实施例3猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液与实施例1相同。2、猪卵母细胞体外培养（1）将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin终浓度为7μm，roscovitine终浓度为3μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（2）设置对照组，与实施例1相同。3、结果结果如表5所示，通过考察猪卵母细胞的形态正常率、卵裂率以及囊胚率发现，猪卵母细胞在添加7μmforskolin和3μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率与对照组无显著差异，但卵裂率和囊胚率与对照组差异显著，尤其是囊胚率较对照组大大提高。表57μmforskolin和3μmroscovitine处理后猪卵母细胞的发育潜力（孤雌激活）组别卵母细胞数形态正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促进剂组31586.3(271/315)86.1(207/271)a51.2(106/207)a阳性对照组32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)b阴性对照组30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)b注：同列字母不同表示差异有显著性(p＜0.05)，无字母表示无显著性差异(p＞0.05)实施例4猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液与实施例1相同。2、猪卵母细胞体外培养（1）将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin终浓度为2μm，roscovitine终浓度为8μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（2）设置对照组，与实施例1相同。3、结果结果如表6所示，通过考察猪卵母细胞的形态正常率、卵裂率以及囊胚率发现，猪卵母细胞在添加2μmforskolin和8μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率、卵裂率以及囊胚率均与对照组无显著差异。表62μmforskolin和8μmroscovitine处理后猪卵母细胞的发育潜力（孤雌激活）组别卵母细胞数形态正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促进剂组32086.4(276/320)81.1(223/276)30.3(67/223)阳性对照组32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)阴性对照组30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)注：同列字母不同表示差异有显著性(p＜0.05)，无字母表示无显著性差异(p＞0.05)实施例5猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液与实施例1相同。2、猪卵母细胞体外培养（1）将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin终浓度为8μm，roscovitine终浓度为2μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。（2）设置对照组，与实施例1相同。3、结果结果如表7所示，通过考察猪卵母细胞的形态正常率、卵裂率以及囊胚率发现，猪卵母细胞在添加8μmforskolin和2μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率、卵裂率以及囊胚率均与对照组无显著差异。表78μmforskolin和2μmroscovitine处理后猪卵母细胞的发育潜力（孤雌激活）组别卵母细胞数形态正常率（%）卵裂率（%）囊胚率（%）促进剂组30684.5(258/306)76.3(196/258)28.4(56/196)阳性对照组32091.9(294/320)79.6(234/294)26.1(61/234)阴性对照组30089.3(268/300)78.7(211/268)27.5(58/211)注：同列字母不同表示差异有显著性(p＜0.05)，无字母表示无显著性差异(p＞0.05)实施例6猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液与实施例1相同。2、猪卵母细胞体外培养将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin与roscovitine终浓度均为5μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液，按表8所述时间分别进行培养。3、结果结果如表8所示，当猪卵母细胞在添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养22～24h后，转入到22～44h培养液中继续培养22～24h后，其发育潜力要较其他不同培养时间的发育潜力好。表8不同培养时间对猪卵母细胞发育潜力的影响实施例7猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液（1）毛喉素（forskolin）：与实施例1相同；（2）核抑制剂roscovitine：与实施例1相同；（3）0～22h培养液：取8gtcm-199，4gnahco3，0.4gd-葡萄糖，0.15g丙酮酸钠，0.05g青霉素钠盐，0.07g链霉素硫酸盐，1g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混匀后，加入0.7μg/mllh，0.3μg/mlfsh，12ng/mlegf，0.3mml-半胱氨酸，12%pff；再充分混匀，抽滤除菌，置于co2培养箱平衡过夜。（4）22～44h培养液：取12gtcm-199，1gnahco3，0.7gd-葡萄糖，0.05g丙酮酸钠，0.1g青霉素钠盐，0.03g链霉素硫酸盐，4g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混匀后，加入9ng/mlegf和8%pff，抽滤除菌，置于co2培养箱平衡。（5）卵母细胞操作液：与实施例1相同；（6）融合液：与实施例1相同；（7）胚胎培养液：与实施例1相同；2、猪卵母细胞体外培养将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin与roscovitine终浓度均为5μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。3、结果猪卵母细胞在添加有5μmforskolin和5μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率、卵裂率以及囊胚率均比不添加促进剂培养的猪卵母细胞高。实施例8猪卵母细胞体外培养1、配制溶液及培养液（1）毛喉素（forskolin）：与实施例1相同；（2）核抑制剂roscovitine：与实施例1相同；（3）0～22h培养液：取12gtcm-199，1gnahco3，0.7gd-葡萄糖，0.05g丙酮酸钠，0.1g青霉素钠盐，0.03g链霉素硫酸盐，4g聚乙烯醇溶于1lddh2o中，充分混匀后，加入0.3μg/mllh，0.7μg/mlfsh，8ng/mlegf，0.7mml-半胱氨酸，8%pff；再充分混匀，抽滤除菌，置于co2培养箱平衡过夜。（4）22～44h培养液：取8gtcm-199，4gnahco3，0.4gd-葡萄糖，0.15g丙酮酸钠，0.05g青霉素钠盐，0.07g链霉素硫酸盐，1g聚乙烯醇溶溶于1lddh2o中，充分混匀后，加入11ng/mlegf和12%pff，抽滤除菌，置于co2培养箱平衡。（5）卵母细胞操作液：与实施例1相同；（6）融合液：与实施例1相同；（7）胚胎培养液：与实施例1相同；2、猪卵母细胞体外培养将毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine分别添加至0～22h培养液中，使forskolin与roscovitine终浓度均为5μm；将猪卵母细胞在上述添加有forskolin和roscovitine的0～22h培养液中培养24h后，转入到22～44h培养液中继续培养24h，进行后续孤雌激活实验。3、结果猪卵母细胞在添加有5μmforskolin和5μmroscovitine的培养液中培养后的细胞形态正常率、卵裂率以及囊胚率均比不添加促进剂培养的猪卵母细胞高。本发明的毛喉素（forskolin）和核抑制剂roscovitine，其组合的最适宜搭配经过我们各单一药品、组合药品的多种浓度及添加添加培养时间尝试后，确定了体外培养的猪卵母细胞在添加浓度为5μmforskolin和5μmroscovitine后的培养液中培养22～24h，可有效提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力。体外培养的猪卵母细胞是猪克隆胚胎的重要原材料，因此提高猪卵母细胞体外培养成熟效率对于科研及生产实践均有重要意义。本发明提供的促进剂型经多次体外细胞培养及后续孤雌激活等实验验证，卵裂率、囊胚数及囊胚细胞数都优于未添加组，明确证实了此种抑制剂组合可有效地提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力。当前第1页12