一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法
【专利摘要】本发明提供的一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法，将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，体外成熟、体外受精后用含有200nMol/L组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)培养液培养10h，用不含有TSA的培养液继续培养，培养48h后统计卵裂率，培养7d后统计囊胚率即可，另将染色分离获取的BCB+卵母细胞用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24h直接利用。该法对绵羊卵母细胞体外利用，具有重要的实用价值。
【专利说明】一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)，对经过BCB筛选后的质量 不好的BCB阴性卵母细胞进行培养的方法，能显著提高绵羊卵母细胞体外胚胎发育率。
【背景技术】
[0002] TSA是一种非竞争性可逆的组蛋白乙酰化抑制剂，其来源于链霉素的代谢产物，它 的主要作用是增强组蛋白的乙酰化水平。TSA可以特异性抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，降 低DNA甲基化水平并激活印记基因和管家基因的表达。而组蛋白的高乙酰化水平可以增强 转录因子与核小体的作用，有利于基因转录的启动。当组蛋白乙酰化作用达到高峰时胚胎 的基因组被激活，并与基因表达水平的增加相一致。因此，组蛋白去乙酰化抑制剂TSA可能 会对绵羊卵母细胞及体外胚胎的发育能力产生影响。
[0003] 在前期研究的一种用于绵羊卵母细胞体外的筛选培养方法（专利号： ZL200910113567. 9)中发现，经过BCB筛选后的阴性卵母细胞成熟率极显著低于阳性卵母 细胞，因而，如何提高阴性卵母细胞质量成为亟待解决的问题。文献检索披露：l.Reprod FertDev，2007,19 (1)，169,作者：ZhangYH等，发表的《TSA优化处理的克隆胚胎体外培 养体系可以得到克隆小猪》文章得出，50nM的TSA能提高猪克隆胚胎体外培养的囊胚率。 2.Zygote，2009,17, 209-215,作者：ShuntaroIkeda等，发表的《在牛的卵母细胞体外受精 过程中通过TSA增加组蛋白乙酰化水平影响囊胚的内细胞团数》文章得出，在牛的卵母细胞 体外受精过程中经TSA处理后，显著提高了囊胚内细胞团数。3.R印rodDev，2011，57(1): 34-42,作者：LeeMJ等，发表的《TSA提高了牛体细胞核移植胚胎的发育》文章得出，TSA处 理牛克隆胚胎，可以显著提高牛体细胞核移植的效率。
[0004] 国内有中国农业科学院北京畜牧兽医研究所刘晓等8人发表的《曲古抑菌素A对 猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响》、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 李向臣等5人发表的《TSA对滩羊成纤维细胞作为供体细胞的作用》、东北农业大学生命科 学学院黄波等5人发表的《TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响》。
[0005] 本发明将TSA与BCB筛选技术相结合作为本方法的切入点，展开的方法学与应用 学的研究，能极大地提高绵羊卵母细胞体外发育能力，具有重要的实践意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目在于：为提高绵羊卵母细胞的质量，即先采用BCB染色筛选，再对筛选 后的质量差的卵母细胞用TSA进行抑制培养，效果十分明显，该方法简单易操作，实用性极 强。
[0007] 本发明的目的是这样实现的：一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法，分步 实施；
[0008] 步骤1将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用成熟培养液洗涤2-3次，按25-30 枚/滴，放入前2h平衡好的体积为55-78iil/滴的成熟培养液中，放入0)2箱，在5%C02、 95 %的空气条件下培养；
[0009] 步骤2将步骤1体外成熟23_25h的卵母细胞取出，用0. 1 %的透明质酸酶处理 30-60s，经吹吸，脱去卵母细胞周围的卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/ 滴的密度加入前2h平衡好的50-70ill的体外受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2h平衡 好的装有体外受精液的试管，放入C02箱，上游20-25min，取上清，在1500rpm条件下，离心 4-5min，弃去上清液，将剩余的精子沉淀，按2-4X106个/ml的密度加入体外受精液滴，与 处理好的卵母细胞共同孵育；
[0010] 步骤3将步骤2受精20-23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的体外培养液内， 经吹吸，脱去卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好 的500yl/孔的含有TSA的体外培养液内培养10h，再用不含TSA的体外培养液洗涤2-3 次，放置于不含TSA的体外培养液内培养7d，统计囊胚率；
[0011] 其中BCB-卵母细胞的获取：摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，置入温度在30-35°C， 含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3h内用生理盐水清洗3-4次，用 吸有lml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡，将注射器内回 收的卵泡液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为25-30yMol/ L的BCB染色液，置于35-39°C水浴中染色80-90min，在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞 分离，其中将染色分离的BCB+卵母细胞，用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24h，直接利用；
[0012] 步骤4实验液体的配制：
[0013] 抽卵液：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素纳；
[0014] 亮甲酚蓝染色液：PBS+26iiMol/L亮甲酚蓝+5mg/mlBSA;
[0015] 成熟培养液：TCM199-HC03+10 %FBS+0. 05IU/mlFSH+0. 05IU/mlLH+1iig/ml estradiol+24. 2ug/ml丙丽酸纳 +0?ImM/L半胱;氛酸 +10ng/mlEGF+lOOIU/ml双抗；
[0016] S0F:6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 6ii1/ml乳酸钠 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml丙酮酸钠 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20 ;
[0017] 体外受精液：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素；
[0018] 体外培养液：S0F+3mg/mlBSA;
[0019] 含TSA体外培养液：S0F+200nMol/LTSA+3mg/mlBSA。
[0020] 本发明在前期的研究中，已经验证了亮甲酚蓝染色（BCB)(专利号： ZL200910113567. 9)可用于测定G6TOH活性，根据G6TOH活性的不同，BCB染色呈现不同程 度的着色；并且发现BCB-卵母细胞体外培养的成熟率、卵裂率、囊胚率显著低于BCB+组，因 此采用TSA与BCB筛选技术相结合；就是将BCB-卵母细胞使用添加TSA的培养液作用10 和，能提高BCB-卵母细胞质量，而BCB+卵母细胞质量不受任何影响，从而能提高卵母细胞 总体发育效率。
[0021] 本发明的构思及研究机理表明，添加曲古抑菌素A能显著提高经BCB筛选后的质 次BCB-卵母细胞体外培养囊胚发育率。采用TSA与BCB筛选技术相结合的技术路线科学 合理，组合方法达到了创新效果，且有独到之处，彰显技术进步。
【具体实施方式】
[0022] 本发明结合实施例作进一步说明.
[0023] 实施例
[0024] 将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用成熟培养液洗涤3次，按28枚/滴，放 入前2h平衡好的体积为60iU/滴的成熟培养液中，放入C02箱，在5%C02、95%的空气条 件下培养；将体外成熟24h的卵母细胞取出，用0. 1 %的透明质酸酶处理45s，经吹吸，脱去 部分卵丘细胞；用体外受精液洗涤3次，按28枚/滴的密度加入前2h平衡好的60ill的体 外受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2h平衡好的装有体外受精液的试管，放入C02箱，上 游23min，取上清，在1500rpm条件下，离心5min，弃去上清液，将剩余的精子沉淀，按3X106 个/ml的密度加入体外受精液滴，与处理好的卵母细胞共同孵育；将受精21h的卵取出，移 至平衡好的含有TSA的体外培养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤 4次，按60枚/孔的密度移入平衡好的500yl/孔的含有TSA的体外培养液内培养10h，再 用不含TSA的体外培养液洗涤3次，放置于不含TSA的体外培养液内培养7d，统计囊胚率；
[0025] 其中BCB-卵母细胞的获取：摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，置入温度在32°C，含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3h内用生理盐水清洗3次；用吸有 lml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面6_的卵泡，将注射器内回收的卵泡 液打在45mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为30yMol/L的BCB染色液， 至于36°C水浴中染色90min;在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离，分别培养至24h， 再分别进行体外受精，将受精22h的BCB-卵母细胞取出，移至平衡好的含有TSA的体外培 养液内，经吹吸，脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤4次，按60枚/孔的密度移入 平衡好的500yl/孔的含有TSA的培养液内培养10h，再用不含TSA的培养液洗涤3次，入 培养液内培养48h后统计卵裂率，7d后统计囊胚率即可；
[0026] 其中染色分离的BCB+卵母细胞直接利用即可；
[0027] 其中实验液体的配置：
[0028] 抽卵液：TCM199_hepes+lmg/mlPVA+0. 7mg/ml肝素纳；
[0029] 亮甲酚蓝染色液：PBS+26iiMol/L亮甲酚蓝+5mg/mlBSA;
[0030] 成熟培养液：TCM199-HC03+10 %FBS+0. 05IU/mlFSH+0. 05IU/mlLH+1iig/ml estradiol+24. 2ug/ml丙丽酸纳 +0?ImM/L半胱;氛酸 +10ng/mlEGF+lOOIU/ml双抗；
[0031] S0F:6. 29mg/mlNaCL+0. 534mg/mlKCL+0. 162mg/mlKH2P04+0. 1/ml乳酸钠 +0? 089mg/mlMgS04+2.lmg/mlNaHC03+0. 0357mg/ml丙酮酸钠 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20 ;
[0032] 体外受精液：S0F+20%FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素；
[0033] 含TSA体外培养液：S0F+200nMol/LTSA+3mg/mlBSA.
[0034] 体外培养液：S0F+3mg/mlBSA;
[0035] 本方法采用显微镜检测卵母细胞质量，细胞质不着蓝色的BCB-卵母细胞质量显 著低于胞质着蓝色的BCB+卵母细胞。
[0036] 本方法试验选用的TCM199-h印es、PVA、肝素钠、亮甲酚蓝、PBS、BSA、FBS、FSH、LH、 estradi〇l、EGF、半胱氨酸、TSA均购自SIGMA公司、双抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限公 司。
[0037] 实验结果及数据验证：用一组数据验证其采用TSA与BCB染色相结合的方法的有 效性。
[0038] 将TSA与BCB染色相结合，能最大限度的提高卵母细胞体外发育能力。
[0039] 表 1
[0040]
【权利要求】
1. 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法，其特征在于：分步实施； 步骤1将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞，用成熟培养液洗涤2-3次，按25-30枚/ 滴，放入前2h平衡好的体积为55-78 yl/滴的成熟培养液中，放入C02箱，在5% C02、95%的 空气条件下培养； 步骤2将步骤1体外成熟23-25h的卵母细胞取出，用0. 1%的透明质酸酶处理30-60s， 经吹吸，脱去卵母细胞周围的卵丘细胞；用体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度 加入前2h平衡好的50-70 ill的体外受精液滴内；水浴解冻精液，移入前2h平衡好的装有 体外受精液的试管，放入C02箱，上游20-25min，取上清，在1500rpm条件下，离心4-5min， 弃去上清液，将剩余的精子沉淀，按2-4X 106个/ml的密度加入体外受精液滴，与处理好的 卵母细胞共同孵育； 步骤3将步骤2受精20-23h的卵取出，移至平衡好的含有TSA的体外培养液内，经 吹吸，脱去卵丘细胞及黏附卵上的精子，洗涤3-4次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的 500 yl/孔的含有TSA的体外培养液内培养10h，再用不含TSA的体外培养液洗涤2-3次， 放置于不含TSA的体外培养液内培养7d，统计囊胚率； 其中BCB-卵母细胞的获取：摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，置入温度在30-35°C，含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3h内用生理盐水清洗3-4次，用吸有 lml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8_的卵泡，将注射器内回收的卵 泡液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，放入添加浓度为25-30 y Mol/L的BCB 染色液，置于35-39°C水浴中染色80-90min，在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离，其 中将染色分离的BCB+卵母细胞，用成熟培养液洗涤2-3次，培养至24h，直接利用； 步骤4实验液体的配制： 抽卵液：TCM199hepes+lmg/ml PVA+0. 7 mg / ml 肝素纳； 亮甲酚蓝染色液：PBS+26 ii Mol/L亮甲酚蓝+ 5mg/ml BSA ; 成熟培养液：TCM199H⑶3+10%FBS+0. 05IU/ml FSH+0. 05IU/ml LH+1 ii g/ml estradiol+24. 2 u g/ml 丙丽酸纳 +0? ImM/L 半胱;氛酸 +10ng/ml EGF+lOOIU/ml 双抗； SOF :6. 29mg/ml NaCL +0? 534 mg/ml KCL+0. 162 mg/ml KH2P04+0. 6 ii 1/ml 乳酸钠 +0? 089mg/ml MgS04+2. lmg/mlNaHC03+0 . 0 3 5 7mg/ml 丙酮酸钠 +0? 299mg/mlCaCL2 ? 2H20 ; 体外受精液：S0F+20%FBS +6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素； 体外培养液：S0F+3mg/mlBSA ; 含 TSA 体外培养液：S0F+200nMol/L TSA+ 3mg/mlBSA。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：显微镜检测卵母细胞质量，细胞质不着蓝色 的BCB-卵母细胞质量显著低于胞质着蓝色的BCB+卵母细胞。
3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：试验选用的TCM199hepeS、PVA、肝素钠、亮甲 酚蓝、PBS、BSA、FBS、FSH、LH、estradiol、EGF、半胱氨酸、TSA 均购自 SIGMA 公司、双抗购 自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。
【文档编号】C12N5/075GK104342400SQ201410289845
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】黄俊成, 汪立芹, 杨楠, 林嘉鹏, 吴阳升, 赵云程 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心