一种N糖基转移酶BtNGT及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学中糖工程
技术领域：
，涉及一种来源于海藻糖巴氏杆菌(bibersteiniatrehalosi)中的n糖基转移酶btngt及其应用。
背景技术：
：糖蛋白是由寡糖和多肽链共价修饰链接而形成的一类重要的生理活性物质，它广泛存在于细胞膜，细胞间质，血浆以及粘液中。它在细胞信号识别，神经调控，细胞间的信息传达以及免疫调节的过程中扮演着非常重要的角色。蛋白质的糖基化修饰按照重要性依次分为n-o-p-c-和g-糖基化，其中n-连接最为普遍，它的研究最为透彻。研究发现将糖抗原与载体蛋白相结合，形成的糖蛋白疫苗可以刺激机体产生免疫记忆，因此糖蛋白疫苗的研究引起了广泛关注。而糖蛋白的获得以往是通过生物体内直接提取，或者是体外进行化学合成，这两种方法均存在步骤繁杂，成本较高的缺点。经检索，有关来源于海藻糖巴氏杆菌(bibersteiniatrehalosi)中的n糖基转移酶btngt及其酶学性质与其在对多肽进行n连接糖基化修饰中的应用还未见报。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种来源于海藻糖巴氏杆菌(bibersteiniatrehalosi)中的n糖基转移酶btngt及其在对多肽进行n连接糖基化修饰中的应用。本发明所述n糖基转移酶btngt，其特征在于：所述n糖基转移酶btngt来源于海藻糖巴氏杆菌(bibersteiniatrehalosi)，其氨基酸序列如seqidno.1所示。上述n糖基转移酶btngt利用来源于海藻糖巴氏杆菌(bibersteiniatrehalosi)的btngt基因由南京金斯瑞公司负责合成并构建于载体pet45b上，通过大肠杆菌bl21发酵诱导表达、纯化回收获得。本发明所述n糖基转移酶btngt在对多肽进行n连接糖基化修饰中的应用。其中，所述应用的方法是：以n糖基转移酶btngt作为一种多肽糖基化修饰的工具酶，将udp-glc或udp-gal转移至含n-x-s/t序列的多肽，形成糖肽。本发明公开的n糖基转移酶btngt属于n-糖基化修饰的一种重要的糖基转移酶，其可以简单快速的利用udp-glc或udp-gal将含有n-x-s/t序列的多肽进行糖基化，接着可以利用其他的糖基转移酶对糖肽的糖链进行修饰，从而获得目的糖肽。这为多肽与蛋白的糖基化修饰提供了一种新的途径，为糖蛋白疫苗的合成提供了一种简便的方法。附图说明图1：含btngt基因的pet-45b质粒提取的琼脂糖凝胶电泳结果其中：m表示琼脂糖凝胶电泳marker，1号泳道是从bl21实验菌株中提取的质粒bl21pet45b-btngt，2号泳道是原始构建质粒pet45b-btngt作为阳性对照。图2：btngt蛋白的sds-page考马斯亮蓝染色结果其中：m表示蛋白maker，btngt分子量大约在70kda左右，图中1号泳道为诱导后的菌体；2号泳道为超声破壁后的上清，3号泳道为超声破壁后的沉淀；4号泳道为上样流出液，5，6号泳道是低浓度咪唑洗脱目的蛋白流出液；7号泳道是250mm咪唑洗脱的目的蛋白液。图3：hplc检测btngt酶活结果图。图4：质朴鉴定结果图。图5：btngt最适温度结果图。图6：btngt最适ph结果图。图7：金属离子btngt酶活影响结果图。具体实施方式如下通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所有的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明的实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行各种变动或者改动也属于本发明的保护范围。下面结合附图对本发明提供的来源于海藻糖巴氏杆菌bibersteiniatrehalosi的btngt及其具体应用进行详细说明。本试验所采用的底物肽是由南京金斯瑞公司合成的在n端带有tamra标记的六肽danytk，本试验酶学反应之后均将反应液进行处理，利用hplc对反应进行分析，所采用的分析柱为c18反向柱，采用的分离程序如表1-1所示：表1-1hplc分析程序时间min色谱乙腈(0.1％三氟乙酸)超纯水(0.1％三氟乙酸)05％95％2565％35％3095％5％405％95％本发明设计的菌种和质粒来源见表1-2。表1-2本发明所用菌株和质粒实施例1：n糖基转移酶btngt的制备1.表达菌株的构建将金斯瑞公司合成的质粒转入bl21感受态细胞中，42℃热击1min，涂amp平板。将单菌落挑至5ml的试管培养基37℃200rpm培育12h，提质粒验证。质粒琼脂糖凝胶电泳结果见图1。2.btngt蛋白的表达与纯化将单菌落bl21pet45b-btngt挑入50mllb培养基中，(含50ug/ml的氨苄青霉素amp)37℃200rpm活化12h。接着扩大培养，将菌液转移至1l培养基中(含50ug/ml的氨苄青霉素amp)，200rpm37℃培育大约3.5h后，测od值，当od600值为0.6时，冰浴20min，之后加入400μl0.5m的iptg，诱导蛋白表达(16℃200rpm)。诱导20h后，10000rpm离心10min收集菌体，用bindingbuffer冲洗菌体，然后按每克湿菌体加入10ml的bindingbuffer的量悬浮菌体，冰浴条件下超声破碎菌体(40w，工作2s休息4s，破碎40min)，然后4℃12000rpm离心，收集上清。将上清用0.22um的滤膜过滤之后，加入到经bindingbuffer平衡过得ni-nta重力柱中，4℃孵育10min后，让液体经重力流经填料，依次用含10mm20mm咪唑的bindingbuffer除去杂蛋白，用含250mm咪唑的bindingbuffer洗脱目的蛋白，并收集目的蛋白。收集30ml左右的目的蛋白后，用10kd的超滤管4℃3500g离心脱盐。3.目的蛋白的检测通过sds-page的方法检测目的蛋白，蛋白检测结果见图2。目的蛋白即为n糖基转移酶btngt，其氨基酸序列如seqidno.1所示。实施例2：n糖基转移酶btngt在多肽糖基化修饰中的应用1.酶活的测定：测定酶活的底物肽为南京金斯瑞公司合成的带荧光标记的六肽danytk，在ngt的催化下，分别于udp-glc或udp-gal反应，反应液经hplc荧光检测器检测，反应体系如表1-3：表1-3aangt与btngt酶活检测反应体系反应结果见图3，实验证明btngt可以利用udp-glc和udp-gal，完成对多肽的糖基化修饰。接着对产物进行质朴验证，质朴结果图见图4。2.最适ph的测定：为了探究btngt的最适ph，我们选取不同ph的缓冲液，hac(5.0，6.0)pbs(6.0，7.0，8.0)tris(8.0，9.0，10.0)hepes(7.0，8.0)。并做10μl的反应体系，反应15min后煮沸5min停止反应，接着用hplc进行分析。反应体系如表1-4：表1-4最适ph的测定反应结果见图5，实验证明btngt在ph为8.0的pbs溶液中活性最强。3.最适温度的测定：为了探究btngt的最适温度，我们做10μl的反应体系，在不同的温度下反应15min(分别在10℃，20℃，30℃，37℃，40℃，50℃和60℃下进行反应)，接着煮沸5min停止反应，并用hplc进行分析，反应体系如表1-5：表1-5最适温度的测定反应结果见图6，实验证明btngt在20℃下反应效率最高。4.金属离子对活性的影响：选取了8中金属离子，研究金属离子对btngt酶活的影响，反应体系如表1-6：表1-6金属离子对酶活的影响反应结果如图7，发现其中btngt在有无金属离子的条件下下都有活性，其中ca2+与cu2+对于btngt的活性有着明显的抑制，mg2+的存在会使其活性略微增强。序列表<110>山东大学<120>一种n糖基转移酶btngt及其应用<141>2017-6-20<160>1<210>1<211>690<212>prt<213>人工序列<221>btngt的氨基酸序列<222>（1）…（690）<400>1msqeqktpsvirfeqavkakqyesacnelldilsqidsnfggingiefncpeqlnnpnls60kektiyfstrmadlitelfsdeslsltvggavrffsyqrwiallfacspyinsdhilqvy120nrnpdksnpnsvhlsanpndlvkfcimylpesnislnldaiwqlnptlcasmcfalqspr180figtkeafgkrgailqwfpeklaqlpnldnlpssishdvymhcsydvaankhdvkralnq240vmrrhlvtsgwvdrdiskigktngkpvmvvllehfhsahsiyrthstsmraarehfhlig300iggsavdkagqevfddfrlvegntifeklsfvkrlceeygaaifympsigmdlttifasn360trlapiqaialghpgtthsefieyvvveddyvgseacfsekllrlpkdalpyvpsalapa420sveyrlrenpevvnigiasttmklnpyfldalkairdrakvkvhfhfalgqssgithpyv480erfikshlgdsatahphspyhqymqilhncdmlvnpfpfgntngiidmvtlglvgicktg540pevhehideglfkrlglpewliantvdeyveravrlaenhaerlalrrhiiennglqtlf600tgdpkpmgqvfvqklnewaglhnidvsdfafaqssgkkvtksaktaakktvkvtvkksaq660pkestktksktekkktssakdaaktskkka690当前第1页12