一种利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法与流程

文档序号：11936866阅读：395来源：国知局

本发明属于生物催化领域，涉及一种共固定化酶催化合成D-丙氨酸的方法。把meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体和FDH共固定化于载体上，共固定化酶为生物催化剂，以NAD（H）为辅酶，催化α-酮酸底物合成D-丙氨酸，反应结束后将反应液直接滤除，共固定化酶回收可重复使用120批，在填充柱中可连续催化反应55天，活性没有明显下降，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到D-丙氨酸。产物D-丙氨酸的光学纯度 >98%。

背景技术：

-丙氨酸是白色晶体，有特殊的结晶形状。有甜味，溶于水、强碱和强酸溶液，不溶于无水酒精，乙醚和丙酮。在2%的盐酸（5 mol/L）中25℃比旋光度是-14.6，在2%的水中25℃比旋光度是-1.8。D-丙氨酸是一种非天然氨基酸，是重要的手性药物中间体，用于生产新型广谱抗生素、D-丙氨醇、多肽合成过程的丙氨酸保护剂、食品添加剂、化妆品、维生素B6以及合成新型甜味剂阿力甜等[代书玲，徐虹，欧阳平凯，D-天冬氨酸的制备和应用［J］.南京工业大学学报，2003，25（3）:108-110.]。

-丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法[Terasawa Masato，Nara shoichi.Manufacture of D2aspartic acid with aspartase［P］.JP：04008297，1992201213.]，化学合成法[Soda Kenji，Kageyama sadao.Manufacture of D -aspartic acid with malic acid dahydrogenase，alanine dahydrogenase，alanine racemase and D-amino acid transaminase［P］.JP:01285193，1989211216.]和生物酶催化合成法。其中，发酵法生产周期长、设备投资大、有副反应、分离较复杂、污染大；不对称化学合成法反应机制相当复杂，工艺过程长，需要纯手性试剂或贵金属络合物作催化剂，环境污染大。生物催化合成法是通过酶进行催化或者拆分，用于合成D-氨基酸的酶如转氨酶[Eul-Soo Park, Joo-Young Dong and Jong-Shik Shin, ω-Transaminase-catalyzed asymmetric synthesis of unnatural amino acids using isopropylamine as an amino donor, Org. Biomol. Chem., 2013, 11, 6929-6933]、meso-二氨基庚二酸脱氢酶（DAPDH）[Gao X., Chen X., Liu W., Feng J., Wu Q., Hua L., Zhu D., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78, 8595-8600，专利申请号：201210334554.6]以及目前国内外工业化生产D-丙氨酸普遍采用的氨基酸酰化酶［周秀琴.氨基酸代谢相关的酶［J］.发酵科技通讯，2006，35（1）:43-44.］等，酶催化方法存在酶的价格昂贵，同时游离酶对环境敏感、容易失活，且存在无法回收，反应成本高，二次污染等问题。

固定化酶技术发展于 20 世纪 60 年代。与游离酶相比有很多优点，如：产物易分离；可以重复多批次使用；酶的稳定性提高；简化了后期提纯工艺等[罗贵民. 酶工程[M]. 北京：化学工业出版社，2002，2]；共固定化酶是将两种或两种以上的酶固定于同一载体内形成共固定化系统的一种技术[徐莉，侯红萍. 酶的固定化方法的研究进展[J]. 酿酒科技，2010(1)：86–90]。共固定化酶可以充分发挥不同酶的特点，将其催化特性结合起来，充分利用协同作用，提高其催化效率。同时可以减少反应时间和步骤，连续生产，能够更好的控制产品质量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种反应条件温和，酶活力回收较高，成本低廉、工艺简单的利用共固定化酶制备D-丙氨酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法，具体包括以下步骤：（1）将一定比例的meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和甲酸脱氢酶酶液混合，加入环氧基树脂或者活化后的氨基树脂，室温下搅拌15-30小时，取出载体，用缓冲液洗至无游离蛋白，将载体加入到一定浓度的封闭剂溶液中25°C搅拌6-10小时，取出载体后将其用缓冲液洗三遍。得到的共固定化酶4°C保存备用。（2）α-酮酸、α-酮酸盐和氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系中加入共固定化酶和少量辅酶进行催化还原胺化反应，反应温度20~60 °C，反应pH值为6~11，反应时间4~72小时，制得光学纯度>98% D-氨基酸。（3）将反应液直接滤除，共固定化酶回收重复使用，得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到D-丙氨酸。

所述步骤（1）中meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体，可通过以下步骤获得：

a．以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35E单位点突变；

b．以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35E/R36V两位点组合突变；

c．以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36V两位点组合突变；

d．以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q两位点组合突变；

e．以pET32-StDapdh质粒为模板，使用Quick Change Mutagenesis Kit突变试剂盒引入R35D/R36Q/Y76V三位点组合突变；

f．将构建的突变子工程菌进行培养、并对目的蛋白进行诱导表达；

g．将步骤f中的单位点、双位点、三位点组合突变体分别收集菌体后，用缓冲液进行重悬，进行高压破碎，离心取破碎上清，通过Ni-NTA层析柱纯化；

h．将步骤f中三位点组合突变体收集菌体后，用缓冲液进行重悬，进行高压破碎，离心取破碎上清。将破碎上清于70℃水浴中热处理30 min，再次离心取热处理上清。

所述步骤（1）中载体为表面含有氨基或者环氧基官能团的载体，如：ES-1，ES-101，ES-102，ES-103，ESR-1，ESR-2, ESR-3, ESQ-1（购自天津南开和成科技有限公司），优选表面含有氨基的树脂为固定化载体。

所述步骤（1）中共固定酶meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和甲酸脱氢酶两种酶的酶量比例在1:1-1:5之间，优选比例为1:3。所选封闭剂包括盐酸乙二胺、二乙胺和α-甲基苄胺，乙醇胺等，封闭剂浓度在0.1mmol/g载体-3mmol/g载体，优选封闭剂为乙醇胺，浓度为0.1mmol/g载体-1mmol/g载体。

所述步骤（2）中，α-酮酸、α-酮酸盐和氨基化合物作为底物与溶剂构成的反应体系中加入共固定化酶和少量辅酶进行催化还原胺化反应，反应温度20~60 °C，优选反应温度为30~50 °C。反应pH值为6~11，优选pH值为7~9，反应时间4~72小时，优选反应时间为4-24小时。

所述步骤（3）中反应结束后，反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到光学纯度>98% D-氨基酸。

反应产物构型检测：

向反应产物中加入高氯酸使蛋白变性后，对反应产物氨基酸进行衍生，利用衍生后的L、d-丙氨酸标样做对照，确定产物构型以及ee值。

附图说明：

附图1 为本发明的工艺流程图；

附图2为丙氨酸消旋体HPLC谱图；

附图3为产品D-丙氨酸构型HPLC谱图；

附图4为产品核磁谱图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例来进一步说明本发明内容，但是这些实施例不构成对本发明的限制。下列实例中所用材料除特别说明外，所用化学药品、试剂均购自Sigma公司。DNA和蛋白质Marker均购自Fermentas公司，蛋白纯化Ni-NTA填料购自GE。Quick Change Mutagenesis Kit购自Agilent公司，突变引物按照试剂盒要求进行设计。引物合成、DNA序列测定均由华大基因公司（北京）进行。pET₃₂质粒载体，TOP10、BL21(DE3)高效感受态（Novagen）。液相色谱分析使用Agilent-1200色谱仪，色谱柱为Eclipse XDB-C18柱(4.6 × 150 mm)，固定化载体购自天津南开和成科技有限公司。

实施例1：meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体的获得

所用StDapdh基因Genbank号为AP006840.1，先将该基因全合成并连接到pET₃₂载体上获得质粒：pET₃₂-StDapdh，并在大肠杆菌BL21（DE3）中对野生型基因进行可溶表达，表达出的蛋白N-端带有6×his tag，以利于后续Ni-NTA纯化。根据需要突变的位点，参照Quick Change Mutagenesis Kit试剂盒使用说明，合成表1中所用PCR突变引物，PCR产物扩增、Dpn1切割及后续核酸回收均按试剂盒使用说明进行。

表1：突变PCR引物

以pET32-StDapdh质粒为模板，使用引物1和2在质粒上引入R35E/R36V双突变，并转化至大肠杆菌TOP10感受态，提取质粒并测序确认获得双突变质粒pET₃₂-StDapdhR35E/R36V。以获得的双突变质粒为模板，使用引物3和4在该突变子上继续引入Y76V突变，获得三突变质粒：pET₃₂-StDapdhR35E/R36V/Y76V，转化入大肠杆菌BL21(DE3)高效感受态中，并提取质粒测序确证。

实施例2：meso-二氨基庚二酸脱氢突变体酶的表达、热击处理制备

将含有三突变质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在2 L LB液体培养基中进行培养，37℃培养至OD₆₀₀约0.8后，向其中加入终浓度0.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，诱导温度为30℃，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于5000 rpm离心5分钟收集菌体。取部分菌体样品进行纯化及活力确定，利用缓冲液A（20 mM Tris-Cl pH 8.0）重悬并洗涤菌体，高压匀浆破碎，14000 rpm离心30分钟去除破碎沉淀。由于粗酶中的其他杂酶(L-氨基酸脱氢酶，羰基还原酶等)对产物的ee值、产物纯度都有影响。StDAPDH突变子有较好的热稳定性，通过对粗酶进行热处理，在维持StDAPDH活力的情况下去除对反应有影响的杂酶。在70℃水浴中对上清进行热处理，每隔10 min取一次样100 μL，连续取样40 min。每次取样后均离心取上清，上清一部分进行SDS-PAGE电泳（结果见附图1）。

实施例3：FDH酶液制备

将来源于假丝酵母（Candida bodinii）的甲酸脱氢酶基因克隆于pET21d（+）表达载体上，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行可溶性表达，种子液以1%的接种量接种至新鲜LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀约0.8后，向其中加入终浓度0.5 mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，诱导温度为20℃，诱导时间为20小时。诱导表达结束后，于5000 rpm离心5分钟收集菌体。高压匀浆破碎后进行硫酸铵沉淀，收集55%硫酸铵上清进行下一步的疏水层析。疏水层析柱为Phenyl Sepharose 6 Fast Flow column（high sub）（GE Healthcare）。缓冲液A（50 mM Kpi pH 8.0，55%硫酸铵）用于平衡，缓冲液B（50 mM Kpi pH 8.0）用于洗脱，4ml/min流速， 0-100% B液洗脱。洗脱峰收集后用缓冲液C（50 mM Kpi pH 8.0，100 mM 氯化钠）透析，超滤管浓缩后-80 ℃冰箱保存备用。

实施例4：固定化酶的制备

将1ml meso-二氨基庚二酸脱氢酶突变体酶液和3.3ml甲酸脱氢酶酶液加入到磷酸缓冲液(0.1M,pH 7.8)中，再加入3g 活化后的ESR-2氨基树脂，在室温下温和的搅拌20小时，取出载体，用缓冲液洗至无游离蛋白，再在0.5mmol/L的乙醇胺溶液中搅拌4小时，然后取出载体，用缓冲液洗三遍。4℃保存备用。

实施例5：催化反应体系建立，及产物ee值的测定

将0.2 M底物丙酮酸，0.6 M甲酸铵溶于1 mL水中，用碳酸氢钠调pH值至7.5左右，加入0.5 mg 辅酶NAD⁺，以及共固定化酶100mg， 200 rpm转速于37℃反应6小时。反应液滤除，共固定化酶重复使用，反应液加入10 µl高氯酸来结束反应，取反应液20μL，用水稀释至200μL，加入400 μL FDAA衍生试剂，再加入80 μL的1 M的NaHCO₃， 40 ℃反应1 h后加入40 μL 的2 M的HCl，0.45 μm的膜过滤HPLC分析。

实施例5：共固定化酶在填充柱中连续催化反应

先取一根高径比为30的有机玻璃柱作为填充柱，把实施例4中的共固定化酶填充到填充柱中。然后将0.1 M丙酮酸，0.3 M甲酸铵溶于水中，用碳酸氢钠调pH值至7.5左右，加入0.3g/L 辅酶NAD⁺，在温度为35 ℃条件下，以流速为1 ml/min流经填充柱，在此反应条件下，D-丙氨酸产率为75%，共固定化酶转化55天，活性没有明显下降。得到的反应液通过酸性离子树脂吸附分离得到D-丙氨酸。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种利用共固定化酶合成D-丙氨酸的方法

<130> 2015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> Symbiobacterium thermophilum

<400> 1

atggacaaac tgcgtgttgc ggttgttggt tacggtaacg ttggtcgtta cgcgctggaa 60

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