专利名称：拟南芥糖基转移酶ugt74d1在催化合成生长素糖酯中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖基转移酶的应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用；属于生物技术领域。
背景技术：
生长素是植物的重要激素之一，它对植物的生长发育有重要的调节控制作用。天然存在的生长素如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)以及人工合成的生长素类物质如2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)等都被广泛应用在科研和农业生产中。这些生长素类物质都含有一个羧基基团(-C00H)。在植物体内，该羧基上的羟基可与葡萄糖以共价键结合，从而形成生长素的糖酯。生长素的糖酯被认为是生长素的失活形式和贮藏形式(Bartel, 1997)。当前，生长素的糖酯常作为标准品被用在生长素糖基化修饰等科学研究中。在化学和生物技术产业，获得生长素糖酯的途径主要有两种从植物中提取和化学合·成。由于在植物中生长素糖酯的天然含量很低，提取量非常有限，纯度难以保证，并且提取过程复杂。如果用化学方法合成，也有过程复杂、成本高、环境污染等缺点。相比之下，生物酶法合成生长素糖酯化合物则具有效率高、成本低、环境清洁等优点。植物体内有一类酶，被称为糖基转移酶，它们专门负责植物体众多化合物的糖基化修饰，即催化某些化合物形成相应的糖酯(或糖苷)。糖基化是一种普遍的生理现象，是植物细胞维持代谢平衡的主要机制之一，在维持植物正常生长发育、应对环境压力等方面具有重要的作用(Lim et al，2004;王军等，2009)。到目前为止，生物界存在的糖基转移酶按照催化的底物性质和序列相关性可以分为94个家族。其中家族I (GTl)的酶所催化的底物是一些亲脂性的小分子化合物，在其-0H、-C00H、-NH2、-SH或C-C基团上能催化结合上一个或多个糖基(Bowles et al. 2005)。针对生长素糖酯化合物的合成，目前已经从拟南芥发现了一个糖基转移酶，即UGT84B1 (Jackson et al. 2001 )，该酶对IAA具有最大的酶催化活性。然而，经过检索，目前尚未发现其他的拟南芥糖基转移酶在催化合成生长素糖酯中的作用，特别是拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用的报道。
发明内容
(I)本发明的目的针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用。(2)实现本发明的具体技术方案本发明所述的拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用。其中所述糖基转移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。该糖基转移酶是通过糖基转移酶基因UGT74D1在大肠杆菌中表达和纯化后获得的。糖基转移酶基因UGT74D1是通过RT-PCR方法从拟南芥中克隆的。所述生长素是指吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)。本发明提供新的糖基转移酶UGT74D1能够催化多种生长素物质形成糖酯。将糖基转移酶UGT74D1与生长素之一放于反应管中，按实施例2中所指出的条件进行酶促反应，即可催化合成相应的生长素糖酯。与已经报道的UGT84B1不同的是，本发明所述糖基转移酶UGT74D1对IBA具有最大催化活性。(3)本发明实施后可能带来的有益效果本发明是在国内外首次证明拟南芥的糖基转移酶UGT74D1可以催化多种生长素化合物生成其糖酯物质。本发明的公开为体外利用酶催化方法合成这些生长素物质的糖酯 物提供了可行的方法。用提取方法或化学合成方法获得生长素糖酯物不仅效率低，而且缺乏专一性。而用糖基转移酶UGT74D1催化方法则可以高效、专一性的合成吲哚丁酸、吲哚丙酸、吲哚乙酸、萘乙酸等相对应的的糖酯(见附图I至附图6)。本发明实施后将为生长素糖酯合成工业带来巨大经济效益。
图I.纯化的融合蛋白GST-UGT74D1用SDS-PAGE检测。其中，M为蛋白质分子量标记；序号I泳道为GST标签蛋白，作为对照；序号2泳道为纯化的GST-UGT74D1融合蛋白，其中有微弱的GST带，是一种在pGEX纯化系统中比较常见的现象。图2.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丁酸形成糖酯，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析。其中I为对照组，纯化的GST标签蛋白与吲哚丁酸和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖苷合成；2为实验组，纯化的GST-UGT74D1融合蛋白与吲哚丁酸和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头b所指)，该产物被推测为吲哚丁酸糖酯。图中的a为底物吲哚丁酸。图3.吲哚丁酸的催化产物用质谱(LC-MS)鉴定。其中上图表示吲哚丁酸糖酯的标准质谱图，下图表示吲哚丁酸的催化产物(图2中的peakb)的质谱图。两图特征峰相同，证明吲哚丁酸在酶的催化下形成了糖酯。图4.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚丙酸形成糖酯，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析。其中I为对照组，纯化的GST标签蛋白与吲哚丙酸和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖苷合成；2为实验组，纯化的GST-UGT74D1融合蛋白与吲哚丙酸和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头c所指)，该产物即为吲哚丙酸糖酯。图5.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化吲哚乙酸形成糖酯，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析。其中I为对照组，纯化的GST标签蛋白与吲哚乙酸和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖苷合成；2为实验组，纯化的GST-UGT74D1融合蛋白与吲哚乙酸和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头d所指)，该产物即为吲哚乙酸糖酯。图6.纯化后的融合蛋白GST-UGT74D1催化萘乙酸形成糖酯，催化产物用高效液相色谱(HPLC)分析。其中I为对照组，纯化的GST标签蛋白与萘乙酸和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖苷合成；2为实验组，纯化的GST-UGT74D1融合蛋白与萘乙酸和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的产物峰(箭头e所指)，该产物即为萘乙酸糖酯。
具体实施方式
实施例I拟南芥糖基转移酶基因UGT74D1的克隆、原核表达与酶蛋白纯化I.拟南芥糖基转移酶基因UGT74D1的克隆本发明涉及的糖基转移酶基因UGT74D1是通过RT-PCR扩增技术从拟南芥中克隆的。首先利用TRIzoI方法从拟南芥幼嫩叶片提取RNA，然后用RT-PCR方法扩增得到该基因的编码区 cDNA。扩增时用的一对引物是UGT74Dl_a: 5’ -cgccatatgggagagaaagcgaaagc_3，；UGT74Dl_b: 5，-ccgctcgagttacctcacaattttagc-3，。RT-PCR 扩增程序为94 °C (预变性)，5min ;94°C (变性)，IOs ;55°C (退火)，15s ;72°C (延伸)，2min ;35cycle ;72°C (终延伸)，10min。回收并纯化扩增产物。将扩增获得的目的基因UGT74D1与EcoRV单酶切的中间载体pBluescript SK连接，获得载体pB74Dl，对克隆到的基因进行测序。2. UGT74D1的序列信息与特性对克隆的糖基转移酶基因UGT74D1测序后发现，该基因的cDNA编码区长度为1371bp，编码456个氨基酸，编码的蛋白质分子量为51. 1KD，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。其C端有一个含44个氨基酸的PSPG盒，该盒是催化小分子化合物的糖基转移酶共同具有的保守序列，说明克隆的基因是拟南芥的糖基转移酶基因。3.拟南芥糖基转移酶基因UGT74D1的原核表达载体构建在公开通用的原核表达载体PGEX-2T的基础上，按照《分子克隆》(Sambrook等编著)所示的方法，对该载体进行改造，使其多克隆位点包含NdeI和Xhol。用NdeI和XhoI双酶切该表达载体，回收载体片段备用。同时用NdeI和XhoI双酶切前述载体PB74D1，回收得到目的基因片段，并将其连入上述原核表达载体中，得到拟南芥糖基转移酶基因UGT74D1的原核表达载体PGEX-74D1。4.转化大肠杆菌、诱导蛋白表达及酶蛋白的纯化将上述原核表达载体pGEX-74Dl转化大肠杆菌菌株XLl_Blue，PCR和酶切验证正确后，保存菌种，此菌种用于融合蛋白(GST-UGT74D1)的表达纯化。在添加了氨苄青霉素(100mg/L)的2XYT液体培养基中过夜培养上述菌种，以活化该菌种。然后将过夜培养物按照1:100 (过夜培养物新的2XYT液体培养基)的比例扩大至75ml培养液中，37°C培养至OD6tltl=O. 8。然后加入IPTG至O. 2mM，转到20°C震荡培养24h以诱导目的蛋白表达。到时间后通过离心收集菌体。菌体加入2ml Blast Buffer (O. 5mM EDTA，750mM 蔗糖，200mM Tris_HCl，pH=8. 0)重悬,立即加入14ml稀释的(1/2 X )Blast Buffer (事先添加2mg溶菌酶),混勻后于冰上放置30min，离心收集菌体，用PBS(内含O. 2mM的PMSF)重悬，冰上放置30min后IOOOOrpm离心20min，取上清。在上清中加入100 μ I的谷胱甘肽琼脂糖珠子，按照pGEX蛋白纯化手册操作，最后用Elution Buffer (50mM Tris-HCl，IOmM还原型谷胱甘肽，pH=8. O)洗脱目的蛋白。目的蛋白的纯度用SDS-PAGE方法检测，蛋白浓度按照Bradford试剂盒说明书中的方法进行测定(用BSA作为蛋白标准)。实施例2拟南芥糖基转移酶UGT74D1催化生长素糖酯的合成I.生长素的酶催化反应
用纯化到的拟南芥糖基转移酶UGT74D1的融合蛋白(GST-UGT74D1，能够反映UGT74D1的催化活性，属于常用的做法)进行体外的酶催化反应，选取6种生长素化合物作为底物，包括吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。催化反应中用UDP-葡萄糖作为糖的供体。酶促反应
体系如下
HEPES (pH=7.0)ιπΜ
MgSO42、
mM
KClIOm
M
UDP-葡萄糖i 25
mM
生长素I
mM
糖基转移酶I 2
m
dc! H0up to
200μ1将以上混合好的反应体系放于37°C恒温水浴锅中，反应3小时。然后加入20 μ I浓度为240mg/ml的三氯乙酸终止反应。将反应管用液氮速冻后存放在_20°C，直到HPLC分析。2.酶催产物的HPLC鉴定用高效液相色谱(HPLC)分析以上的反应混合体系，所用的仪器为岛津LC-20AT，柱子为C18 (Ultimate, 4. 6 X 150mm, 5 μ m),工作站为Ver I. 21, 二极管阵列检测器。流动相为甲醇和水(均含有O. 1%的磷酸)，二元高压梯度洗脱，其中有机相的比例分别为吲哚丁酸、吲哚丙酸、萘乙酸为10%-70%，吲哚乙酸为10%-48%。洗脱时间为22min。上样量为20 μ I。HPLC分析显示，与对照(反应体系中只含有纯化的GST标签蛋白)相比，UGT74D1融合蛋白对6种生长素化合物都能催化合成相应的糖酯(附图中图I 图6只显示其中4种生长素的HPLC分析结果)。3.酶催产物的质谱鉴定对酶催化产物进行LC-MS鉴定，仪器为Surveyor MSQ,所用的流动相为甲醇和水(均含有O. 1%的磷酸)，有机相梯度和洗脱时间同上述HPLC方法。
结果发现酶促反应生成的产物为各自生长素的糖酯产物(作为代表，附图只出示了吲哚丁酸糖酯的质谱结果，见附图3)。由此得出结论拟南芥糖基转移酶UGT74D1可用于催化合成生长素的糖酯。
权利要求
1.拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述糖基转移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述生长素是吲哚甲酸(ICA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(應么)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-0)。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶UGT74D1在催化合成生长素糖酯中的应用；其中所述糖基转移酶UGT74D1的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，所述生长素是吲哚甲酸、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸，将糖基转移酶UGT74D1与所述生长素任一种放于反应管中进行酶促反应，即可催化合成相应的生长素糖酯。本发明的公开为利用酶催化方法高效、专一性地合成这些生长素物质的糖酯物提供了可行的方法，本发明实施后将为生长素糖酯合成工业带来巨大经济效益。
文档编号C12P19/18GK102796786SQ20121033543
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者侯丙凯, 金尚卉 申请人:山东大学