专利名称：一种香菇l9319菌种的ssr标记指纹图谱与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于香菇菌种的检测领域，特别涉及一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用。
背景技术：
我国香菇产量已从1983年的I. 95万吨迅速发展到2005年的242万吨，占全球香菇总产量的70%以上，改写了世界食用菌产量的排行榜，并不断縮小与排行第一的双孢蘑菇产量差距，有专家预测，由于中国香菇产业的迅猛发展，在近10年内其将成为世界产量最高的食用菌。中国香菇以其惊人的发展速度，优质的品质及低廉的成本为世界菇业人士瞩目，中国香菇已风靡世界。
优质菌种在香菇单产和质量中的贡献率举足轻重，这决定了香菇菌种在香菇产业中的重要地位。1999年我国签署了《国际植物新品种保护法》，这不仅要求我们尊重其它国家的品种知识产权，同时也要加强保护我们国家自己的品种知识产权，为了建立食用菌新品种登记制度来真正保护我国的品种产权，必须首先建立成熟的品种鉴定技术，为新品种登记奠定基础。尤其日本2004年4月I日开始实行《种苗法修正案》，对我国食用菌尤其是香菇的出口构成了极大的威胁。就国内而言，香菇栽培菌种“同种异名，异种同名”的现象，不仅给菇农带来了极大的损失，影响了他们的栽培积极性，也极大地影响了中国香菇的快速发展；而且，随着大規模的エ厂化栽培方式的出现，对香菇栽培菌株质量的要求越来越高，需要发展更为简便、快速、准确的菌株鉴定技木，以保证每批次的用种都准确无误。面对这种局势，就需要我们进一歩加快菌种鉴定技术的研究，在香菇的研究中引进更为有效的菌种鉴定体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱及其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。本发明的一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱，该指纹图谱由7对SSR标记组成，是基于香菇基因组简单重复序列片段开发SSR引物，扩增带型好，重复性高的SSR引物，标记详细信息如表I。表I SSR标记详细信息列表
引物名称扩增的重复序列正/反_引物Tm(°°)
LefpOOO I (CT)7ACGCGTATCCTCCCCTAAG17OU
A AGCG ATATGG ATTTGACGC
Le_fp0002(CGAQ6GGGCGAAACAATTTCAGGTA/60
—ATGCCATCGTAAGGAACTCG
Le fp0()03(CT)9ATTGTGACTCGACCACCTCC/GU
—TCATAATGCATCCCGTGAGA
I.e_fp0004(AGGT)5CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/60
~AACCGGAGTGGTCTAAGTGC
Le_fp0005(TAC' )7tatgtaga( GG AT )6C:ATCAACCAAA(.:CAAGATTC:AA/ 60
TTCCAATTTCCTCCGAGTCA
Le_fp0006(TCA )6CATGGGAGAGATTCGGAAAA/OU
—CGAGACCGACGACTTTGACTLe_fp0007(CTC)6CATTGCTCGGATCCTTCATT/60
—TACCTCGTGCGGACTTTGAT本发明的一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱的应用，是利用香菇基因组简单重复序列片段开发的7对SSR引物，通过对收集的25份国审香菇栽培品种的SSR引物带型扩增，本发明确定了 7对SSR引物在香菇L9319菌种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同SSR等位片段的编号组合可有效识别L9319菌种(图2_8)。通过对照50bpDNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的相对分子量，存在L9319菌种特异SSR等位片段组合的菌种，即是香菇L9319菌种，该菌种的编号组合为11 (1+2)11 (1+2) (1+2)。表2 SSR引物扩增的等位片段信息汇总表
序P丨輪々新，て/丨輪等位片段编号及其相对于
号j I物福正Ix向j丨物き的数5卿DNA ladder的分子量
1Le_fp000l 八 CGCGTATCCTCCCCTAAGT/い600bp;
AAGCGATATGGATTTGACC.C
2Le_fp0002 GGGCGAAACAATTTCAGGTA/1^290bp
ATGCC ATCGTA AGG A ACTCG1
3Le_fp0003 ATTGTGACTCG ACCACCTCC/I—>900bp; 2^800^
TCATAATGCATCCCGTGAGA
4I.e_fp0004 CCCAAAAAGGATTTCAGCAA/い400bp;
AACCGGAGTGGTGTAAGTGC
5Le_tp0005 ('ATCAAfX^AA AC(^AA(；ATTCAA/l-^720bp；
TTCCAATTTCCTCCGAGTCAI
6Le_fp0006 C^'GGGAGAGATTCGGAAAA/l-^SOObp； 2->780hp；
CGAGACCGACGACTTTGACT
7Le_ip0007 CATTGCTCGGATCCTTCATT/ 1^700bp 2—60()bp。_TACCTCGTGCGGACTTTGAT_ _有益效果本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。检测所需时间只需要3 4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国25个通过国审的香菇主栽菌种中具有L9319菌种的专ー性，具有良好的应用前景。
图I为香菇L9319菌种SSR标记指纹图谱，其中M是50bp DNA ladder，数字代表的是所用的7对SSR引物，NC是空白对照，箭头所指的是香菇L9319菌种的特异性SSR等位片段组合；图2为引物Le_fp0001在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；图3为引物Le_fp0002在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；图4为引物Le_fp0003在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；图5为引物Le_fp0004在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；图6为引物Le_fp0005在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；图7为引物Le_fp0006在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱；
图8为引物Le_fp0007在所选国审香菇栽培材料中的扩增图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进ー步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I(I)菌丝培养将香菇菌种转接到马铃薯葡萄糖培养基中，23°C 25°C下避光摇瓶培养，3cT4d后收集菌丝；(2)基因组DNA的提取用CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)法提取上述菌丝的基因组DNA，紫外分光光度法检测总基因组DNA浓度和纯度，调整样品DNA的浓度一致；CTAB法提取菌丝的基因组DNAエ艺包括①将液氮冷冻干燥的香菇菌丝研磨成粉末，加入65°C预热的2XCTAB抽提液，于65°C保温45 60min，间或轻摇混匀；②12000rpm、4°C离心 20min,取上清液；③在上述上清液中加入体积比为25 24 1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混匀lOmin，12000rpm、4°C离心lOmin，取上清液移入离心管中；④在上述离心管中加入体积比为24 1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀lOmin，12000rpm、4°C离心lOmin，取上清液移入另ー离心管中；⑤在上述离心管中加入2/3体积(相对于步骤(4)中的上清液)的_20°C预冷的异丙醇，轻轻摇动5min, 8000rpm、4°C离心lOmin,去上清；⑥将得到的沉淀用75vol%こ醇和10mmol/L醋酸钾洗漆2 3次,每次8000rpm,室温离心5min ；⑦加入预冷的95vol%こ醇,轻轻上下颠倒，8000rpm室温离心IOmin,弃こ醇,真空抽干或自然晾干；⑧加入100 UL IOXTE (Tris/EDTA)缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解；⑨加入I ii L 10mg/mL 的 RNaseA 于 37°C水浴 lh，去除 RNA ；⑩将得到的DNA提取物于_20°C冰箱贮藏备用；(3) SSR分子标记的检测对上述提取的DNA进行基因SSR标记的PCR扩增；PCR 扩增体系为总体积 20 ii L，包括10XPCR buffer 2 u L, 25mmol/L MgCl22u L, lOmmol/LdNTP 0. 4u L,5U/u L Taq DNA 酶0. 2 y L，10 y mol/L SSR标记正向引物和反向引物总体积各I. 5 ii L，浓度20ng 30ng/ u L提取的模板DNA 2 u L, ddH20 10. 4uL ；PCR 反应条件94で 5min ；94°C 30second, 55°C 30second, 72°C 30second, 30 个循环；72°C 5min(4)电泳检测将上述PCR扩增得到的产物与2 ii L加样缓冲液混匀，于95°C变性5min,结束后置于冰水混合物中冷却3min，点样3 u L于变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶的体积百分比浓度为6%，电泳缓冲液为1XTBE，电压lOOOv，电流200mA，功率200W，电泳45min，银染，显色，拍照，分析結果。银染的具体エ艺为电泳完成后卸下并拆开玻璃板，胶板卸下后，用去离子水水洗5-8秒，浙干水分后，在银染液(I. 5克硝酸银和1500ml水)中避光银染8分钟，银染后，用去离子水水洗5-8秒,浙干水分,放入显影液(16克氢氧化钠、1000ml水和8ml甲酸)中，至显影后取出水洗后即可读数。 采用7对SSR弓I物对香菇菌株进行PCR扩增，通过对照50bp DNA ladder可确定各SSR引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编号组合为11 (1+2)11 (1+2)(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇L9319菌种，如图I中箭头标注所示。为保证鉴定的准确性，建议进行三次重复实验。
权利要求
1.一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于该指纹图谱由7对基于香菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成，7对SSR标记在香菇L9319菌种上扩增的等位片段信息具体为 Le_fp0001的等位片段的数量为1，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为600bp ； Le—fp0002的等位片段的数量为1，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为290bp ； Le_fp0003的等位片段的数量为2，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为900bp，等位片段2相对于50bp DNA ladder的分子量为800bp ； Le_fp0004的等位片段的数量为1，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为400bp ； Le_fp0005的等位片段的数量为1，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为720bp ； Le_fp0006的等位片段的数量为2，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为800bp，等位片段2相对于50bp DNA ladder的分子量为780bp ； Le_fp0007的等位片段的数量为2，等位片段I相对于50bp DNA ladder的分子量为700bp，等位片段2相对于50bp DNA ladder的分子量为600bp。
2.根据权利要求I所述的ー种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱，其特征在于所述7对SSR标记等位片段的特异编号组合为11 (1+2)11 (1+2) (1+2)。
3.—种如权利要求I所述的香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱的应用，其特征在于应用于鉴定香菇L9319菌种的特异等位变异组合以及鉴定香菇L9319菌种相对于其他国审香菇品种的特异性。
全文摘要
本发明涉及一种香菇L9319菌种的SSR标记指纹图谱与应用，该指纹图谱由7对基于香菇基因组序列开发的SSR标记的特异等位片段组合而成。应用包括对香菇菌种进行SSR标记扩增，将得到的带型与指纹图谱对照，与该指纹图谱一致即为香菇L9319菌种。本发明与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、可重复性好的优点，在收集的我国25个国审的香菇主栽菌种中具有香菇L9319菌种的专一性。
文档编号C12Q1/68GK102851377SQ20121033502
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者章炉军, 谭琦, 宋春艳, 尚晓冬, 鲍大鹏, 杨慧, 张丹, 巫萍 申请人:上海市农业科学院