专利名称：一种不添加有机溶剂制备β-环状糊精的方法
技术领域：
本发明涉及酶工程技术领域，是用重组大肠杆菌表达的环状糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用淀粉制备β -环状糊精(β_⑶)的方法。
背景技术：
环状糊精(CD)，又称环聚葡萄糖，是由环绕糊精转移酶(CGT酶)作用于淀粉形成6-12个D-吡喃葡萄糖基以α-1，4-糖苷键连接的环状聚合物。根据葡萄糖残基个数的不同，CDs—般分类为 α-、β-、Υ-、δ-、ε-、ζ-及 η-CD，分别由 6、7、8、9、10、11 及 12 个葡萄糖单元组成，其中研究最多且应用最广的是α-、β-、Υ_⑶。目前β_⑶的应用最广泛，这是由于β_⑶的孔径适中，性质稳定。β_环糊精是一种具有内疏水外亲水的筒状结构，这种独特的分子结构可以使它通过范德华力、疏水作用力以及主客体分子之间的空间匹配效应，与一些电荷、极性、结构、性质相匹配的客体分子或基团形成超分子包合物，改变这些物质的物理和化学性能，进而能被大量地应用于医药、食品、日用消费品及化工等领域。因 此大规模生产β_⑶有重要的意义。现有的β-CD的生产方式有化学法和酶法，化学合成方法价格昂贵、产率也很低，只适合科学研究。另外一种就是用酶制备，这也是世界上最为常用的方法，和化学法相比条件温和产率也很高。酶法生产⑶，得到的是三种⑶的混合物，分别是α-、β-、Υ-⑶。传统的CD制备工艺主要是有机溶剂法，利用CD与有机溶剂的包合作用促使产物CD从反应液中沉淀分离出来。如果在酶转化淀粉的过程中添加有机溶剂，则可发挥多重作用，反应过程也变为可控制过程。这是由于α-、β-、Υ-⑶内腔孔径不同，可以对有机溶剂进行选择性包合，不溶包合物的生成改变了反应体系的平衡，会促使更多⑶的转化生成，而且利用包合的选择性也可以使不同的CD单独沉淀，从而实现对混合产品的分离纯化。我国用酶法制备β-CD的方法大同小异，但依然无法克服成本、周期、产率等方面的问题。相比日本、德国、法国等国家产量不高，价格较贵且纯度不高，国内环糊精的供需也多依靠进口。鉴于β -⑶在轻工业中广泛的应用价值，国内对⑶的制备开发十分重视，应用研究也不断深入。目前的制备方法存在的缺陷是制备步骤繁多(需要两次液化和多次调ΡΗ)，并且添加有机溶剂(环己烷)后虽然产率高但对环境有污染、在个别卫生安全领域要求较高领域(食品，医药)的应用会受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种用重组大肠杆菌表达的环状糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用淀粉制备β -环状糊精(β -CD)的方法，可以不添加有机溶剂。本发明的制备β_环状糊精(β_⑶)的方法是利用重组大肠杆菌转化表达产生的酶作用于木薯淀粉，具体工艺流程为
1)取底物木薯淀粉在9(TlO(TC下糊化20分钟，将温度降至55°C；
2)加入5-6U/g底物的环状糊精葡萄糖基转移酶，加入CaCl2保证整个体系CaCl2的浓度是30mmol/L，用NaOH调pH至7. 5-8. O,搅拌水解20 30分钟，搅拌至反应液不再粘稠为止；
3)将温度升至63 65°C搅拌反应15 17小时；
4)反应结束后将反应液于100°C灭酶活15 20分钟；
5)加入40U/gα -淀粉酶，用HCl调pH至6 6. 5，60°C下反应I 3小时；
6)水解完全后，温度升至100°C，加入2%(W/V)活性炭脱色2 4个小时过滤；
7)温度降至40°C,减压蒸懼至原体积的1/5后，降温至5°C,IOOOOrpm离心IOmin,下层固体即为β-环糊精。与现有技术相比，本发明的具有以下优点 I.不需要静置液化，一步液化后就进行环化反应，简化了工序。2.不需要频繁调动pH值，过程中pH比较稳定。3.不添加有机溶剂，对环境的污染小并且在一些特殊要求领域(食品，医药等)可得到广泛的应用。4.生产出来的β-⑶产率均在26%以上，且纯度较高，用分光光度机法测量纯度均在95%以上。
图I是分光光度计法测定β -⑶含量的标准曲线。图2是本发明的β -环状糊精(β -⑶)的制备流程图。
具体实施例方式实施例I :
称取木薯淀粉15g至250ml的锥形瓶中，100°C下糊化20分钟；温度降至55°C，取环化活性5U/g底物的CGT酶量加入到淀粉浆液中，并加入CaCl2保证体系中CaCl2的浓度为30mmol/L，用NaOH调pH为7. 5搅拌水解20分钟，搅拌到体系不再粘稠为止；温度升至63°C搅拌反应15个小时；将反应液于100°C中15分钟灭酶活后，加入40U/g α -淀粉酶，用HCl调pH为6. 5，60°C反应I小时水解剩余的淀粉，然后温度升至100°C后加入2g活性炭脱色2个小时。温度降至40°C减压蒸馏至原体积的1/5。温度降至5°C，IOOOOrpm离心10分钟弃去液体，余下的固体即是粗制β_⑶，质量是3.951g，产率为26. 34%。实施例2
称取木薯淀粉15g至250ml的锥形瓶中，100°C下糊化20分钟；温度降至55°C，取环化活性6U/g底物的CGT酶量加入到淀粉浆液中，并加入CaCl2保证体系中CaCl2的浓度为30mmol/L，用NaOH调pH为8. O搅拌水解20分钟，搅拌到体系不再粘稠为止；温度升至64°C搅拌反应17个小时；将反应液于100°C中15分钟灭酶活后，加入40U/ga-淀粉酶，pH用HCl调到6. 0，60°C反应2小时水解剩余的淀粉，然后温度升至100°C后加入2g活性炭脱色3个小时。温度降至40°C减压蒸馏至原体积的1/5。温度降至5°C，IOOOOrpm离心10分钟弃去液体，余下的固体即是粗制β_⑶，质量是3.963g，产率为26.42%。实施例3:
称取木薯淀粉15g至250ml的锥形瓶中，95°C下糊化20分钟；温度降至55°C，取环化活性5U/g底物的CGT酶量加入到淀粉浆液中，并加入CaCl2保证体系中CaCl2的浓度为30mmol/L，用NaOH调pH为7. 6搅拌水解30分钟，搅拌到体系不再粘稠为止；温度升至65°C搅拌反应16个小时；将反应液于100°C中15分钟灭酶活后，加入40U/ga-淀粉酶，pH用HCl调到6. 5，60°C反应3小时水解剩余的淀粉，然后温度升至100°C后加入2g活性炭脱色3个小时。温度降至40°C减压蒸馏至原体积的1/5。温度降至5°C，IOOOOrpm离心10分钟 弃去液体，余下的固体即是粗制β -⑶，质量是3. 942g，产率为26. 28%。
权利要求
1.ー种不添加有机溶剂制备3 -环状糊精的方法，其特征是按以下步骤进行 1)取底物木薯淀粉在9(Tl00°C下糊化20分钟，将温度降至55°C； 2)加入5-6U/g底物的环状糊精葡萄糖基转移酶，加入CaCl2保证整个体系CaCl2的浓度是30mmol/L，用NaOH调pH至7. 5-8. 0，搅拌水解20 30分钟，搅拌至反应液不再粘稠为止； 3)将温度升至63 65°C搅拌反应15 17小时； 4)反应结束后将反应液于100°C灭酶活15 20分钟； 5)加入40U/ga -淀粉酶，用HCl调pH至6 6. 5，60°C下反应I 3小时； 6)水解完全后，温度升至100°C，加入2%(W/V)活性炭脱色2 4个小时过滤； 7)温度降至40°C,减压蒸懼至原体积的1/5后，降温至5°C,IOOOOrpm离心IOmin,下层固体即为￠-环糊精。
全文摘要
本发明是一种不添加有机溶剂制备β-环状糊精的方法。用重组大肠杆菌表达的环状糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)作用于淀粉底物生产β-CD，整个反应的体系液化和环化都是维持pH8.0，液化的时间为20分钟-30分钟，环化反应的时间为15-17个小时。反应体系中不涉及有机溶剂，对环境的污染很低，并且在个别要求较高领域可得到很好的利用。
文档编号C12P19/18GK102796785SQ201210333949
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者黄遵锡, 宋拓, 李俊俊, 唐湘华, 许波, 杨云娟, 周峻沛 申请人:云南师范大学