专利名称：一种米根霉脂肪酶的表面展示系统及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种米根霉脂肪酶的表面展示系统及其制备方法和应用。
背景技术：
生物柴油又称脂肪酸甲酯或乙酯，是以油料作物、野生油料作物和工程微藻类的水生油料植物，以及动物油脂、废弃餐饮油等为原料通过与甲醇或乙醇的转酯化反应制成的甲酯或乙酯燃料，通过转酯化反应，有效降低天然油脂的分子量和粘度。生物柴油的制备方法有物理法和生物法两种，物理法有直接混合法和微乳液法，化学法有高温裂解法和酯交换(或转酯化)法(Marchetti J M, Renewable and SustainableEnergy Reviews, 2007,11 :1300_1311)。酯交换法包括两种化学酯交换法和生物催化法，其中，化学酯交换法因其设备简单、生产成本低、得率高、反应时间短的优点，而广泛使用， 但使用化学法制备生物柴油亦有众多缺点，如对原料要求高，酸值高或含水率高的油脂原料难以酯交换；醇必须过量，后续工艺需增加醇回收装置；酯化产物难于回收；废液碱性强，对环境污染大等。与传统的化学催化相比，生物酶催化反应可以极大地简化工艺条件、提高产品质量、降低能源及原材料消耗。但是目前酶制剂的应用还远远落后于市场的需求，这是因为酶制剂工业普遍存在成本高、创新能力差、催化效率低等问题，极大地限制了酶技术的工业化应用，为了解决传统酶法的缺点，全细胞催化技术日渐兴起，特别是细胞表面展示技术以其独特的优势，异军突起。该方法省去了酶的提取纯化过程，从而减少酶纯化设备投资费用；反应后，催化剂与培养基易分离，可重复多次使用；固定于细胞表面的酶，酶学性质稳定，催化活性高，将不同种酶固定于同一细胞表面，可缩短催化时间，提高催化效率，为工业化应用提供坚实基础。三种生物柴油的制备方法比较如下表I所示。表格I化学转酯化法、传统酶法、表面展示型全细胞催化法优缺点对比
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展示酶(displaying enzyme)是指利用细胞表面展示技术(cell surface display),使酶蛋白与酵母细胞壁蛋白融合，以天然构象的形式锚定在细胞表面(Gai S A, Curr OpinStru Biol, 2007，17 (4): 467-473 ；Shibasaki S，Anal Sci, 2009，25 (I): 41-49 ；P印per L R, Comb Chem High Throughput Screen, 2008, 11(2): 127-134)。目前以细胞表面展示方法固定的脂肪酶，催化时间较长，甲酯化产物得率偏低，且应用最为广泛的N端锚定蛋白FLOlp(FS)，是以较弱的非共价键连接于细胞壁，从而使得展示蛋白易于脱落。Pir型蛋白，作为一种新型锚定蛋白，可根据外源蛋白的活性位点，通过N端融合、C端融合、随机插入的方式，与外源蛋白连接(Shimma Y, Glycoconi J 21:75_78);此外，pAOXl与pGAP是毕赤酵母表达的两种强启动子，前者可以甲醇为唯一碳源，严格调控外源蛋白的表达；后者作为一种组成型强启动子(Aterham HR, Gene. 1997，186: 37 44)，在发酵过程中不需要进行碳源转换，操作方便，在生物反应中的发酵周期比PAOXl表达系统所需的时间短，有利于降低生产成本(Zhang AL, J Ind Microbiol Biotechnol. 2007，34: 117 122)。因此，两种启动子哪种更适合于米根霉脂肪酶的高效表达，有必要进行详细探讨。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种米根霉脂肪酶的表面展示系统，以Pirlp为锚定蛋白，将米根霉脂肪酶通过C端游离，固定展示于毕赤酵母KM71H细胞壁表面，并实现高效表达。本发明的另一目的是提供上述米根霉脂肪酶的表·面展示系统的一种制备方法。本发明还有一目的是提供上述米根霉脂肪酶的表面展示系统的一种应用。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下
一种米根霉脂肪酶的表面展示系统，将米根霉脂肪酶ProROL基因连接于锚定蛋白Pirlp基因的C端，形成融合蛋白，以Pirlp的N端重复序列为锚定区域，将融合蛋白通过共价键方式固定于表达菌株表面，即为表面展不系统。所述的表达菌株为巴斯德毕赤酵母KM71H。一种构建米根霉脂肪酶的表面展示系统的方法，包括以下步骤
(1)将锚定蛋白基因mpirl克隆到表达载体中，得到以mpirl为锚定蛋白的表面展示表达载体；
(2)将米根霉脂肪酶基因克隆到步骤(I)的表面展示表达载体的mpirl下游，形成融合基因;
(3)将融合基因转化巴斯德毕赤酵母，筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。步骤(I)中，所述表达载体为带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体。优选为 pPICZ a A 或 pGAPZ a A0步骤(3)中，所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母ΚΜ71Η。上述的米根霉脂肪酶的表面展示系统在表达米根霉脂肪酶中的应用。本发明将米根霉脂肪酶ProROL基因连接于锚定蛋白Pirlp基因的C端，通过表达菌株ΚΜ71Η的正常分泌表达，以Pirlp的N端重复序列为锚定区域，将融合蛋白通过共价键方式固定于毕赤酵母ΚΜ71Η菌株表面，以制备脂肪酶表面展示型全细胞催化剂。本发明涉及包含不同启动子的载体选择，及锚定蛋白基因与米根霉脂肪酶基因融合后的表达。本发明选择了毕赤酵母表达系统中的两种强启动子醇氧化酶I启动子(pAOXl)和磷酸甘油酸脱氢酶启动子(pGAP)，以Pirlp的N端重复序列为锚定区域，将米根霉脂肪酶展示于酵母细胞壁表面。两种启动子表达的展示脂肪酶均可缩短发酵时间。其中，以PGAP为启动子的重组菌株表达展示脂肪酶活性最高，达614. 5 U/LC180. 74 [细胞干重])，pAOXl为表达启动子的菌株展示脂肪酶酶活较弱，为286. 16 U/L (69.44 [细胞干重])。有益效果与现有技术相比，本发明的运用基因融合方法，将米根霉脂肪酶基因与成熟锚定蛋白Pirlp的C端融合，并将基因mpirl插入含有不同启动子pAOXl、pGAP的载体中，获得重组质粒AOX-mPirl、GAP-mPirl，在毕赤酵母KM71H上实现表面展示，并得到高效表达。与pAOXl启动子相比，pGAP启动子不需进行碳源转换，操作简便，诱导过程中不需添加甲醇，减少了甲醇对菌体生长的毒副作用，且最高酶活为614. 5 U/LC180. 74 [细胞干重])，高于PAOXl为启动子的酵母菌株。具有很好的实用性，能产生很好的经济效益和社会效应。
图I是重组质粒GAP-mPirl-ProROL构建 图2是荧光显微镜验证融合蛋白Pirl-PiOROL在毕赤酵母细胞表面展示结果；图中，a.·KM71H/GAP-mPirl-ProR0L 的普通光学显微镜图；b. KM71H/GAP-mPirl-ProR0L 的荧光显微 图3是菌体酶活曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例所用到的试剂具体如下
10XYNB (IL):溶解134g YNB (含硫酸铵不含氨基酸)于IL ddH20中，在50°C以下溶解。BMGY(IL):溶解 IOg 酵母提取物、20g 蛋白胨于 700mL ddH20 中，121°C灭菌 20min，冷至室温，加入 IOOmL lmol/L 磷酸钾缓冲液(ρΗ6· 0)，IOOmL 10XYNB,2mL 500XB, IOOmL10XGY。BMMY(IL):溶解 IOg 酵母提取物、20g 蛋白胨于 700mL ddH20 中，121°C灭菌 20min，冷至室温，加入 IOOmL I mol/L 磷酸钾缓冲液(pH6.0)，IOOmL 10XYNB,2mL 500XB, IOOmL10XM。25%聚乙烯醇橄榄油乳化液(1L):称取3g聚乙烯醇，加蒸馏水50mL，加热搅拌溶解成2%溶液。向其中加入50mL橄榄油，用高速组织捣碎机搅动3 4次，每次10s。 橄榄油-MMH-RB平板(1L):橄榄油乳化液800mL，加入15g琼脂，121 °C灭菌20min，冷至 6(TC时，加入 IOOmL 10XYNB，2mL 500XB, IOOmL 10XM, IOOmL 10XRB, IOmL100 X H，混匀后倒平板。实施例I 5 cererisiae ΕΒΥ100基因组的提取和PCR扩增获得成熟的锚定蛋白基因mpirl ；
I)酿酒酵母EBY100 (5 cerevisiae EBY100)的培养在YPD平板上活化菌株，挑取单菌落于YPD摇瓶中，30°C过夜培养。40C，6000rmp离心IOmin收集菌株，加10%甘油，保存菌株于 _80°C冰箱。S. cerevisiae EBY100 购自 Invitrogen。2)酿酒酵母EBY100基因组DNA的提取，步骤从活化后的酿酒酵母EBY100平板上挑取单菌落，接种于YI3D培养基中，30 1过夜培养；取对数生长期细胞，6000rpm离心5min，菌体用无菌蒸馏水洗一次，去上清；加入5mL DNA破壁缓冲液(lOOmmol/L Tris-HCl,pH8. O, IOmmoI/L EDTA, 1%SDS)，混匀，65°C保温 Ih ; IOOOOrpm离心 15min，取上清；加酚氯仿异戍醇(25:24:1)抽提2次,每次5000rpm离心7min ;取上层抽提液,加6 μ L RNaseAC IOmg/mL)，用3倍乙醇沉淀过夜(加O. 3mol/L醋酸钠，ρΗ5· 2)，12000rpm离心30min ；75%乙醇洗2次，风干；加50 μ L ddH20溶解。3)PCR扩增成熟的 锚定蛋白基因mpirl :按照已知的酿酒酵母Pirlp蛋白的基因序列(GeneBank序列号为D13740)设计引物Y1，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。具体引物序列及添加酶切位点如下所示
Yl N 端引物序列5’ -CTAGCGAATTCATGGCCGCTGCTATCTCTCAAATTGG-3’，前面添加EcoR I酶切位点；
Yl C 端引物序列5’ -TATATGGTACCATACATATGTTAACAGTTGAGCAAATCGAT-3’，前面添加Kpn I ,Nde I酶切位点。以提取的酿酒酵母EBY100基因组DNA为模板，用合成的引物Yl进行PCR扩增，PCR反应体系IyL酿酒酵母EBY100基因组DNA，ly L Yl N端引物，I μ LYl C端引物，25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超纯水。扩增条件为变性940C，5min ;变性 94°C，30s ;退火 58°C，30s ;延伸 72°C，Imin ;重复循环30次；延伸72°C，IOmin ;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到成熟的Pirl型锚定蛋白基因mpirl。实施例2表面展示重组质粒构建；
(I) AOX-mPirl、GAP-mPirl 重组载体的构建
将 mPirl (实施例 I 制备)与 pPICZ a A (Invitrogen)、pGAPZ a A (Invitrogen)用EcoR I , Kpn I酶切并用试剂盒纯化回收，用T4 DNA连接酶连接，得到重组巴斯德毕赤酵母表面展示表达质粒GAP-mPirI、AOX-mPirl。将得到的GAP-mPirI、AOX-mPirl质粒转化大肠杆菌宿主T0P10F (Novagen)。用含50yg/ml zeocin LLB平板筛选转化子,挑取zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒，通过EcoR I和Kpn I双酶切鉴定并测序，结果表明壁蛋白mPirlp基因序列正确插入。(2) AOX-mPirl-ProROL、GAPiPirI-ProROL 载体的构建
克隆带有flag标签蛋白的米根霉脂肪酶基因prorol,与GAP-mPirI、AOX-mPirl融合根据米根霉脂肪酶基因序列(GeneBank序列号为AF229435)设计引物Y2，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。具体序列如下
Y2 N 端引物序列5’ -CCCCATATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGTTCCTGTTTCTGGTAAATC-3’，前面添加Nde I酶切位点，及flag标签蛋白(DYKDDDDK)基因序列(下划线部分)；
Y2 C 端引物序列5’ -TGCTCTAGATTACAAACAGCTTCCTTCGT-3’，前面添加 Xba I 酶切位点。以米跟霉基因组为模版，用合成的引物Y2进行PCR扩增，PCR反应体系I μ L米跟霉基因组DNA，lyL Y2 N端引物，IyL Y2 C端引物，25 μ L Premix ExTaq，22 μ L超纯水。扩增条件为变性94°C，2min ;变性94°C，30s ;退火52°C，lmin ;延伸72°C，lmin ;重复循环30次；延伸72°C，IOmin ;反应停止，4°C保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化，得到带有flag标签蛋白基因的米根霉脂肪酶ProROL基因。将带有flag标签蛋白基因的米根霉脂肪酶ProROL基因与GAP-mPirl、AOXiPirI用Nde I、Xba I酶切并纯化回收。用T4 DNA连接酶连接，构建表面展示重组质粒AOX-mP i r I -Pr oROL, GAP-mP i r I -ProROL 用含 50yg/mL zeocin LLB 平板筛选转化子，挑取zeocin抗性阳性的转化子，提取质粒，通过Nde I和Xba I双酶切鉴定并测序，结果表明带有flag标签蛋白的米根霉脂肪酶ProROL基因序列正确插入，构建的质粒图见图I。实施例3重组质粒在毕赤酵母中表达和鉴定；
采用限制性内切酶sac I对AOX-mPirI-ProROL质粒进行线性化，用AvrII对GAP-mPirl-ProROL质粒进行线性化。电转化巴斯德毕赤酵母KM71H (Invitrogen),在含100 μ g/mL zeocin的YPD平板上生长72h，挑取抗性阳性转化子，即整合有融合基因序列的转化子(KM71H/A0X-mPirl-ProR0L、KM71 Η/GAP-mP i r I -Pr oROL ),点至含 500 μ g/mL zeocin的高抗YPD平板，挑选较大菌株，即含有较多拷贝子的转化子，点至橄榄油-MMH-RB平板，形 成明显荧光圈，表明ProROL在巴斯德毕赤酵母中表达，并且表现出脂肪酶水解活性。将阳性转化子KM71H/A0X-mPirl-ProR0L、KM71H/GAP-mPirl-ProR0L 接种于 50mLBMGY培养基中，30°C，200rpm振荡培养16_20h至OD6tltl到2飞。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD6tltl为I，继续振荡培养，每个24h向BMMY培养基中补加O. 5%的甲醇进行诱导表达。发酵72h后，用anti-FLAG抗体进行免疫反应后，采用荧光显微镜对KM71 Η/GAP-mP i r I -ProROL, KM71H/A0X-mPirl-ProR0L 和对照菌株 KM71H 进行分析比较(图
2)，结果显示，KM71H/GAP-mPirl-ProR0L、KM71H/A0X-mPirl-ProR0L 的细胞表面可以发出明显的荧光，而对照菌KM171H的细胞表面几乎没有荧光。表明KM71H/GAP-mPirl-ProR0L、KM71H/A0X-mPirl-ProR0L的细胞表面成功地展示了 mPirl-ProROL的融合蛋白。实施例4 阳性转化子 KM71H/GAP-mPirl-ProR0L、KM71H/A0X-mPirl-ProR0L 的发酵及脂肪酶活性的测定；
将阳性转化子 KM71H/A0X-mPirl-ProR0L、KM71H/GAP-mPirl-ProR0L(实施例 3 制备)接种于50mL BMGY培养基中，30°C，200rpm振荡培养16 20h至OD6tltl到2 6。离心收集菌体，再将其悬浮于BMMY培养基中，稀释至OD6c 为I，继续振荡培养，每个24h向BMMY培养基中补加O. 5%的甲醇进行诱导表达。每24h取样，用脂肪酶测试盒(南京建成生物工程研究所)测定脂肪酶活性。酶活力单位定义为37°C条件下，每升酶液与底物反应lmin，每消耗lymol底物为一个酶活力单位。脂肪酶活性测定的结果(图3)显示，KM71H/GAP-mPirl-ProR0L菌体酶活略高于KM71H/A0X-mPirl-ProR0L，48h 最高，可达 614. 5U/L (180.74 [细胞干重])，且 KM71H/GAP-mPirl-ProROL菌体酶活高于KM71H/A0X-mPirl-ProR0L，而对照菌KM71H的菌体则几乎没有酶活。说明ProROL以活性形式成功地展示在巴斯德毕赤酵母细胞表面。本发明运用免疫突光技术，通过一抗(Anti-FLAG tag Rabbit PolyclonalAntibody)与米根霉脂肪酶基因N端的flag标签蛋白结合，二抗(FITC conjugatedMouse anti-rabit IgG (H+L))与一抗的特异性结合,通过突光显微镜,可观察出毕赤酵母细胞表面附着有清晰的黄绿色荧光，证明以Pirlp为锚定蛋白的毕赤酵母表面展示体系构建成功。荧光显微镜下的图片如图2.所示。同时，通过在毕赤酵母中的诱导表达，AOX-mPirl-ProROL的表达菌株，酶活最高可达286. 16 U/L (95.39 U/g [细胞干重])、GAP-mPirl-ProROL的表达菌株，酶活最高可达614. 5 U/LC180. 74 [细胞干重])，该酶活与目前Takeshi Matsumoto等人报道的以FLOlp为锚定蛋白，展示米根霉脂肪酶的最高酶活145 U/L (61.3 U/g细胞干重)相比，提高了两倍。从结果可以看出(I)以Pirlp的N端为锚定蛋白，构建的毕赤酵母表面展示系统，可成功悬挂及高效表达米根霉脂肪酶。(2)与pAOXl启动子相比，pGAP启动子不需进行碳源转换，操作简便，诱导过程中不需添加甲醇， 减少了甲醇对菌体生长的毒副作用，且最高酶活要高于pAOXl为启动子的菌株。
权利要求
1.一种米根霉脂肪酶的表面展示系统，其特征在于将米根霉脂肪酶Pr0ROL基因连接于锚定蛋白Pirlp基因的C端，形成融合蛋白，以Pirlp的N端重复序列为锚定区域，将融合蛋白通过共价键方式固定于表达菌株表面，即为表面展示系统。
2.根据权利要求I所述的米根霉脂肪酶的表面展示系统，其特征在于所述的表达菌株为巴斯德毕赤酵母KM71H。
3.一种构建权利要求I所述的米根霉脂肪酶的表面展示系统的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)将锚定蛋白基因mpirl克隆到表达载体中，得到以mpirl为锚定蛋白的表面展示表达载体； (2)将米根霉脂肪酶基因克隆到步骤(I)的表面展示表达载体的mpirl下游，形成融合基因; (3)将融合基因转化巴斯德毕赤酵母，筛选阳性转化子，即得到表面展示系统。
4.根据权利要求3所述的构建表面展示米根霉脂肪酶重组酵母的方法，其特征在于所述表达载体为带有分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体。
5.根据权利要求3或4所述的构建表面展示米根霉脂肪酶重组酵母的方法，其特征在于所述表达载体为pPICZ a A或pGAPZ a A0
6.根据权利要求3所述的构建表面展示米根霉脂肪酶重组酵母的方法，其特征在于所述巴斯德毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母ΚΜ71Η。
7.权利要求I所述的米根霉脂肪酶的表面展示系统在表达米根霉脂肪酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种米根霉脂肪酶的表面展示系统及其制备方法和应用。表面展示系统将米根霉脂肪酶ProROL基因连接于锚定蛋白Pir1p基因的C端，通过表达菌株KM71H的正常分泌表达，以Pir1p的N端重复序列为锚定区域，将融合蛋白通过共价键方式固定于毕赤酵母KM71H菌株表面。本发明运用基因融合方法，将米根霉脂肪酶基因与成熟锚定蛋白Pir1p的C端融合，并将基因mpir1插入含有不同启动子pAOX1、pGAP的载体中，获得重组质粒AOX-mPir1、GAP-mPir1，在毕赤酵母KM71H上实现表面展示，并得到高效表达。与pAOX1启动子相比，pGAP启动子不需进行碳源转换，操作简便，诱导过程中不需添加甲醇，减少了甲醇对菌体生长的毒副作用，且最高酶活为614.5U/L(180.74[细胞干重])，高于pAOX1为启动子的酵母菌株。具有很好的实用性，能产生很好的经济效益和社会效应。
文档编号C12N9/20GK102876594SQ20121033381
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者王飞, 王烨, 李迅 申请人:南京林业大学