专利名称：重组鲫鱼mbsp表达菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及重组微生物技术领域，尤其一种重组鲫鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)表达菌株及其构建方法。
背景技术：
鱼类中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)是一种弱碱性蛋白酶，普遍存在于鱼类的肌肉中，该酶对肌原纤维中肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)降解的最适温度在55°C左右，在同样条件下α -辅肌动蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白也被不同程度降解。通过对不同种类鱼的MBSP的酶学性质研究发现，MBSP是一种类胰蛋白酶类的蛋白酶，它可以特异地识别精氨酸或赖氨酸残基的羧基末端而对蛋白质进行降解，而其热稳定性优于胰蛋白酶，该酶最适温度为55°C，在25 60°C下加热30 min后，其酶活仍保留在80%以上。目前，在蛋白质的质谱鉴定中，常用胰蛋白酶将蛋白质降解为小肽后进行质谱分析，获·得该蛋白质的肽指纹图谱。由于MBSP与胰蛋白酶具有类似的酶切位点，且其热稳定性优于胰蛋白酶，因此，MBSP有望开发为蛋白质质谱鉴定中的工具酶，具有很好的应用前景和商业价值。肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)最早是在1997年由Osatomi等人从淡水鲤鱼ifyprinus carpi ο)肌肉中纯化得到的；2000年，Cao等在海水鱼狗母鱼肌肉中也分离得到了 MBSP ;同年Sangorrin等在老鼠骨骼肌中也发现了一种类似的肌原纤维蛋白结合的丝氨酸蛋白酶；随后，Cao等分别在白鲢鱼与鲫鱼的肌肉中也发现了 MBSP，并对其酶学性质进行了系统研究，充分证明了 MBSP与胰蛋白酶具有类似的功能，从而为MBSP的应用开发提供了理论依据；2009年,Guo等获得了鲫鱼(Parsssius auratus) MBSP的cDNA序列,这为鲫鱼MBSP的外源表达提供了有用的信息鲫鱼MBSP含有一个729碱基对的开放阅读框，它编码带有20个氨基酸信号肽的含242个氨基酸的蛋白质，其成熟蛋白的核苷酸序列为669bp，编码222个氨基酸。现有MBSP通常都是从肌肉中纯化得来的，而天然MBSP在肌肉中含量很低，纯化工艺复杂，生产成本很高，无法得以较为广泛地应用。为此，有必要利用基因工程技术高效表达MBSP,从而降低生产成本、有利于大规模生产。因此，本领域迫切需要提供一种表达量高、构建工艺简单、生产成本较低的表达菌株用于表达具有生物学活性的重组鲫鱼MBSP。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种重组鲫鱼MBSP表达菌株及其构建方法，具有表达量高、构建工艺简单、生产成本较低的特点。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的
一种重组鲫鱼MBSP表达菌株，所述表达菌株以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP ;且该重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建。
一种上述重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建方法，包括如下步骤根据编码鲫鱼MBSP的cDNA序列设计合成一对特异性引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，以鲫鱼肌肉细胞中的总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增鲫鱼MBSP基因片段，将PCR产物和载体pPIC9K分别用限制性内切酶I和I进行双酶切后，用DNA连接酶连接，将鲫鱼MBSP基因片段定向插入到PPIC9K载体的限制性内切酶说oR I和Afoi I之间，获得的连接产物即为重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP，接着将重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP用Sal I内切酶线性化后，转化巴斯德毕赤酵母GS115的感受态细胞，用含G418的YPD抗性平板筛选高拷贝的阳性转化子，获得重组鲫鱼MBSP表达菌株。进一步地，利用甲醇诱导所构建的重组鲫鱼MBSP表达菌株。本发明的有益效果在于构建获得的重组鲫鱼MBSP表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP可进行高效分泌表达鲫鱼MBSP，既具有原核系统的简单，又具有真核系统的表达后修饰(如糖基化等)，生产工艺简单，产品纯度高、活性高；另外，利用发酵罐进行工业化生产后，可大量获得目的产物，为重组鲫鱼MBSP的特性研究及将其作为蛋白质质谱鉴定的工具酶的研制奠定基础。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。图I为本发明中重组表达质粒PPIC9K-MBSP的构建示意图。图2为本发明中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测图。图3为本发明中重组表达质粒PPIC9K-MBSP酶切鉴定的琼脂糖电泳检测图。图4为本发明中重组鲫鱼MBSP表达菌株菌落PCR鉴定的琼脂糖电泳检测图。图5为本发明中重组鲫鱼MBSP表达菌株用甲醇诱导后培养基上清的SDS-PAGE检测图(15%的分离胶，用靠马斯亮蓝染色)。图6为本发明中重组鲫鱼MBSP的最适温度和温度稳定性测定结果曲线图。图7为本发明中重组鲫鱼MBSP的最适pH和pH稳定性测定结果曲线图。
具体实施例方式一、重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建 (I)鲫鱼MBSP基因片段(MBSP)的获取
依照GenBank上登录的鲫鱼MBSP的cDNA序列(登陆号DQ872434)设计PCR引物，用来扩增成熟鲫鱼MBSP基因片段(去掉其自身的信号肽)。引物序列为
Pl :5’ -TAGAATTCATCATTGGTGGTTAGGAGTGTAGG-3> (SEQ ID NO. 2)；
P2 :5’ -TAGCGGCCGCTTAGTTACTAGCTAATGGTGG-3，(SEQ ID NO. 3)；
其中Pl中的下划线部分为&oR I酶切位点，且P2中的下划线部分为Afoi I酶切位占.
以鲫鱼肌肉细胞的总RNA为模板，用以上两条引物，采用RT-PCR方法扩增目的基因卿成熟鲫鱼MBSP基因片段)；
反转录体系(20 μυ:总 RNA 5 μ , Oligo (dT) I μ ,M-MLV 5XReaction Buffer 4 μ ,dNTP Mixture (10 mol/L) 2 μ , M-MuLV RT (100 U/μ I μ , RNase Inhibitor (40 U/μι) O. 5 μ , DEPC H2O 6. 5 μ (均购自纽英伦生物技术北京分公司)；
反转录反应条件为42°C温育30 min ；
PCR 反应体系(50 PL):以上反转录产物(cDNA) 2. O μ , Pl (10 pmol/uL) 2. O μ ,Ρ2 (10 pmol/uL) 2. O M-L, dNTP Mixture (10 mol/L) 4. 0 M-L, IOXEx Taq buffer 5. 0 M-L,Ex Taq酶(λ 25 μ ，无菌水34. 75 μ (均购自TaKaRa大连分公司)；
扩增条件94°C预变性5 min ;然后94°C变性30 s，50°C退火30 s，72°C延伸60 S，共循环30次；再于72°C延伸7 min。将PCR产物于I. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，结果显示扩增片段约700 bp左右(如图2所示，该图中泳道M为DL2000 DNA Marker ;泳道I为PCR产物)，即PCR产物位于500 bp与750 bp之间，符合成熟鲫鱼MBSP基因片段669 bp的大小。
(2)重组酵母表达载体pPIC9K-iffiS°的构建与鉴定
将(I)中的PCR产物和载体PPIC9K分别用I和I进行双酶切后，使用DNA连接试剂盒(TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2. O)进行连接，为了方便描述将获得的连接产物命名为重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP。将上述重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP采用热激法转入大肠杆菌DH5a (购自TaKaRa 大连公司；具体基因型F_ endAl glnV44 thi-1 recAl relAl gyrA96 deoR nupGΦ80(11βοΖΔΜ15 Δ (lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK_，λ -);其特点一种常用于质粒克隆的菌株，其recAl和endAl的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取)感受态细胞中，具体操作过程为将10 PL重组酵母表达载体pPIC9K-MBSP与200 μ 的DH5a感受态细胞在冰浴中混合后，于42°C下热激90 s后立即放入冰浴中，然后将热激后的混合物涂布于含100 Pg/mL氨苄青霉素的LB平板上，培养过夜，采用菌落PCR筛选阳性单菌落，挑取该阳性单菌落接种于含100 gg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，培养过夜后，进行质粒提取以获得重组表达质粒PPIC9K-MBSP，并对该重组表达质粒pPIC9K-MBSP进行酶切鉴定的琼脂糖电泳检测(如图3所示,该图中泳道Ml为λ-Hind III digest DNA Marker ;泳道
I为重组表达质粒pPIC9K-MBSP ;泳道2为重组表达质粒pPIC9K_MBSP用EcoR I和Not I双酶切；泳道M2为DL2000 DNA Marker),结果显示重组表达质粒pPIC9K_#汉Sd用&oR I和I双酶切后，可得到669 bp左右的鲫鱼MBSP基因片段和9. 3 kb左右的载体pPIC9K的线性片段，说明鲫鱼MBSP基因已按预期插入到酵母载体PPIC9K上；并对所得到的鲫鱼MBSP基因片段的核苷酸序列、及该鲫鱼MBSP基因片段所编码的蛋白质即目的蛋白的氨基酸序列分别进行测序(委托Invitrogen上海分公司)，测序结果鲫鱼MBSP基因片段的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO. 1，目的蛋白的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO. 4，从而证实鲫鱼MBSP基因片段的核苷酸序列及目的蛋白的氨基酸序列的阅读框架完全正确。证明上述重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP是正确的。(3)重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建和鉴定
将巴斯德毕赤酵母GSl 15的感受态细胞与用I内切酶线性化后的重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP相混合，之后转移至已预冷的0.2 cm电击杯中，置冰上5 min, I. 8 kV、25PF、400 Ω电击，并立即加入I mL已预冷的I mol/L山梨醇，取200 PL涂布于MD平板上，在28-30 °C培养箱中培养至菌落出现；用无菌水洗下MD平板上的菌落，适当稀释后各取200 μ L 分别涂布于含有浓度为 O g/L、0. 5 g/L、2. O g/L、3. O g/L 和 4. 0 g/LG418 的 YPD抗性平板，并将各YPD抗性平板置于28-30 °C下培养3 d，培养结束后挑选高浓度G418的抗性菌株至YB)液体培养基中培养，并进行菌落PCR验证，所用引物为(I)中的Pl和P2，并将PCR产物置于I. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测(如图4所示，该图中泳道M为DL2000DNA Marker ;泳道1、2均为菌落PCR验证中的PCR产物)，扩增片段约669 bp左右，即结果显示以抗性菌株的阳性单菌落为模板的PCR产物片段与目的基因片段大小相同，均为669bp左右，从而证明重组鲫鱼MBSP表达菌株构建成功，且将该表达菌株命名为重组鲫鱼MBSP表达菌株 GS115/pPIC9K-MBSP。由上可知，本发明重组鲫鱼MBSP表达菌株是以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP ;且该重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建。二、重组鲫鱼MBSP在巴斯德毕赤酵母GS115中的分泌表达 将以上构建成功的重组鲫鱼MBSP表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP接种到50 mL BMGY培养基中，并于28 30°C下震荡培养约22 h直至0D_达到2 6时，室温离心，收集菌体重悬于50 mL BMMY培养基中，于28 30 °C >250 r/min摇床培养，并诱导目的蛋白表达；且每24 h往所述BMMY培养基中加100%甲醇至终质量分数为I %以维持诱导目的蛋白表达，共诱导96 h ;然后将诱导结束后的菌体在4°C下、8000 r/min离心10 min，收集培养液上清并对该上清作SDS-PAGE检测，检测结果如图5所示(该图中BI为目的蛋白；泳道M为蛋白分子量标准，单位为kDa ;泳道I 5分别为重组鲫鱼MBSP表达菌株GS115/pPIC9K_MBSP用甲醇诱导O h、24 h、48 h、72 h、96 h后离心所取的上清)，结果表明随着诱导时间的延长，目的蛋白的表达量逐渐增加，当诱导时间为48 h后，目的蛋白的表达量达到最高，且目的蛋白以可溶形式存在于上清液中，且目的蛋白在培养液上清中的含量可达80%以上。因此，利用甲醇诱导的重组鲫鱼MBSP表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP，能够克服了在大肠杆菌中重组鲫鱼MBSP以包涵体形式表达而无生物学活性的缺陷；同时，获得的目的蛋白可用于重组鲫鱼MBSP的特性研究及将其作为蛋白质质谱鉴定的工具酶的研制。在本发明中，BMGY培养基的组分为酵母膏I %，胰蛋白胨2 %，酵母氮源I. 34 %，生物素O. 00004 %，甘油I %，磷酸钾缓冲液100 mmol/L,pH 6. O ;LB平板的组分为酵母粉0.5 %，胰蛋白胨I %，NaCl 1%，琼脂2%;YPD抗性平板的组分为酵母粉I %，胰蛋白胨2 %，葡萄糖2%，琼脂2% ；YPD液体培养基的组分为酵母粉I %，胰蛋白胨2 %，葡萄糖2% ；MD平板的组分为酵母氮源I. 34 %，生物素O. 00004 %，葡萄糖2%，琼脂2% ；BMMY培养基的组分为酵母粉I %，胰蛋白胨2 %，酵母氮源I. 34 %，生物素O. 00004 %，甲醇O. 5% (体积百分比)，磷酸钾缓冲液100 mmol/L,pH 6. O ;且各培养基或平板中的百分比除却有特别注明的，其它均为质量百分比。三、重组鲫鱼MBSP酶学性质分析
将上述分泌表达过程中重组鲫鱼MBSP表达菌株GS115/pPIC9K-MBSP用甲醇诱导后离心所得的培养基上清进行硫酸铵分级沉淀，并收集硫酸铵饱和度为35°/Γ65%的沉淀，将收集到的沉淀采用50mM的Tris-HCl(pH8. O)缓冲液溶解后，进行透析即可得到重组鲫鱼MBSP酶液，用来进行酶学性质分析。I)最适反应底物的确定
在不同的荧光底物50uL中分别加入得到的重组鲫MBSP酶液lOuL、及940uL 50mM的Tris-HCl (pH8. O)缓冲液(各荧光底物的浓度均为IOuM ;且荧光底物分别为BEKKM，EVLKM，BLKRM, BFSRM, BLRRM, BQRRM, BVPRM, SAAPFM, ZFRM, ZRRM),于 55°C条件下反应 IOmin 后加终止液(甲醇异丙醇水=35:30:35)终止反应，接着采用荧光分光光度计测定其酶活，将相对酶活力最高的定为100%，其结果见表I。结果显示，重组鲫鱼MBSP的最合适反应底物为BEKKM，其次为EVLKM。由此可见本发明所得到的重组鲫鱼MBSP可以特异地识别赖氨酸残基的羧基末端而对蛋白质进行降解，属于丝氨酸蛋白酶类。表I :重组鲫鱼MBSP的最合适反应底物的确定__
权利要求
1.一种重组鲫鱼MBSP表达菌株，其特征在于所述表达菌株以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体PPIC9K- MBSP ;且该重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建。
2.一种如权利要求I所述重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建方法，其特征在于包括如下步骤根据编码鲫鱼MBSP的cDNA序列设计合成一对特异性引物SEQ ID NO. 2和SEQ IDNO. 3，以鲫鱼肌肉细胞中的总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增鲫鱼MBSP基因片段，将PCR产物和载体PPIC9K分别用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切后，用DNA连接酶连接，将鲫鱼MBSP基因片段定向插入到pPIC9K载体的限制性内切酶EcoR I和Not I之间，获得的连接产物即为重组酵母表达载体pPIC9K- MBSP，接着将重组酵母表达载体pPIC9K-MBSP用Sal I内切酶线性化后，转化巴斯德毕赤酵母GS115的感受态细胞，用含G418的YPD抗性平板筛选高拷贝的阳性转化子，获得重组鲫鱼MBSP表达菌株。
3.如权利要求2所述的一种重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建方法，其特征在于利用甲醇诱导所构建的重组鲫鱼MBSP表达菌株。
全文摘要
本发明提供一种重组鲫鱼MBSP表达菌株，所述表达菌株以巴斯德毕赤酵母GS115为宿主菌，并含有重组酵母表达载体pPIC9K-MBSP；且该重组酵母表达载体pPIC9K-MBSP通过将鲫鱼MBSP基因插入酵母表达载体pPIC9K中构建；并提供了该重组鲫鱼MBSP表达菌株的构建方法。本发明所构建的表达菌株可分泌表达重组鲫鱼MBSP，且具有表达量高、构建工艺简单、生产成本较低的优点。
文档编号C12N1/19GK102827784SQ201210333208
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者杜翠红, 曹敏杰, 韩龙 申请人:集美大学