专利名称：Ercc1基因表达荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及ー种检测ERCCl基因表达荧光定量PCR试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液中ERCCl表达水平mRNA的定量检测。
背景技术：
ERCCl 基因即切除修复交叉互补基因 I (excision repair cross complementingI)于1984年由Westerveld将人基因组DNA导入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的紫外线敏感突变株(43-313)后克隆时发现,在核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)过程 中起关键作用，是NER途径中的前导基因。NER是机体修复DNA共价损伤(紫外线导致的ニ聚体，多环芳烃，钼类-DNA加合物等)的重要途径。核苷酸切除修复(nucleotide excisionrepair, NER)是哺乳动物细胞DNA修复的主要途径；是保护宿主免受肿瘤侵害的必要因素；是清除大規模钼类化合物所致DNA螺旋扭曲的唯一机制。因此，研究ERCCl基因的表达对选择合适的化疗药物及评估预后有重要的影响及临床意义。ERCCl基因概述ERCCl基因定位于人类染色体19ql3. 2，与RADIO、uvrA、uvrC具有同源性，大小为15kb，有10个外显子。ERCCl共有4种分子量的mRNA，但只有I. IkbmRNA编码的297个氨基酸的蛋白质，才具有核苷酸切除修复功能。其表达的蛋白质与XPF (ERCC4)形成异ニ聚体，在NER初期发挥DNA损伤识别功能，后期表现5'核酸内切酶活性，共同行使损害部位5'端切除的功能，在NER中起到限速或调节的重要作用，其活性的高低可反映整个NER修复活性的水平，在ー些肿瘤细胞中，ERCC1、XPB、XPD等核苷酸切除修复因子mRNA表达显著降低，提示核苷酸剪切修复能力的降低，导致细胞发生癌变的几率増加。ERCCl被认为是NER修复途径中前导基因，在小鼠模型中其功能与年龄的老化、大脑的正常发育和免疫球蛋白的正常转化有夫。在人类肿瘤细胞中，顺钼引起的DNA损伤主要由核苷酸切除修复(NER)系统修复，ERCCl则在NER途径中起着DNA损伤识别和链间切割的关键作用，ERCCl过表达可使停滞在G2/M期的损伤DNA迅速修复，导致其对顺钼耐药。用反义技术抑制ERCCl表达可减少DDP-DNA加合物的修复，因此，ERCCl可作为肿瘤细胞中DDP-DNA加合物修复能力的检测
οERCCl基因表达的调节及检测研究ERCCl基因的意义一方面是评估发病风险，一方面是预测以钼类为主化疗方案的疗效和生存期长短，使我们有可能根据遗传状况来为肿瘤患者的个体化治疗提供ー些帮助。更重要的实际意义是通过调节其表达试图解决钼类耐药问题，从而提高化疗疗效，延长生存期。Ras可激活一系列编码參与DNA修复和药物解毒的酶和蛋白的基因，这些蛋白包括c-fos和c-jun基因产物AP-I及ー些NER蛋白，而AP-I通过其顺式调节元素的特定靶点直接调节ERCCl基因的表达，这在一定程度上掲示了 ERCCl基因表达的分子机制。目前调节ERCCl基因表达的方法有反义基因治疗将与ERCClmRNA互补的反义寡核苷酸或反义RNA转染顺钼耐药细胞株，封闭或降低ERCCl的功能来増加细胞对顺钼的化疗敏感性。RNA干扰(RNAi):将与ERCClmRNA序列相对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA导入细胞，可使ERCClmRNA降解和基因沉默，这种转录后基因沉默机制被称为RNAi。辅助应用能降低NER修复能力的药物环胞菌素A和除莠菌素A通过分别抑制C-fos和C-jun基因的表达，能阻断DDP诱导的ERCClmRNA水平的升高，对DDP有协同增效作用。蛋白酶体抑制物(Lactacysin)通过抑制ERCCl基因的转录来影响其表达。联合应用抑制NER修复的化疗药物有关文献报道，吉西他滨、紫杉醇能通过下调ERCCl的表达抑制DNA修复过程。对ERCCl基因的表达进行客观、准确、敏感的检测是研究其特性的首要条件。目前
检测方法包括mRNA水平的RT-PCR和蛋白水平的免疫组化、流式细胞学、酶联免疫吸附等。Reed认为ERCCl真正起修复作用的是有活性的蛋白，且需形成复合物后与其他NER蛋白一起共同发挥功能，故很可能ERCCl蛋白不易迅速而完全的与相应抗体結合，而各种实验应用的方法和測定的水平不一，所以在測量上很难真实地把它的表达水平表现出来。ERCCl基因表达对药物疗效的影响研究发现ERCCl的表达情况和基因多态性在恶性肿瘤发生发展中起到一定作用，更重要的是发现它与钼剂及吉西他滨等多药耐药性相关。顺钼的细胞毒性主要在干与DNA特定碱基结合形成共价的顺钼-DNA加合物，导致DNA致命的损伤。顺钼-DNA加合物主要靠核苷酸切除修复(NER)系统来修复，ERCCl基因作为NER系统关键的修复基因，在钼类耐药过程中发挥重要作用。研究发现ERCCl的表达情况与恶性肿瘤的发病以及含钼方案的疗效相关。结合对ERCCl基因表达方面的多年研究及第12届世界肺癌大会的相关内容总结如下I、目前针对非小细胞肺癌最有效的药物公认为钼类和90年代以后的三代新药。核苷酸切除修复是最重要的DNA修复途径，而其中切除修复交叉互补基因I(ERCCl)參与钼类药物造成DNA损伤修复已熟为人知，DNA修复能力的改变和耐药直接相关，一些基础研究已显示肿瘤ERCCl的表达水平与钼类药物对非小细胞肺癌的疗效密切相关。而诱导ERCCl基因水平的下调将增加肿瘤对钼的敏感性，反之则可产生对钼类的耐药。2、较早时Lord在56例接受吉西他滨/顺钼治疗的晚期非小细胞肺癌中根据化疗前检测ERCCl mRNA表达水平发现其低表达者生存期明显长于高表达者，分别为62周和20周(P=O. 005)。结果提示ERCC1的表达水平与钼类药物疗效呈负相关，即表达越高，钼类疗效越差。近年Olaussen发表在《新英格兰医学杂志》上的研究可能更能说明问题，该研究收集了国际肺癌辅助治疗协作组(IALT) III期随机临床试验中的761例术后标本，通过免疫组化法测ERCCl表达，显示未行术后辅助化疗、ERCCl高表达者生存期长于低表达者(P=O. 009);而术后行含钼方案辅助化疗者收益率与ERCCl存在负相关(P=O. 009)，且ERCCl阴性者比ERCCl阳性者生存期更长。研究指出=ERCCl可以作为非小细胞肺癌含钼方案化疗疗效及预后的一个预测指标。3、近来Cobo发表的大样本试验也证实了根据基因表达情况选择用药，也是第一个包括了 444例IV期非小细胞肺癌的III期随机对照试验，按I :2随机入组。对照组用多西他赛和顺钼的方案；试验组根据ERCCl mRNA表达进行用药。低表达者用多西他赛和顺钼方案，而高表达者用多西他赛和吉西他滨方案。结果显示对照组客观有效率为39. 3%，试验组为51. 2%(P=O. 02)，疗效比较有统计学差异。应该重视根据ERCCl基因表达情况来决定非小细胞肺癌是否行辅助化疗和是否选择含钼类药物作为化疗方案。上述研究显示肿瘤患者中ERCCl的表达水平与肿瘤细胞对顺钼耐药的相关性已经明确，ERCCl表达水平高低是否可以成为筛选接受化疗的患者的一项指标，从而可以预测不同人群对顺钼的敏感程度以指导临床用药，提高药物治疗的有效率，同时减少不必要的药物毒副作用和经济支出，更好地实现对患者的个体化治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种能快速、高敏感度的检测各种组织、细胞、血液中ERCCl基因表达荧光定量PCR检测试剂盒。本发明所述的试剂盒即是针对ERCCl基因表达水平mRNA定量检测而设计的，即针对编码具有核苷酸切除修复功能的297个氨基酸的基因组而设计。
本发明采用人工合成技术合成覆盖ERCCl基因mRNA的寡核苷酸序列探针，结合荧光定量PCR技术，研制ー种快速、高度灵敏的检测ERCCl基因表达荧光定量PCR试剂盒。本发明所述的试剂盒包括逆转录PCR通用引物、荧光定量反应液预混液(PCR Master Mix)、荧光定量反应液、阳性对照样品。荧光定量反应液含有正、反引物和荧光标记的ERCCl基因寡核苷酸探针。荧光定量反应液检测的是ERCCl基因片断核酸序列反应体系包括PCR正向引物序列为SEQ ID NO 1 (5; -GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3;)；PCR反向引物序列为SEQ ID NO 2 (5' -GCGGAGGCTGAGGAACAG-3')；TaqMan突光探针序列为SEQ ID NO : 3 (5，-FAM-CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-BHQI-3，)，其 5'端标记 FAM(荧光报告基团)，3'端标记BHQl (荧光淬灭基团)。阳性对照样品包含所检测ERCCl基因检测位点的质粒基因组DNA。本发明首先用逆转录PCR通用引物将ERCCl基因表达的mRNA逆转录为cDNA进行检测，针对其基因序列特异设计TaqMan探针及引物ー对，当遇到特定基因序列时，TaqMan探针可与之完全結合，PCR扩增吋，荧光报告基团因酶解分离而发出荧光，能够实时检测相应荧光信号的积累，从而实现检测ERCCl基因表达水平的目的。本发明所述的试剂盒提供了两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一祥，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的強弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。与常规免疫组化技术检测ERCCl蛋白相比，本发明所述的ERCCl表达(mRNA)水平荧光定量PCR检测试剂盒具有以下优势I.高度灵敏灵敏度达10个基因拷贝数每微升检测样品，可以进行定量分析。2.检测时间短(从标本送检到得出结果可在12个小时以内完成)。3.操作过程简単，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率。4.本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是血清、血浆、石蜡组织还是新鮮组织，都能取得理想的检测結果。
5.检测的样本量大，一次实验最多可检测数百例。6.安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
图IA是采用本发明所述的试剂盒检测ERCCl基因标准品的荧光定量PCR扩增曲线图。图中，从左到右，分别为IO7拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO4拷贝/微升的ERCCl基因标准品荧光定量PCR扩增曲线。图IB的荧光定量PCR扩增曲线图显示临床病理诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)的100例女性患者样本荧光定量PCR检测結果。上述附图均为检测仪器自带软件的原始检测图，图中横坐标英文含义为“PCR循环数”，纵坐标英文含义为“扩增反应的荧光值”。
具体实施例方式实施例I :本发明所述的试剂盒对于标准样品的灵敏度本实施例采用不同浓度标准品，分别为IO7拷贝/微升、IO6拷贝/微升、IO5拷贝/微升、IO4拷贝/微升进行荧光定量PCR扩增实验。本实施例采用的试剂盒包括逆转录PCR通用引物、荧光定量反应液预混液(PCRMaster Mix)、荧光定量反应液、阳性对照样品。其中，荧光定量反应液含有专门设计的能特异性检测ERCCl基因的正、反引物和荧光标记的ERCCl基因寡核苷酸探针PCR正向引物序列为SEQ ID NO 1 (5; -GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3;)；PCR反向引物序列为SEQ ID NO 2 (5' -GCGGAGGCTGAGGAACAG-3')；TaqMan突光探针序列为 SEQ ID NO : 3 (5，-FAM-CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-BHQI-3，)，其 5'端标记 FAM(荧光报告基团)，3'端标记BHQl (荧光淬灭基团)。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20 μ M )，探针各O. 2 μ 1(20 μ M )，模板DNA 2· 5 μ I (50ng/μ I)，2*Taqman universal PCRMaster Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH20 4. 3 μ1。荧光定量反应在ΑΒΙ7900检测仪上进行。PCR扩增反应程序95 °C预变性30秒；并按95 °C 5秒，62 °C 33秒，扩增反应45次循环结果见图IA所示，从ERCC I标准品扩增曲线中可以看到不同浓度标准品(分别为IO7, IO6, IO5, IO4拷贝/微升)均呈平行的标准S形扩增曲线。实施例2 :本发明所述的试剂盒对于临床样品的灵敏度本实施例的实验材料是收集某医院病理科2003年6月至2007年4月临床病理诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)的100例女性患者的蜡块组织。切取蜡块组织，提取基因组总RNA供以下的实验应用。本实施例采用的试剂盒与实施例I相同。 本实施例采用的FQ-PCR的检测方法与实施例I相同。100件临床蜡块组织的检测结果如图IB所示，结果可靠性达到99. 98%,表明本试剂盒的检测结果具有极高的的特异性和可靠性。综上所述，本发明所述的试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠、特异的。
权利要求
1.ー种ERCCl基因荧光定量PCR检测试剂盒，包括逆转录PCR通用引物、荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品，其特征在于 所述的荧光定量反应液含有正、反引物和荧光标记的ERCCl基因寡核苷酸探针；其中，正向引物序列为SEQ ID NO: 1，反向引物序列为SEQ ID NO: 2，荧光探针序列为SEQ IDN0:3，荧光探针的5'端标记荧光淬灭基团，3'端标记荧光报告基团； 阳性对照样品包含所检测ERCCl基因检测位点的质粒基因组DNA。
2.根据权利要求I所述的ERCCl基因荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的5'端标记的荧光报告基团是FAM。
3.根据权利要求I所述的EERCCl基因荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧 光探针的3'端标记的荧光淬灭基团是BHQl。
全文摘要
本发明涉及一种ERCC 1基因荧光定量PCR检测试剂盒。本发明所述的试剂盒包括逆转录PCR通用引物、荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品。所述的荧光定量反应液含有正、反引物和荧光标记的ERCC1基因寡核苷酸探针；其中，正向引物序列为SEQ ID NO:1，反向引物序列为SEQ ID NO:2，荧光探针序列为SEQ ID NO:3，荧光探针的5′端标记荧光淬灭基团，3′端标记荧光报告基团；阳性对照样品包含所检测ERCC1基因检测位点的质粒基因组DNA。本发明提供了一种能快速、高敏感度的检测ERCC1基因的荧光定量PCR检测试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液中ERCC1表达水平mRNA的定量检测。
文档编号C12Q1/68GK102851372SQ20121033311
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司