专利名称：一种用于检测基因表达的双重荧光定量pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生化领域，具体涉及基因表达的定量检测方法。
背景技术：
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国A卯lied Biosystems公司推出，由于该 技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、自动 化程度更高、有效解决PCR污染问题等特点，目前已在医学和食品检测领域得到广泛应用。
荧光定量PCR的反应体系是由一对引物(上游引物PI和下游引物P2)和一个探 针T组成(如图1)，探针上标记有一个荧光基团R和一个淬灭基团Q。反应前，探针上的荧 光信号由于淬灭基团的存在而不发光，当反应开始后，Taq酶水解探针而使得淬灭基团从探 针上脱落，受到激光照射时可出现荧光信号，检测到的荧光信号的强弱与PCR反应次数成 正比。"引物+探针"的模式减少了错误的发生，可同时提高敏感性和特异性，成为了 PCR 检测的金标准，可以应用到肿瘤检测、病毒检测、转基因动物筛选等多个方面。欧洲抗癌协 会认为RQ-PCR技术是具有特定融合基因白血病微小残留白血病临床检测的金标准。
荧光定量PCR已广泛用于基因表达变化的检测。然而，检测基因表达变化，要同 时检测目的基因和内参基因的表达情况，这就需要较大量的标本。举例来说，国际通行的 bcr-ablP21。检测实际包括以下3部分①样本中bcr-ablP21。基因拷贝数的绝对定量，②abl 基因拷贝数的绝对定量，③bcr-ab 1P21。和ab 1基因拷贝数的比值。由于②可作为RT-RQ-PCR 各环节的综合质控指标，消除各样本处理过程和实验批间的误差，因此，③比①能更可靠地 反应患者体内融合基因阳性细胞含量的变化，亦便于实验室间比较。但是，现有的RQ-PCR 检测融合基因(需要一对引物和一个相应的探针)和内参基因(需要另一对引物和另一 个探针)是在不同的反应管中进行的，即是单重RQ-PCR ;同时，为了提高实验的准确性，每 批实验需要设置复孔——以设3个复孔计算，因此，每个标本的单次检测就需要2个待测基 因乂3个复孔=6管标本；而为了精确地比较，常需要将不同时间点的系列标本重复检测， 标本用量更多。为了保证获得足够的标本，需要抽取患者更多的骨髓和血标本。采样少、高 通量、集约化检测是现代实验诊断技术发展的必然方向。 双重荧光定量PCR检测是指同一个反应管中进行两个PCR反应(如图2)，包括2 组引物(Pl， P2 ;P1'， P2')和探针(T和T')，每组含有荧光信号不同的探针，上游引物P1 与下游引物P2，引导1号反应的部位，探针T上的荧光指示1号反应的进程；同样2号反应 也单独进行。彼此间不相互影响，结果检测时荧光信号不会相互干扰，可同时用不同的波长 检测2个信号，进行反应结果和各自单独反应相比较。用双重荧光定量PCR检测基因表达 变化，与单重的相比可简约一半左右的试剂和标本用量。然而双重荧光定量PCR对反应体 系的要求比单重的高，不仅6条序列(两对引物和两种探针)的浓度和PCR体系的酶、dNTP 等应达到最优化配置，并且应尽可能减少两对引物和两种探针之间的干扰。目前用双重荧 光定量PCR检测基因表达变化，通常是每检测一个基因都需要重新选定内参基因并设计内
3参基因的引物和探针，十分麻烦。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有通用内参基因及其探针和引物的双重 荧光定量PCR试剂盒。 本发明解决上述问题的技术方案是 —种用于检测基因表达双重荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒包括PCR反应液、DNA 聚合酶、标准品、检测目的基因的引物和荧光探针以及内参基因的引物和荧光探针，其特征 在于， 所述的内参基因为abl基因； 所述检测内参基因的上游引物的序列为5'-GGG CGG CCT GAA TGA AG-3' (SEQ NO. l)，下游引物的序列为5' -GCG CTG AAC AAG TTG GTC TTT-3' (SEQ NO. 2)，荧光探针的 序列为5' -TGA GCG CCT TCT CCC CAAAGA-3' (SEQ NO. 3);所述的荧光探针的5'端标记有 荧光基团，如HEX, 3'端标记有淬灭基团，如El ipse 。 本发明试剂盒所述的目的基因即是待检测基因，可以是哺乳动物的基因，针对检 测不同的基因应搭配相应的引物。
本发明试剂盒的使用方法是
1.标准曲线的制备 设5个标准品含量梯度，分别是lX107copies、lX106copies、lX105copies， 1 X 104copies和1 X 103copies，每个梯度设3个平行管，共15个标准品反应管；
按上述设定在每个标准品反应管中加入目的基因标准品和内参基因abl标准品、 荧光定量PCR反应液、DNA聚合酶、检测目的基因的引物和荧光探针以及内参基因abl的 引物和荧光探针，然后加水补足50ii L。最后按以下程序反应5(TC反应3min，95t:反应 10min，然后在94t:下15s，6(rC下lmin，共反应50个循环。反应结束后，通过机器自带软件 读出目的基因和内参照abl基因的Ct值，以Ct值为因变量，标准品的拷贝数为自变量绘制 标准曲线。 2.样本的检测 (1)模板cDNA的制备提取待测样品的RNA，反转录为cDNA ;每个样本设3个平行管。 (2)PCR扩增在样本反应管中加入cDNA模板、荧光定量PCR反应液、DNA聚合 酶、检测目的基因的引物和荧光探针以及内参基因abl的引物和荧光探针，然后加水补足 50iiL。最后按以下程序反应50。C反应3min，95。C反应10min，然后在94。C下15s，60。C下 lmin，共反应50个循环。反应结束后，通过机器自带软件读出目的基因和内参照abl基因 的Ct值，代入所得标准曲线得出目的基因和内参照abl基因的拷贝数，并计算二者比值。
本发明试剂盒实现了在同一反应管中，同时对目的基因和内参基因进行PCR检 测，从其使用方法可以看出，检测一个样本仅需15个标准反应管和3个样本反应管，与现有 技术相比节省了 一半的试剂和样本用量。 将本发明试剂盒中检测内参基因abl的引物的扩增DNA片段在genebank (http: 〃 www. ncbi. nlm. nih. gov/)中进行比对检索，发现该片段与类人猿、猴、狗、马、小鼠等动物abl基因的匹配率绝大多数达到97. 1%以上，最低也达87. 9%，而与其他基因几乎没有 完全匹配的区域。可见本发明试剂盒的应用范围广，可用于检测哺乳动物中各种基因的 表达水平，尤其是致病基因，如肿瘤融合基因BCR-ABL， PML-RARa， AML1-ET0， SIL-TALl， CBFB-MYHll， E2A-PBX1， MLL-AF4， TEL-AML1等。因此，使用本发明试剂盒检测基因表达时， 只需设计目的基因的引物和探针即可，无需再重新设计内参基因的引物和探针。 图1是荧光定量PCR的反应原理，其中PI和P2为引物，T为探针，R为荧光发生基 团，Q为荧光淬灭基团。 图2是双重荧光定量PCR的反应示意图，其中Pl、 P2、 PI'和P2'为引物，T禾口 T' 为探针，R为荧光发生基团，Q为荧光淬灭基团。 图3是标准品质粒浓度为1 X 105copies/2 ii L时bcr_ablp21。融合基因和abl基因 的扩增曲线图，其中1 3分别为4个平行管的bCr-ablp21。融合基因扩增曲线，4 6分别 为3个平行管的abl基因扩增曲线。 图4是不同浓度标准品质粒Bcr-ab1P21。T-A的扩增曲线对数曲线图，其中 1 7分另U是浓度为lX107copies/2ii L、lX106copies/2ii L、lX105copies/2ii L， 1 X 104copies/2 ii L、 1 X 103copies/2 ii L、 1 X 102copies/2 ii L和1 X 10、opies/2 ii L的标准 品质粒的扩增曲线，8是阴性对照，虚横线为阈值(threshold)。
图5是标准品质粒Bcr-ab1P21。T-A的标准曲线图。
具体实施方式
例1 —、本发明试剂盒的组成 1.2XTaqMan PCR通用反应液(2XTaqMan universal PCR Mastermix，购自美国 ABI公司)含有聚合酶及PCR反应必需的其它成分，模板、引物和探针除外；
2.标准品为Bcr-ablP210T-A载体，即同时载有bcr-ablP210和内参基因abl待测 片段的对照质粒载体，其制备方法如下 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 ill (表1); 表1 2)加入5 ill (等量)的Solution I ; 3)16。C反应30分钟。 注①室温(25°C )也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 ②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。 4)全量(10 ii 1)加入至100 ii 1 JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟； 5) 42t:加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟；
p歸DTMW-T Vector" bcr-abb，駿合基园和aW基證 dH20
一 3 |d
6)加入890 ii 1S0C培养基，37。C振荡培养60分钟； 7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L_琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、 蓝色菌落； 8)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。 3.内参基因abl的引物和荧光探针分别是 上游引物的序列为SEQ NO. 1，5' -GGG CGG CCT GAA TGAAG-3' 下游引物的序列为SEQ NO. 2， 5' -GCG CTG AAC AAG TTG GTC TTT-3' 荧光探针的序列为SEQ NO. 3，5'_TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3'，该荧光探针
的5'端标记有荧光基团HEX, 3'端标记有淬灭报告基团El ipse 。 4.检测bcr-ablP210融合基因的引物和荧光探针，其序列分别为 bcr-ablP210融合基因的引物和荧光探针，可以采用如欧洲抗癌协会(EAC)推荐
的序列，分别是 上游引物为SEQ NO. 4 :5' -TCC GCT GAC CAT CAA TAA GGA-3' 下游引物为SEQ NO. 5 :5， -CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA-3' 荧光探针的序列为SEQ NO. 6 :5，-CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A-3，，该荧
光探针的5'端标记有荧光基团FAM，3'端标记有淬灭报告基团，TAMRA。 上述引物和探针在上海英骏生物技术公司和大连宝生物公司合成。 二、待测样品 2004年5月至2006年12月在南方医院门诊或住院的CML慢性期(CP)患者46 例，男23例，女23例，年龄16 65岁，中位年龄38. 1岁，取患者外周血或者骨髓。
三、样品的处理 1.分离RNA:取白血病患者骨髓或外周血经Ficoll淋巴细胞分离液分离得到单 个核细胞，以5X106 1X107个细胞/管的浓度加入lmL Trizol Reagent,立即使用 或-8(TC保存，以一步法分离总RNA。 RNA经紫外分光光度计测定A260/A280值，测定RNA浓 度和纯度。 2.合成模板cDNA:在25iil体系中，含有1.8iig总RNA，0. 5iig随机引物，40U
RNA酶抑制剂，lmmol/LdNTPs， 200U M-MLV逆转录酶，50mM Tris-HCl (pH8. 3) ， 75mM KC1， 3mM
MgC12， 10mM DTT。以上均为Promega公司产品。将总RNA与随机引物混合，在65。C放置5
分钟，然后加入RNA酶抑制剂、dNTPs、逆转录酶和Buffer，在37t:放置45分钟。 四、样品的检测 1.用本发明试剂盒检测 仪器Biorad公司荧光定量PCR扩增仪和分析系统
(1)标准曲线的制备 取Bcr-ablP210T-A载体，用水稀释成以下浓度1 X 107copies/2 ii L、 IX 106copies/2 ii L、 1 X 105copies/2 ii U X 104copies/2 ii L、l X 103copies/2 ii L、 1 X 102copies/2 ii L禾口 1 X 101copies/2 ii L ; 按上述设定在每个标准品反应管中加入Bcr-ablP210T-A载体2 ii L、2XTaqMan PCR通用反应液25iiL，加入检测bcr-abl融合基因的引物和检测内参基因abl的引物至 各引物浓度为0. 3 ii /L，检测bcr-abl融合基因的探针和检测内参基因abl的探针至各探针浓度为0. 2 ii moL/L，加入然后加水补足50 y L。最后按以下程序反应5(TC反应3min， 95°C反应10min，然后在94°C下15s， 60°C下lmin共反应50个循环。反应结束后，通过机器 自带软件读出bcr-abl基因和内参照abl基因的Ct值，以Ct值为因变量，标准品的拷贝数 为自变量绘制标准曲线；每个Bcr-ablP210T-A载体浓度设3个平行管，共15个标准品反应管。 (2)样品的检测 在样品检测管中加入模板cDNA2iiL， bcr-ablP210基因和abl内参基因的引 物(即SEQ NO. 4、 SEQ NO. 5、 SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)各至0. 3 ii moL/L， bcr_ablP210基 因的探针(SEQ NO. 6)和abl基因的探针(SEQNO. 3)各至0. 2 ii moL/L， 2 X TaqMan PCR 通用反应液25iiL，每管的反应总体系50iiL，不足部分以无菌双蒸水补充。反应程序 50°C X3min+95。C X 10min，然后94°C X15s、60。C Xlmin共50个循环。反应结束后，通过 机器自带软件读出bcr-ablP210目的基因和abl内参照的拷贝数，计算二者的比值。每一 标本均做3个平行管，以保证结果的准确性。
2.对比实验1——用荧光原位杂交(FISH)进行检测 按试剂盒提供的间期荧光原位杂交操作说明进行标本处理、变性、杂交、杂交后洗 脱等操作。 3.对比实验2——用单重荧光定量PCR检测 (1)试剂标准品质粒为含有bcr-ablP210基因的质粒Bcr-ablP210质粒和含有 abl内参基因的T-A载体，其余试剂均和本发明试剂盒相同。
(2)方法 ①Bcr-ablP210基因标准曲线的绘制 取Bcr-ablP210质粒载体进行10倍梯度稀释至每2 ii L分别含有1 X 106copies， 1 X 105copies， 1 X 104copies， 1 X 103copies， 1 X 102copies， 1 X 101copies质粒，每个梯度 均做3个平行管，以保证结果的准确性。反应体系每管中加入2ii L阳性模板，bcr-ablP210 基因的上、下游引物(即SEQ NO. 4和SEQ NO. 5)各至0. 3 ii moL/L，bcr-ablP210基因FAM标 记的TaqMan探针(即SEQ NO. 6)至0. 2 ii moL/L ;2 X TaqMan PCR通用共同组分(2 X TaqMan universal PCR Mastermix，美国ABI公司)25 y L，每管的反应总体系50 y L，不足部分以无 菌双蒸水补充。 ②abl基因标准曲线的绘制 取带有内参基因abl待测片段的T-A载体进行10倍梯度稀释至每2 y L分别含有 1X106copies，1X105copies，1X104copies，1X103copies，1X102copies，1X101copies 质粒，每个梯度均做3个平行管，以保证结果的准确性。反应体系每管中加入2iiL阳性模
板，abl内参基因的上、下游引物(即SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)各至O. 31 y moL/L，abl基因HEX 标记的TaqMan探针(即SEQ NO. 3)至0. 2 ii moL/L ;2xTaqManPCR通用共同组分(2 X TaqMan universal PCR Mastermix，美国ABI公司)25 y L，每管的反应总体系50 y L，不足部分以无 菌双蒸水补充。 反应程序50。C X3min+95。C X 10min，然后94°C X15s、60。C X lmin共50个循 环。反应结束后，通过机器自带软件读出bcr-ablP210目的基因和abl内参照的拷贝数，计 算二者的比值，绘制各自的标准曲线。
五、结果 1.本发明试剂盒标准曲线的绘制 图3显示当bcr-abl融合基因和abl基因的起始拷贝数相同时，使用各自引物进 行扩增的Ct值是相同的，说明用本发明标准品质粒的标准曲线代替bcr-abl融合基因和 abl基因的标准曲线是可行的。图4是浓度为1X107copies/2ii L、lX106copies/2ii L、 1X105copies/2iiL，lX104copies/2pL和1 X 103copies/2 ii L的标准品质粒及阴 性对照的扩增曲线。根据图4结果绘制的标准曲线如图5所示，标准曲线方程为y =-3. 381X+16. 40， r = 0.995。 1X107至10个拷贝数7个梯度的标本CV值(n = 5)分 别为4. 89%、3. 88%、4. 34%、1. 90%、3. 93%、4. 26%和3. 45%，说明本发明方法的稳定性 好。 2.各组样品检测结果 如表2所示，本发明试剂盒的检测结果和单重荧光定量PCR检测结果基本一致，说 明本发明试剂盒的准确性和单重荧光定量PCR相当，但样本和试剂的用量却节省了一倍。
表2
分组样品数 (例)本发明试剂盒检测结果FISH检测结果单重荧光定量PCR 检测结果
180. 492±0. 26363. 9% ±16. 1%0. 579±0. 271
260. 023±0. 0333. 8% ±1. 8%0. 031±0. 013
39(4. 33 ±3. 84) X 10—4阴性(3. 99±1. 32) X 10—4 六、典型病例举例 初发治疗的患者，FISH检测bcr-abl基因阳性率为95% 。 经格列卫治疗3个月患者，FISH检测bcr-abl基因阳性率为5%。 经异基因造血干细胞移植患者，FISH检测。bcr-abl基因阳性率为阴性。 上述结果说明FISH的检测结果和临床诊断的结果一致，与本发明试剂盒检测结
果相符。 例2 —、本发明试剂盒的组成 2XTaqMan PCR通用反应液(2XTaqMan universal PCR Mastermix，购自美国ABI
公司)含有聚合酶及PCR反应必需的其它成分，模板、引物和探针除外； 标准品为Bcr-ablP19。T-A载体，即同时载有bcr-ablP19。和内参基因abl的对照质
粒载体，其制备方法如下 1)按表2在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 iU。 表3
8
pMDTM〗8-T Vector* 1ber-ablra。融合基S和aW基因dH20 2)加入5 ii 1 (等量)的Solution I 。
3)16。C反应30分钟。
注)①室温(25°C )也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4)全量(lOiil)加入至100 ill JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5)42t:加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6)加入890iU S0C培养基，37t:振荡培养60分钟。 7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L_琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。 8)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
内参基因abl的引物和荧光探针分别是 上游引物的序列为SEQ NO. 1 :5' -GGG CGG CCT GAA TGA AG-3' 下游引物的序列为SEQ NO. 2 :5' -GCG CTG AAC AAG TTG GTC TTT-3' 荧光探针的序列为SEQ NO. 3 :5'_TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3'，该荧光探针
的5'端标记有荧光基团HEX, 3'端标记有淬灭报告基团El ipse 。 bcr-ablP19。融合基因的引物和荧光探针，可以采用如欧洲抗癌协会(EAC)推荐的序列，分别是 上游引物为SEQ NO. 7 :5' -CTG GCC CAA CGA TGG CGA-3'; 下游引物为SEQ NO. 5 :5' -CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA-3'; 荧光探针的序列为SEQ NO. 6 :5' -CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A-3'该荧
光探针的5'端标记有荧光基团FAM，3'端标记有淬灭报告基团TAMRA。 上述引物和探针在上海英俊生物技术公司和大连宝生物公司合成。 二、样品的处理 1、分离RNA :取白血病患者骨髓或外周血经Ficoll淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞，以5X106 lXl()7个细胞/管的浓度加入lmL Trizol Reagent,立即使用或-80。C保存，以一步法分离总RNA。 RNA经紫外分光光度计测定A26。/A28。值，测定RNA浓度和纯度。
2、合成模板cDNA :在25 iil体系中，含有1. 8 ii g总RNA， 0. 5 ii g随机引物，40URNA酶抑制剂，lmmol/LdNTPs， 200U M-MLV逆转录酶，50mM Tris-HCl (pH8. 3) ， 75mM KC1， 3mMMgCl2， 10mM DTT。以上均为Promega公司产品。将总RNA与随机引物混合，在65。C放置5分钟，然后加入RNA酶抑制剂、dNTPs、逆转录酶和Buffer，在37t:放置45分钟。
三、样品的检测 仪器Biorad公司荧光定量PCR扩增仪和分析系统
(1)标准曲线的制备 取Bcr-ablP19。T_A载体，用水稀释至每微升含Bcr-ablP19。T_A载体1 X 106copies，
1 Pi
3 pi
91 X 10 copies, 1 X 10 copies, 1 X 10 copies, 1 X 10 copies, 1 X 10 copies ;
按上述设定在每个标准品反应管中加入Bcr-ab1P19。T_A载体2 ii L、 2 X TaqManPCR通用反应液25iiL，加入检测bcr-abl融合基因的引物和检测内参基因abl的引物至各引物浓度为0. 3 ii moL/L，检测bcr-ab 1融合基因的探针和检测内参基因ab 1的探针至各探针浓度为0.2iimoL/L，加入然后加水补足50iiL，最后按以下程序反应50°C X3min+95。C X 10min，然后94°C X15s、60。C Xlmin共50个循环。反应结束后，通过机器自带软件读出bcr-abl基因和内参照abl基因的Ct值，以Ct值为因变量，标准品的拷贝数为自变量绘制标准曲线海个Bcr-ab1P19。T-A载体浓度设3个平行管，共15个标准品反应管。 (2)样品的检测 在样品检测管中加入模板cDNA2iiL， bcr-ablP19。基因和abl内参基因的引物(即SEQ NO. 7、 SEQ NO. 5、 SEQ NO. 1和SEQ NO. 2)各至0. 3 ii moL/L， bcr_ablP19。基因的探针(SEQ NO. 6)和abl基因的探针(SEQ NO. 3)各至0. 2 ii moL/L， 2 X TaqMan PCR通用反应液25 L，每管的反应总体系50 L，不足部分以无菌双蒸水补充。反应程序50°C X3min+95。C X 10min，然后94°C X15s、60。C Xlmin共50个循环。反应结束后，通过机器自带软件读出bcr-ablp，目的基因和abl内参照的拷贝数，计算二者的比值。每一标本均做3个平行管，以保证结果的准确性。
0123]序列表
0124]〈110〉南方医科大学
0125]〈120〉 一种用于检测基因表达双重荧光定量PCR试剂盒
0126]〈160>7
0127]〈170>PatentIn version 3. 3
0128]〈210>1
0129]〈211>17
0130]〈212>DNA
0131]〈213〉人工序列
0132]〈400>1
0133]gggCggCCtg ￡l￡ltg￡l￡lg
0134]〈210>2
0135]〈211>21
0136]〈212>DNA
0137]〈213〉人工序列
0138]〈400>2
0139]gcgctgaaca agttggtctt t
0140]〈210>3
0141]〈211>21
0142]〈212>DNA
0143]〈213〉人工序列
0144]〈400>3
tgagcgcctt ctccccaaag〈210>4〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4tccgctgacc atcaataagg〈210>5〈211>21<212>DNA〈213〉人工序列〈400>5cactcagacc ctgaggctca〈210>6〈211>25〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>6cccttcagcg gccagtagcatctga〈210>7<211>18〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>7ctggcccaac gatggcga
1权利要求
一种用于检测基因表达双重荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒包括PCR反应液、DNA聚合酶、标准品、检测目的基因的引物和荧光探针以及内参基因的引物和荧光探针，其特征在于，所述的内参基因为abl基因；所述检测内参基因的上游引物的序列为5’GGG CGG CCT GAA TGA AG-3’，下游引物的序列为5’-GCG CTGAAC AAG TTG GTC TTT-3’，荧光探针的序列为5’-TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3’所述的荧光探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
全文摘要
一种用于检测基因表达双重荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由PCR反应液、DNA聚合酶、标准品、检测目的基因的引物和荧光探针以及内参基因的引物和荧光探针组成，其特征在于所述的内参基因为abl检测该基因的上游引物的序列为5’-GGG CGG CCT GAA TGA AG-3’，下游引物的序列为5’-GCG CTG AAC AAGTTG GTC TTT-3’，荧光探针的序列为5’-TGA GCG CCT TCT CCC CAA AGA-3’；所述的荧光探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。本发明试剂盒可达到现有单重荧光定量PCR方法检测的准确度和灵敏度，但所需样品量和试剂量节省了近一倍。
文档编号C12Q1/68GK101701253SQ20091022489
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者周红升, 孟凡义, 常威, 张洋, 徐波儿, 戴敏, 李乐, 李清, 江千里, 江汕, 郑潇潇, 阴常欣 申请人:南方医科大学