专利名称：微管蛋白基因表达荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测微管蛋白(tubulin)基因的荧光定量PCR试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液中tubulin基因表达水平mRNA的定量检测。
背景技术：
微管蛋白(tubulin)为细胞骨架的重要组成部分，它担任着维持细胞形态、进行物质交换、传递信息、参与有丝分裂等的重要功能。分为α、β两个亚型，其中β_微管蛋 白-III (β -tubulin- III)与作用于tubulin的化疗药物敏感性有最密切的关系。自从紫杉醇发现以来，以tubulin作为抗肿瘤药物筛选的靶点日益受到重视。影响肿瘤患者化疗效果及生存的主要原因是肿瘤细胞对抗癌药物的抗药性。近年研究表明细胞信号转导中相关因子的表达异常、肿瘤细胞DNA修复的异常及其它相关基因的表达异常与肺癌耐药的产生也存在密切联系。根据病人肿瘤组织的基因表达情况选用特异的对其最佳的化疗药物，以提高化疗的敏感性及延长生存期，并将毒副反应降到最低成为可能。非小细胞肺癌患者肿瘤组织中β -微管蛋白-III (β-tubulin-III)的表达与患者对长春碱类药物的代表长春瑞滨的敏感性关系密切，通过对tubulin基因的研究以期为个体化治疗药物选择提供依据。一、TbuI in 的结构微管为管状结构，由α β异二聚体首尾相连的13根原丝平行连接而成。它是真核细胞于增殖周期或发育的某时相中存在于细胞内的蛋白质聚合体，是构成细胞网架的主要成分。微管有聚合和解聚的动力学特性，在保持细胞形态、细胞的分裂增殖、细胞器的组成与运输及信号物质的传导方面发挥重要作用。以微管为靶点的抗肿瘤药就是利用其动力学特性，或促进其解聚或抑制其聚合，从而达到直接影响细胞的有丝分裂，并影响细胞的诸正常生理功能，使细胞分裂停止于M期。Tubulin是球形分子,分为α、β两个亚型，a-tubulin含450个氨基酸残基,其分子量为50kD, β -tubulin含455个氨基酸，α -和β -tubulin均含酸性C末端序列。这两种亚基有35 40%的氨基酸序列同源，表明编码它们的基因可能是由同一原始祖先演变而来。另外，这两种tubulin与细菌中一种叫作FysZ的GTPase (分子量为40kDa)同源，这种酶具有和tubulin相似的功能，能够聚合并且参与细胞分裂。α-和β-tubulin的亚基都是直径为4nm的球形分子,它们组成的异源二聚体的长度为8nm。α-和β-tubulin各有一个GTP结合位点，位于α亚基上的GTP结合位点，是不可逆的结合位点，结合上去的GTP不能被水解，也不能被GDP替换。位于β亚基上的GTP结合位点结合GTP后能够被水解成⑶P,所以这个位点又称为可交换的位点(exchangeable site,E位点)。除极少数例外，如人的红细胞微管几乎存在于从阿米巴到高等动植物所有真核细胞胞质中，而所有原核生物中没有微管。tubulin分子在生物进化上可能是最稳定的蛋白分子之一。a-tubulin和β -tubulin形成tubulin异二聚体,是微管装配的基本单位。tubulin 二聚体含有鸟嘌呤核苷酸的两个结合位点，二价阳离子亦能结合于tubulin 二聚体上。
二、Tubulin基因和抗肿瘤药物Tubulin基因是一个多基因家族,在不同种属的生物中，虽然有着各种tubulin异构体，但在蛋白质一级结构结构上存在较强的保守性。在tubulin异构体中多数的不均一性主要发生在序列的C-端上，特别是β-tubulinC端的最后15个氨基酸残基上，同样a-tubulin也在这一区域存在不同变化。在小鼠中存在6个a-tubulin基因，其中mα 3和m α 7产物只在睾丸中表达。在小鼠脑中，m α 4和m α 6基因有少量表达，而m α I和m α 2基因则表达量很高。小鼠6个β-tubulin基因，由于C-端氨基酸序列不同，可分为6个主要异构类型。在鸡中发现的β-tubulin-V基因却没有在小鼠中发现。每种异构体都存在一个组织特异性表达模式，除了仅在造血细胞中表达的VI型和主要在睾丸中表达的IV型夕卜，所有类型的β-tubulin基因都在神经组织中表达。β-tubulin- II是小鼠脑组织中主要的β-tubulin,而β-tubulin-III是小鼠脑中神经元特异的β-tubulin。Tubulin基因突变并不常见，先前的关于非小细胞肺癌中tubulin基因突变的研究可能是假基因(pseudogenes)共扩增引起的人为现象。已知的β-tubulin假基因分布在同源染色体6和1，8，19染色体上。所以那种表面上的tubulin突变与耐药、预后相关的 假象可能与肿瘤的非整倍性相关。以tubulin作为靶点的抗肿瘤药物(I)抑制tubulin聚合的药物在tubulin上有一个结合位点的药物，包括秋水仙碱类和鬼曰毒素类药物鬼臼噻吩苷(替尼泊苷)及鬼臼乙叉苷(依托泊苷)。鬼臼毒素类药物虽能与tubulin结合，抑制tubulin聚合，但其主要作用是抑制DNA拓扑异构酶II的DNA断裂后重新连接反应，组织细胞周期与G2期。目前已被列入拓扑异构酶II抑制剂。在tubulin上有2个结合位点的药物长春花碱类(长春花碱、长春新碱、长春碱酰胺、去甲长春花碱)和美登素。(2)抑制tubulin解聚的药物抑制tubulin解聚的药物包括紫杉类药物有紫杉醇和多系紫杉醇。是目前唯一发现并应用于临床的促进微管聚合、抑制微管解聚的药物。二、微管蛋白基因表达和临床意乂Tubulin基因表达水平与抗肿瘤药物的作用密切相关，直接影响到肿瘤的治疗及预后，具有非常重要的临床意义。长春碱类药物主要与β -tubulin-III的175-213氨基酸残基结合，影响微管形成时新的tubulin 二聚体的形成，而且新加入的二聚体会使原丝弯曲，影响原丝的作用，使微管不能延长，从而阻断微管聚合成纺锤体，使细胞停滞于有丝分裂中期，导致肿瘤细胞凋亡。但是目前的研究中，β-tubulin-III的表达水平与长春碱类疗效的关系常不一致，甚至互相矛盾。Seve等以I B II期的非小细胞肺癌为对象，发现在仅行手术治疗的患者中，β-tubulin-III高表达者，其无复发生存期和总生存期均短于低表达者；而在接受术后NP方案辅助化疗的患者中，情况正好相反β -tubulin- III高表达者，其无复发生存期和总生存期均优于地表达者。而在III IV期非小细胞肺癌中，Seve等以免疫组织化学法检测肿瘤组织β -tubulin- III的表达，发现其表达程度与长春碱类治疗的反应率无关，但与疾病进展时间有关高表达者，无进展生存期和总生存期均短于地表达者，提示对长春碱类耐药。Gan等以siRNA技术，将非小细胞肺癌细胞株NCIH460和Calu_6的β -tubulin- III表达降低，从而使该细胞对NVB的敏感性明显提高。Rosell等检测了 75例非小细胞肺癌患者中β -tubulin- III基因的mRNA表达水平，结果发现在接受长春碱/顺钼化疗的患者中，β-tubulin- IIIm RN A表达的患者对化疗的反应率较好，其疾病进展时间(TTP)也有延长的趋势，提示β -tubulin- III的表达水平可能成为预测非小细胞肺癌患者对长春碱类药物化疗疗效的重要指标。综上所述，我们以非小细胞肺癌患者为观察对象，结合患者病理组织内非小细胞肺癌的表达，发现对NVB敏感的患者,其组织内β -tubulin- III低表达,而对该药无效的患者，β-tubulin-III高表达。在GEM治疗的患者中，贝U未观察到此现象,提示β-tubulin-III有可能作为预测长春碱类药物敏感性的一个指标。β -tubulin低表达可能与肺癌的生长、侵袭有关。通过对非小细胞肺癌患者手术切除标本进行β-tubulin-III蛋白表达检测，观察其在非小细胞肺癌中表达水平，共表达的分子亚型情况，及与临床病理特征的关系，同时对入组患者进行分层分析，探讨上述生物标记物能否成为非小细胞肺癌术后患者预后或 化疗预测因子。目的是通过分子标记物筛选出敏感人群指导个体化辅助治疗，减少盲目用药，提高非小细胞肺癌患者辅助化疗的疗效及术后生存率。紫杉类化疗药物是通过影响细胞微管的聚合和解聚而起抗肿瘤作用的。因此，研究微管表达水平与紫杉类肿瘤药物疗效的相关性对预测非小细胞肺癌对此类药物化疗敏感性，并对不同个体选择紫杉类药物是近年来的另一个研究进展。紫杉类药物的作用机制主要通过干扰微管系统，阻止细胞的有丝分裂来发挥其细胞毒性作用。紫杉醇通过作用于β-tubulinN端第31个氨基酸上，此位点由外显子I和2编码，在种属间高度保守。许多研究表明Ptubulin同型表达的改变可以引起紫杉醇的耐药，在人类细胞中存在着6种β-tubulin同型，这些同型具有各自独特的动力学特性并且在体外与紫杉醇存在着不同的相互作用。NSCLC细胞系A549-T12和A549-T24对紫杉醇的耐药性分别增加了 9倍和17倍，RT-PCR分析表明，A549-T12和A549-T24分别和敏感细胞系A549比较，III和IV型β -tubulin同型分别在A549-T12和A549-T24细胞中增加2 3倍和4倍。Kavallaris等用反义寡核苷酸技术发现III型RNA下降40% 50%时，伴随β -tubulin- III水平下降，从而导致对紫杉醇的敏感性提高了 39%。因此，同型β -tubulin-III的表达增加可能阻碍紫杉醇稳定微管的效果。综上结果，同型β-tubulin-III的表达水平可能是肿瘤细胞对紫杉醇敏感性的决定因素。国内外的研究结果显示β-tubulin-III高表达可能提示对紫杉醇类药物有耐药，而低表达则对紫杉醇类药物敏感，β-tubulin-III可以作为是否选择紫杉醇类药物辅助化疗的分子标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速、高敏感度的检测血清、组织中tubulin基因的荧光定量PCR检测试剂盒。本发明采用锁核酸(locked nucleic acid,LNA)技术合成覆盖tubulin基因检测位点的核苷酸序列探针，结合荧光定量PCR技术，研制一种快速、高度灵敏的检测tubulin基因表达水平的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒包括荧光定量反应液预混液(PCR MasterMix)、荧光定量反应液(荧光定量反应液的特征是均含有正、反引物和荧光标记的Tubulin基因锁核苷酸探针)、阳性对照样品。突光定量反应液用于检测tubulin基因检测位点核酸序列。该反应液包括PCR引物一对及探针一条正向引物序列为SEQ ID NO: I (5，-GTTCTGGGAAGTCATCAGTGATGA-3，)；反向引物序列为SEQ ID NO: 2 (5，-GTCCGAGTCGCCCACGTA-3，)；LNA-突光探针序列为 SEQ ID N0:3(5’-FAM-CATGGCATCGACCCCAGCGG-BHQl-3’)。该荧光探针的 5'端标记FAM (荧光报告基团)，3^端标记BHQl (荧光淬灭基团)。阳性对照样品包含所检测tubulin基因检测位点的混合质粒基因组DNA。在本发明中提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5'端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移(FRET)而被3'端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5' -3'外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。与常规检测tubulin基因表达的方法比较，该新型荧光定量PCR技术具有以下明显优势I.本发明采用LNA技术合成覆盖tubulin基因检测位点的核苷酸序列探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低。2.高度灵敏灵敏度达10个基因拷贝数每毫升检测样品，10倍优于普通荧光定量PCR 法；3.检测时间短(从标本送检到得出结果可在12个小时以内完成)；4.操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率；5.本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是血清、血浆、石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果。6.检测的样本量大，一次实验最多可检测384例。7.安全整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。
图I是部分β -tubulin- III低表达水平阳性样本的FQ-PCR图。图2是部分β -tubulin- III高表达水平阳性样本的FQ-PCR图。上述附图均为检测仪器自带软件的原始检测图，图中横坐标英文含义为“PCR循环数”，纵坐标英文含义为“扩增反应的荧光值”。
具体实施例方式本发明采用的实验材料是收集自中山大学附属肿瘤医院病理科2002年6月 2005年5月临床病理诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)的70例女性患者的蜡块组织。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。实施例I :用荧光定量PCR检测非小细胞肺癌中tubulin mRNA的表达水平与抗肿瘤药物(紫杉醇或长春碱类)的化疗效果。设计能特异性检测tubulin基因的PCR引物一对及探针一条，其中正向引物序列为SEQ ID NO: I (5，-GTTCTGGGAAGTCATCAGTGATGA-3，)； 反向引物序列为SEQ ID NO: 2 (5’ -GTCCGAGTCGCCCACGTA-3’)；LNA-突光探针序列为SEQ ID NO: 3 (5’-FAM-CATGGCATCGACCCCAGCGG-BHQl_3’)。该荧光探针的 5'端标记FAM (荧光报告基团)，3^端标记BHQl (荧光淬灭基团)。然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测反应体系为15 μ I,正、反引物各O. 15 μ I(20 μ M )，探针各O. 2 μ 1(20 μ Μ)，模板DNA2. 5μ l(100-300ng/y l)，2*Taqman universalPCR Master Mix (购自美国应用生物公司)7. 5 μ 1，ddH204. 3 μ I。荧光定量反应在ΑΒΙ7900检测仪上进行。PCR扩增反应程序95 °C预变性30秒；并按95 °C 5秒，62 °C 33秒，扩增反应45次循环。结果为在70例样本中β -tubulin- III低表达水平的肿瘤患者对抗肿瘤药物敏感，接受紫杉醇类或长春碱类化疗的效果较好，中位生存期较长，进展率低(见图I)。反之，β -tubulin- III高表达的患者对抗肿瘤药物敏感性低，接受抗微管类化疗疗效较差，进展率高(见图2)。由此看出，采用本发明所述的微管蛋白基因荧光定量PCR检测试剂盒，不仅可以快速、高效地检测出样品中的微管蛋白基因的表达水平，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的。
权利要求
1.一种微管蛋白基因荧光定量PCR检测试剂盒，包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品，其特征在于 所述荧光定量反应液包括PCR引物ー对及探针一条，其中，正向引物的序列为SEQ IDN0:1，反向引物的序列为SEQ ID NO: 2，荧光探针的序列为SEQID NO: 3，该荧光探针是采用荧光标记的覆盖微管蛋白基因检测位点的锁核苷酸探针，其5,端标记荧光报告基团，3'端标记荧光淬灭基团； 所述阳性对照样品为包含所检测微管蛋白基因检测位点的混合质粒基因组DNA。
2.根据权利要求I所述的微管蛋白基因荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的5'端标记的荧光报告基团是FAM。
3.根据权利要求I所述的微管蛋白基因荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于所述荧光探针的3'端标记的荧光淬灭基团是BHQl。
全文摘要
本发明涉及一种检测微管蛋白基因的荧光定量PCR试剂盒。本发明所述的微管蛋白基因荧光定量PCR检测试剂盒包括荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品。所述荧光定量反应液包括PCR引物一对及探针一条，该荧光探针是采用荧光标记的覆盖微管蛋白基因检测位点的锁核苷酸探针，其5′端标记荧光报告基团，3′端标记荧光淬灭基团。所述阳性对照样品为包含所检测微管蛋白基因检测位点的混合质粒基因组DNA。本发明适用于各种组织、细胞、血液中tubulin基因表达水平mRNA的定量检测。
文档编号C12Q1/68GK102851370SQ201210333098
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者邵琦 申请人:广州达健生物科技有限公司