专利名称：从大肠杆菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株及其获得方法
技术领域：
本发明为一种从大肠杆菌中直接表达获得眼镜蛇毒神经多肽菌株-WY-2的方法。
背基技术现有的获得眼镜蛇毒神经多肽的方法均为从天然蛇毒中提取，经分离纯化获得，也有采用基因工程的手段从酵母菌中表达获得，但表达量相对低(为8mg/L)。
发明内容
本发明的目的是提供一种能替代天然眼镜蛇毒神经多肽的、效果理想的合成眼镜蛇毒神经多肽菌株及其获得方法，此法与酵母方法相比，具有直接表达、分离纯化工艺简便、活性高等特点。
本发明从大肠杆菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株，其特征在于含有T7启动子和lac I操纵子基因，其表达如下WY-2以CCTCC No.M202024进行描述。其获得方法为，根据从天然眼镜蛇毒中分离纯化得到的神经毒多肽所测定的一级结构及表达载体pET21b的酶切位点，设计引物，并用所设计的引物从已经建好的基因库进行筛选，筛选结果为Nde I切点CATATGCTGGAATGCCACAACCAGCAGTCTTCTCAGACCCCGACCACCACCCGTTGCTCTGGTGGTGAAACCAACTGCTACAAAAAACGTTGGCGTGACCACCGTGGTTACCGTACCGAACGTGGTTGCGGTTGCCCGTCTGTTAAAAACGGTATCGAAATCAACTGCTGCACCACCGACCGTTGCAACAACTAATAAGAATTCEcoR I切点连接到PMD18-T，然后用Nde I和EcoR I双酶切PMD18-T-Cbt，用pET21b作载体，通过T4DNA连接酶连接，构建了重组质粒pET21b-Cbt，转化到大肠杆菌BL21中，将pET21b-Cbt菌株接种于LB(Amp抗性)中，35～37℃振荡培养至600nm下光吸收值为0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mM并在25～37℃下进行诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在大肠杆菌中的高效表达菌株(pET21b-Cbt)，表达量为10mg/L。然后用溶菌酶和超声波破碎的方法破碎菌体，经分子筛和离子交换即可得到表达的神经多肽纯品，电泳一条带，并且具有明显的天然眼镜蛇毒神经多肽活性，比酵母菌表达产物活性高10％而且容易纯化。
本发明的效果是，通过本发明获得的神经多肽是一种具有天然活性的神经多肽(与天然眼镜蛇毒神经多肽具有同样的结构及活性)，可替代天然眼镜蛇毒神经多肽，可以满足逐渐增加的市场需求，又能保护蛇资源，是一种有应用前景的菌株。
图1为重组质粒pET21b-Cbt的构建图。
具体实施例方式实施例1、本实施例从大肠杆菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株，其特征在于含有T7启动子和lac I操纵子基因，其表达如下WY-2以CCTCC No.M202024进行描述。其获得方法为，根据从天然眼镜蛇毒中分离纯化得到的神经毒多肽所测定的一级结构及表达载体pET21b的酶切位点，设计引物，并用所设计的引物从已经建好的基因库进行筛选，筛选结果为Nde I切点CATATGCTGGAATGCCACAACCAGCAGTCTTCTCAGACCCCGACCACCACCCGTTGCTCTGGTGGTGAAACCAACTGCTACAAAAAACGTTGGCGTGACCACCGTGGTTACCGTACCGAACGTGGTTGCGGTTGCCCGTCTGTTAAAAACGGTATCGAAATCAACTGCTGCACCACCGACCGTTGCAACAACTAATAAGAATTCEcoR I切点连接到PMD18-T，然后用Nde I和EcoR I双酶切PMD18-T-Cbt，用pET21b作载体，通过T4DNA连接酶连接，构建了重组质粒pET21b-Cbt，转化到大肠杆菌BL21中，将pET21b-Cbt菌株接种于LB(Amp抗性)中，35～37℃振荡培养至600nm下光吸收值为0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mM并在25～37℃下进行诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在大肠杆菌中的高效表达菌株(pET21b-Cbt)，表达量为10mg/L。然后用溶菌酶和超声波破碎的方法破碎菌体，经分子筛和离子交换即可得到表达的神经多肽纯品，电泳一条带，并且具有明显的天然眼镜蛇毒神经多肽活性，比酵母菌表达产物活性高10％而且容易纯化。
权利要求
1.一种从大肠杆菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株，其特征是含有T7启动子和lac I操纵子基因的WY-2以(CCTCC No.M202024)进行描述。
2.如权利要求1所述的菌株的获得方法，其特征在于根据从天然眼镜蛇毒中分离纯化得到的神经多肽所测定的一级结构及表达载体pET21b的酶切位点，设计引物，并用所设计的引物从已经建好的基因库进行筛选，筛选结果Nde I切点CATATGCTGGAATGCCACAACCAGCAGTCTTCTCAGACCCCGACCACCACCCGTTGCTCTGGTGGTGAAACCAACTGCTACAAAAAACGTTGGCGTGACCACCGTGGTTACCGTACCGAACGTGGTTGCGGTTGCCCGTCTGTTAAAAACGGTATCGAAATCAACTGCTGCACCACCGACCGTTGCAACAACTAATAAGAATTCEcoR I切点连接到PMD18-T，然后用Nde I和EcoR I双酶切PMD18-T-Cbt，用pET21b作载体，通过T4DNA连接酶连接，构建了重组质粒pET21b-Cbt，转化到大肠杆菌BL21中，将pET21b-Cbt菌株接种于LB(Amp抗性)中，35～37℃振荡培养至600nm下光吸收值为0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mM并在25～37℃下进行诱导表达，获得了眼镜蛇毒神经多肽在大肠杆菌中的高效表达菌株(pET21b-Cbt)，表达量为10mg/L。
全文摘要
本发明为一种从大肠杆菌中获得眼镜蛇毒神经多肽菌株及其获得方法，主要是通过从天然眼镜蛇毒神经多肽所测定的一级结构，利用基因载体pET21b，构建的重组质粒pET21b－Cbt，转化至大肠杆菌BL21中，而获得能高效表达眼镜蛇毒神经多肽的菌株。该方法具有直接表达、分离纯化工艺简便、活性高等特点。该菌株的表达产物和天然眼镜蛇毒神经多肽有同样的结构和活性，可以替代天然眼镜蛇毒神经多肽，可以满足逐渐增加的市场需求，又能保护蛇资源，是一种有应用前景的表达菌株。
文档编号C12N15/70GK1464048SQ0213331
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月18日 优先权日2002年6月18日
发明者王婉瑜, 熊郁良, 陈润强, 金扬 申请人:中国科学院昆明动物研究所