专利名称：一种血清microRNAs试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术制药领域,具体涉及ー种血清microRNAs试剂盒及其应用。
背景技术：
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，是指发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤。宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，居于女性肿瘤发病率的第二位，全球每年约有50万宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例比重高达5%，我国毎年新发宫颈癌病例约为13. 2万，属于高发区。宫颈癌的死亡率也很高，全球每年约有23万女性死于宫颈癌，我国每年约有3万女性死于宫颈癌。采取有效的诊断方法，早期诊断早期治疗，能够有效降低癌症的发生率，提闻治愈率。MicroRNAs (miRNA)是ー类长度约为22nt的非编码单链小分子RNA，miRNA基因以 单拷贝、多拷贝或基因簇等形式存在于基因组中，并且大部分定位于基因间隔区，在进化上高度保守，MiRNA的转录独立于其他基因，不具有开放阅读框(ORF)所以不翻译成蛋白质，而是在体内多种生理过程中起到调控作用，包括细胞増殖、分化、凋亡等。本实验室前期通过系统的研究发现miRNAs稳定地存在于哺乳动物的血清中。血清中稳定存在多种miRNA的发现也引起了人们对其来源和产生方式的研究和探索。目前认为血清中的miRNA与相关组织的分泌密切相关。MiRNAs具有内在的调控基因表达的功能，提不那些在肿瘤中特异性表达的miRNAs可能在肿瘤的发生和发展的过程中发挥特殊的作用，近期，在对肿瘤患者血清miRNAs变化机制的研究中发现，在肿瘤中高表达的miRNA可能发挥与癌基因相似的作用，而在肿瘤中低表达的miRNA可能与抑癌基因有相似的作用，这对于肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有指导意义。与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性、可连续体外检测等优点。构建肿瘤特异性血清microRNA表达谱，有望成为ー种基于血清检测癌症的分子标记。
发明内容
本发明的需要解决的问题是通过检测宫颈癌血清中miRNA的表达水平，筛选并鉴定能够作为宫颈癌检测标志物的血清miRNAs,进行血清miRNA检测试剂盒的研制。I.本发明首先在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的ー组miRNAs ;然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证；最后利用ROC曲线法分析其灵敏度和特异性。2.血清采集均严格按照如下步骤进行收集患者和正常人全血，在室温下3000g离心IOmin去除血细胞并收集血清，然后将收集的血清在4°C条件下，12000g离心15min，进一歩去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80°C冰箱保存待用。3. ー组由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清诊断标志物，分别是miR-21,miR-29a, miR-200a, miR-25和miR-486_5p。ROC曲线分析结果显示，对比传统血清SCC和CA125检测，血清miRNAs标志物具有高灵敏度和特异性。本发明与现有技术相比其有益效果是筛选出的疾病特异血清miRNA，进行血清miRNA检测试剂盒的研制，该芯片可以识别宫颈癌病人的发病及分级情況，实现宫颈癌早期诊断的目的。本发明的主要创新点包括血清miRNA是ー种新型生物标志物；血清miRNA监测是一种系统、全面的检测试剂盒，与组织检测方法相比，以血清作为检测样本具有取材方便、基本无创伤性，本发明采用严密、多阶段的验证和评价体系。四
图I为5种血清miRNAs在宫颈癌患者和正常人中表达存在明显差异；
图2由5种血清miRNAs组成的宫颈癌标志物的ROC曲线分析结果 图3为本发明实验设计流程 五具体实施方式
I、进行Solexa测序实验时，我们分别混合了 20例宫颈癌患者(每人2ml)和20位健康对照(每人2ml)的血清。每组混合血清的总RNA是严格按照Trizol LSReagent (Invitrogen, Carlsbad, CA)的人工操作指南提取的。I) 将收集的血清样本包括AMI组和正常对照组的血清分别进行混合，得到两组混合血清，体积均为40 ml，分别提取混合血清RNA。2) 按混合血清体积(均为40 ml) 2:1的比例加入TRIzol，用力震荡均匀后，室温静置15min，然后加入TRIzol 1/5体积的氯仿，用力震荡均匀，室温静置15min。3) 静置结束后10000 g，4°C，离心15 min，离心毕收集上清。4) 将3)中收集的上清置于除酶管子中，加入上清等体积的水饱和酚，用カ震荡均勻后 10000 g，4°C，离心 5 min。5) 离心毕，收集上清,加入上清1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿，用力震荡均勻后10000 g,4°C,离心5 min。6) 离心毕，收集上清，加入上清等体积的氯仿，用力震荡均匀后10000 g，4°C，离心5 min。7) 离心毕，收集上清，加入上清等体积的异丙醇，用力震荡均匀后在冰上沉淀I h 后 10000 g，4°C，离心 30 min。8) 离心毕，去上清，留沉淀，先用3 ml 75%的こ醇逐个清洗管子，然后用3 ml的TRIzol清洗こ醇洗涤后的管子。こ醇清洗后分装到除酶的2 ml的离心管后12000 g，4°C，离心 15 min。9) 离心毕，取沉淀，用8)中洗管壁的TRIzol分别再次完全溶解沉淀，加入Trizol 1/5体积的氯仿,混勻室温静置10 min后12000 g,4°C,离心15 min。10)离心毕，取上清，加入上清等体积异丙醇，冰上静置15 min后12000 g，4°C，离心 15 min。11)离心毕，去上清，留沉淀，用I ml 75%的DEPCこ醇加入沉淀中涡漩后12000g, 4°C,离心 15 min。12)离心毕，去上清，留沉淀，待沉淀干燥后加50 ul DEPC水至RNA完全溶解，测定RNA浓度。
2、在做RT-qPCR实验吋，我们用酚/氯仿抽提法在200 U I血清中提取RNA。13)将250 U I血清放入已除酶的I. 5 ml离心管中，加入250 U I DEPC水稀释，涡旋混匀。14)混匀毕,加入250 U I水饱和酹并剧烈震荡,室温静置两分钟,然后加入250U I氯仿，剧烈震荡在室温静置5 min后4°C，12000 g，离心5 min。15)离心毕，取上清，加入上清1/10体积的醋酸钠溶液(C=3M/L，pH=5. 3)并加入上清两倍体积的异丙醇，涡旋混匀后_20°C静置30 min,4°C, 12000 g离心20 min。16)离心毕，去上清，留RNA沉淀，加入I ml 75% DEPCこ醇，涡旋混匀，洗涤RNA沉淀，洗涤毕4°C，12000 g，离心20 min。17)离心毕，去上清，留沉淀，在室温下晾干沉淀约10 min后加入20 DEPC水， 溶解RNA沉淀。待RNA完全溶解之后放入_80°C低温冰箱留存待用。3、本文使用 TaqMan探针引物(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)利用RT-qPCR技术定量分别检测特异性miRNA和基因的表达。针对每一 miRNA均设计了ー个含相同莖环结构(stem-loop structure)的基因特异性反向引物,将所有的基因特异性反向引物混合，再进行逆转录，就可以得到含相同茎环结构的总cDNA混合物，最后再进行PCR反应。茎环结构设计可以杜绝基因特异性反向引物之间的非特异性反应的干扰，同时由于茎环序列一致，所以PCR时反向引物是通用的，正向引物则要拖长ー个尾巴以增加Tm值，通过这些实验设计的辅助，就可以成功扩增22bp左右的成熟体miRNA 了。
权利要求
1.ー种血清microRNAs试剂盒，其特征是由5种血清miRNAs组成的宫颈癌血清检测标志物，5 种标志物为 miR-21, miR-29a, miR-200a, miR-25 和 miR-486_5p。
2.权利要求I所述血清microRNAs试剂盒在宫颈癌细胞检测中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种血清microRNAs试剂盒及其应用。本发明在基因组范围内通过solexa测序筛选出在正常人和患者血清中表达存在明显差异的一组miRNAs，然后利用RT-qPCR法进行了两个阶段独立样本的复筛和验证,筛出了由5个miRNAs(miR-21,miR-29a,miR-200a,miR-25和miR-486-5p)组成的宫颈癌血清指纹谱。本发明通过ROC曲线分析，发现筛选出的这组血清miRNAs标志物对于诊断宫颈癌具有较高的灵敏度和特异性。由此制备了一种能用于宫颈癌早期检测的诊断试剂盒。所述组合、方法能够用于宫颈癌的早期检测，具有高特异性、高效性、高灵敏度、检测成本低、取材方便、样本易存放等优点。
文档编号C12Q1/68GK102864224SQ20121033365
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者项阳, 吴元赭, 贾文慧, 张辰宇, 张秦 申请人:南京大学