一种控制三角梅甜菜色素合成的新多巴双加氧酶基因的制作方法

专利名称：一种控制三角梅甜菜色素合成的新多巴双加氧酶基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个控制植物甜菜色素合成的基因及其编码产物与应用，特别是涉及一个与三角梅(Bougainvillea Spectabilis)的甜菜色素合成有关的基因及其编码产物与应用。
背景技术：
甜菜色素是一种类似于花青苷的植物次生代谢物(Lee and Collins 2001)，包括两种甜菜黄素(betaxanthin)和甜菜红素(betacyanin)，甜菜红素主要显示红色、紫色、粉色等，甜菜黄素主要表现黄色、桔色等(Grotewold 2006)。甜菜色素对植物本身的意义除了使花朵美丽吸引传粉者繁衍后代(Gandia-Herrero et al. 2005a)，和实现其花朵和果 实经济价值的重要手段(Mabry 1980)外；生理上，它的存在对植物本身抵抗逆境如干旱胁迫和过氧化胁迫也起着重要作用(Bothe, 1976 ；Stintzing et al. , 1999, 2003; Buteraet al. , 2002 ；Cai et al. , 2003 ；Sepiilveda-Jimenez, 2004)。此外，甜菜色素也具有花青素类似的抗氧化作用(Grotewold 2006),这种抗氧化作用比膜保护剂Trolox (VitE类似物)还要显著(Chrisfinet et al. 2004; Stintzing et al. 2005)。甜菜色素的这些诸多优良特性使得它已经成长为食品健康保健领域的一只新秀(Moahammer et al.2005 ；Kirsten et al. 2006),其应用已成为未来的开发热点。甜菜色素以上这些特性与花青素很多相似之处，然而到目前为止甜菜色素和花青素在自然界中分布却是排斥分布的(Stafford 1994 ；Cuenoud et al. 2002),所以甜菜色素经常被用来作为一种重要的化学分类指标(Stafford 1994 ；Cuenoud et al. 2002)。自然界中的高等植物的花和果实的颜色绝大多数是由于植物体能够合成一类属于花青素的色素，而只有石竹目(Caryophyllales)其中的9个科的植物能合成甜菜色素而不能合成花青苷(Steglich and Strack 1990 ；Clement and Mabry 1996)。这9 个科包括紫荣莉科(Nyctaginacea)、仙人掌科(Cactaceae)、黎科(Chenopodiaceae)、马齿觅科(Portulacaceae)、觅科(Amaranthaceae)、番杏科(Aizoaceae)、商陆科(Phytolaccaceae)、落奏科(Basellaceae)以及龙树科(Didiereaceae)。甜菜色素代谢虽然在自然界只占很少一部分，近年来却因其代谢产物各种优良的生理功能以及因与花青素的排斥分布之链而备受科学家的关注(Chrisf inet et al. 2004 ；Kugler et al. 2007 ；Sasaki et al. 2009 ；Brockington et al. 2011)。甜菜色素代谢机理方面的研究起步比较晚，只有最近几年有较少的报道。甜菜素合成的可能基本途径如图I。酪氨酸在酪氨酸轻化酶(tyrosine hydroxylase)的作用下形成多巴(3,4_ 二轻基苯丙氨酸)(Yamamoto et al. 2001),多巴在酪氨酸酶(tyrosinase)或一个多酹氧化酶(polyphenol oxidase)的氧化作用下形成多巴醌(dopaquinone),然后自发形成环状多巴(cyclo-dopa) (Steiner et al. 1999;Yamamoto et al. 2001)；另一合成支路是多巴在4，5-多巴双加氧酶(4，5-Dopa-dioxygenase)的作用下形成开环多巴(4，5-seco-Dopa)，环状多巴和开环多巴继而自发反应生成甜菜素的基本生色团——甜菜醛氨酸(betalamic acid) (Grotewold 2006);甜菜醛氨酸和环状多巴自发缩合形成甜菜苷配基(betanidin) (Kobayashi et al. 2001),甜菜苷配基在葡糖基转移酶(betanidin 5-0-glucosy I transferase)的作用下在C-5或者C-6位连接上糖基,形成甜菜苷(betanin)，在液泡中积累。甜菜醛氨酸在氨基酸或者胺存在条件下自发与之结合则形成甜菜黄素(Strack et al. 2003)。甜菜色素合成的开始阶段和最后阶段是酶促反应，而合成的中间环节则是自发反应(Grotewold 2006)。在甜菜色素合成途径最末端的酶是4, 5-多巴双加氧酶,该酶催化多巴形成开环多巴，环状多巴和开环多巴继而自发反应生成甜菜素的基本生色团一甜菜醛氨酸，进一步的自发反应形成各种甜菜色素。多巴双加氧酶基因最早从毒蝇伞(Amanitamuscaria)中克隆出来，该基因在翻译水平被调控，和已发表的类似酶的基因序列相似性很低(Hinz et al. 1997),由于该片段在高等植物中无法找到同源序列，2004年Chrisfinet等利用通过构建减法文库的方法在马齿觅科植物太阳花(Portulaca grandiflora)克隆出 了高等植物4，5-多巴双加氧酶基因新家族的第一个成员，命名为D0DA，该基因在系统发生学上显著区别于从毒蚬伞(Amanita muscaria)中克隆出来的多巴双加氧酶基因，该基因只在有颜色的花瓣上表达，该基因在甜菜色素合成途径中的功能通过白色花的遗传互补实验得到证实，即白色花上无表达，表明该基因是直接产生花色的关键基因。该基因与其他非甜菜色素合成被子植物中的类似物有20%-40%的同源性，与甜菜色素植物马齿苋、千日红的同源性达到60% (Chrisfinet et al. 2004)。2009年，Sasaki等在光叶子花中分离到该基因的mRNA(NCBI登录号AB435373)，同年，该研究小组又做了从5个不同的开花期的紫茉莉中的该基因在大肠杆菌中表达重组蛋白的试验，发现在花期的5个阶段，盛花期的表达最强，即花苞的颜色越鲜艳该基因的表达越高(Plant Cell Physiol. 50(5) : 1012 - 1016(2009)。由于甜菜色素和花青素颜色相似，吸收光谱也很接近，所以曾被认为是花青素，但是从合成过程来看两者是来源和结构完全不同的物质。从发现的甜菜色素合成途径的植物如仙人掌(仙人掌科)、冰叶日中花(番杏科，盐生植物)、甜菜(黎科)、盐地碱蓬(黎科，盐生植物)等多是旱生或者盐生植物这一现象来分析，甜菜色素合成途径可能与植物适应更恶劣的逆境(如极端干旱、盐分胁迫)有关，而花青素合成需要的逆境如低温和紫外辐射等相对缓和一些，而同时甜菜色素具有比花青素更强烈的抗氧化作用。因此，目前需要对甜菜色素合成的酶促反应进一步研究，为将来利用该基因，开发高效、无毒的甜菜色素来源的具有高抗氧化效果的功能型食用色素乃至保健品；也可开发在植物中抗胁迫、抗病虫害的作用。

发明内容
本发明原理在于所述4，5_多巴双加氧酶基因的表达直接导致甜菜色素的基本生色团——甜菜醛氨酸的生成。2004年Chrisfinet等通过白色太阳花的遗传互补实验证实4，5-Dopa-dioxygenase在白色太阳花中无表达,在有色彩的花中表达。2009年，Sasaki等通过大肠杆菌表达该基因重组蛋白的方法探测了紫茉莉(Mirabilis jalapa)中4，5-Dopa-dioxygenase的表达。在花期的5个阶段,时期5的表达最强，即该基因的表达越高花苞的颜色越鲜艳。发明人的研究证明，该基因在三角梅的4个开花时期中的表达特征是花苞颜色越鲜艳该基因的表达量越高。综合以上结果，表明该基因是直接产生花色的关键基因。因此，本发明第一目的是提供一种控制三角梅甜菜色素合成途径最末端的新基因BsDODA(Bougainvillea Spectabilis 4, 5-Dopa-dioxygenase),其属于新的多巴双加氧酶基因，具有或选自SEQ ID NO: I的序列。本发明第二目的是提供所述基因所编码的功能蛋白，其具有或选自SEQ ID NO:2的蛋白序列，或具有或选自SEQ ID NO: I的基因序列所编码的蛋白序列。本发明第三目的是提供所述基因或功能蛋白，在调控三角梅甜菜色素表达中的用途；利用该基因，开发高效、无毒的甜菜色素来源的具有高抗氧化效果的功能型食用色素乃至保健品；也可开发在植物中抗胁迫、抗病虫害的作用。


图I为甜菜色素生物合成途径,其中，Tyrosine :络氨酸；tyrosinase :络氨酸酶；Dopa 多巴；Dopaquinone :多巴胺;4, 5-seco-Dopa :4,5 开环多巴；cyclo_dopa :环多巴;betalamic acid :甜菜醒氨酸；3_methoxytyramine :3_ 甲氧基络氨；betanidin :甜菜红素(Grotewold 2006)；betaxanthin :甜菜黄素(Grotewold 2006)；dopa-decarboxylase :多巴
去羟基酶。图2为新4，5-Dopa-dioxygenase基因核酸序列在NCBI上中基因的blast结果，其中，图2-1为与光叶子花中该基因的核酸序列Blast比对结果，图2-2和2_3为与光叶子花中该基因的核酸序列Blast比对详细结果。图3为4，5-Dopa-dioxygenase基因氨基酸序列在NCBI上blast结果,其中头3条结果分别是与光叶子花(Bougainvillea glabra)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)和太阳花(Phytolacca americana)的比对结果(氨基酸同源性分别为94%、83%和60%)。图4为4，5-Dopa-dioxygenase基因保守区分析图。图5为4，5-Dopa-dioxygenase基因结构域功能位点预测图6为管家基因筛选的凝胶电泳图，其中左边1-4泳道为atpl在4个时期的扩增，右边1-4泳道为18S rRNA在4个时期的扩增，M为lambda Pst marker。图7为基于管家基因atp基因对线性质粒DNA做的标准曲线图。每个稀释梯度扩增2次，平均Ct值用来现行回归计算。图8 为材料 B. spectabilis ‘Splendens’(上图)和 B. pruviana ‘Mona Lisa，(下图)的4个发育时期的彩照图,其中，B. spectabilis ‘Splendens’时期I和2花荀着色非常少，时期3和4颜色非常鲜艳；B. pruviana ‘Mona Lisa’四个时期都有着色，时期I和2花苞着色较少，时期3和4颜色非常鲜艳。图 9 为 Real-time RT-PCR 检测 Bougainvillea Spectabilis 4,5-Dopa-dioxygenase 在两个材料(Bougainvillea pruviana 和 BougainvilleaSpectabilis)不同发育时期(Bpl、Bp2、Bp3、Bp4 和 Bsl、Bs2、Bs3、Bs4)的表达图。B. spectabilis ‘Splendens’时期I和2花苞着色非常少，时期3和4颜色非常鲜艳；而real-time PCR的结果也显示时期I和2该酶的表达量很低，在时期3和4表达量飙升(如图7)。B. pruviana ‘Mona Lisa’四个时期都有着色，时期I和2花苞着色较少，该基因的表达量也低，时期3和4颜色非常鲜艳，该基因的表达量也高。图10为4，5-Dopa-dioxygenase基因在紫茉莉开花的5个时期的表达。从左到右分别为时期1、2、3、4、和5。上面是MjDODA的重组蛋白图，其中时期I无表达，从时期2开始随着花苞开放程度越来越大颜色越来越鲜艳表达量也越来越高。技术效果I、本发明利用real-time技术，首次分析了本发明基因的表达模式。研究结果表明，本发明与三角梅甜菜色素合成有关的基因在苞片细胞表达，尤其在盛花期有很强表达。三角梅是一种观赏花卉，其观赏价值在于花苞的颜色，该基因的表达直接导致其生色团一甜菜醛氨酸的生成。理论上，该酶的表达应与颜色鲜艳程度直接相关，我们的试验结果印证这一猜测。Bougainvillea Spectabilis开花时期I和开花时期2花荀着色非常少，开花时期3和开花时期4颜色非常鲜艳；而real-time PCR的结果也显示在开花时期I和 开花时期2该酶的表达量很低，在开花时期3和开花时期4表达量陡升。2、利用本发明的4，5_多巴双加氧酶的新基因和蛋白，有助于研究甜菜色素的形成机理及并对开发这种高抗氧化物质并提高其合成效率具有重要意义。3、利用本发明的4，5-多巴双加氧酶的新基因和蛋白，可用于已有4，5_多巴双加氧酶的研究和应用中(如抗胁迫、抗病虫害、抗过氧化等)，以及开发高效、无毒的甜菜色素来源具有高抗氧化效果的功能型的食用色素乃至保健品。
具体实施例方式在本发明的下述实施例中，所用的实验材料均为三角梅(BougainviIIeaSpectabilis)。实施例I、与三角梅甜菜色素合成有关的基因序列的克隆利用RNA提取分离试剂盒(Trizol GibcoBRL)分离三角梅苞片中总RNA，其具体方法是收集三角梅荀片IOOmg,立即置于液氮中研磨,加入Iml Trizol试剂,充分混勻；室温放置5min ;加入O. 2ml新鲜氯仿，剧烈振摇15s,室温温育3min ；4°C, 12000g离心15min ;上清水相转移到一个新的I. 5ml离心管中，加入O. 5ml异丙醇沉淀RNA ；RNA沉淀用Iml 75%乙醇洗涤后溶于适量DEPC处理过的水中，_70°C保存备用。根据生物信息学提供的序列资料设计以下引物5，端引物(SEQ ID NO: 3) :5，-TTTACAAGGATGTCACTC-3，；3，端引物(SEQ ID N0:4) :5，-CAATAAAACTTAGGCACT-3，。具体方法是依据Plant RT-PCR Kit 2.01( TaKaRa, Japan)的用户手册进行。
l-2g总RNA (大约1-2μ 1)，和Kit的各种反转录试剂混合(MgC12 4μ I ； IORNA PCRBuffer 2 μ I ； RNase Inhibitor O.5 μ I ； RNase free Water 8.5 μ I ； dNTP Mixture2 μ I ； Reverse Transcriptase I μ I ； Oligo dT-Adaptor Ιμ )。混勻后，42。C 30min ； 99° C 5min ； 5° C 5min，完成反转录反应。吸取2 μ I反转录产物，作为模板进行PCR 反应94° C 2min 后进入扩增程序94° C Imin,50° C Imin,72° C Imin, 30 个循环后，72° C 5min。扩增得到的序列SEQ ID NO: I自起始密码子到终止密码子总长902碱基，编码298个氨基酸)，推测分子量为33. 2 kD,等电点5. 94。实施例2、新基因序列SEQ ID NO: I的同源性比对和基因功能推测
将序列SEQ ID NO: I片段与NCBI中光叶子花的4，5-Dopa-dioxygenase基因进行DNA水平、蛋白水平上的分析比对。结果显示在DNA水平上，三角梅与光叶子花(Bougainvillea glabra,NCBI 登录号 AB435373)和紫茉莉(Mirabilis jalapa,NCBI 登录号AB435372)的4，5-Dopa-dioxygenase基因的同源性分别为96. 0%和84% (见图2-1、
2-2和2-3)，在蛋白水平上，序列SEQ ID NO: 2和光叶子花、紫茉莉和美洲商陆(Phytolaccaamericana, NCBI登录号BAH66635)的4，5-Dopa-dioxygenase氨基酸序列的同源性分别为 94. 0%和 83% 和 60% (见图 3-1 和 3-2)。实施例3、新基因序列SEQ ID NO: I的功能分析
对实施例2中的光叶子花(Bougainvillea glabra，NCBI登录号AB435373)和紫茉莉(Mirabilis jalapa, NCBI 登录号 AB435372)的 4，5-Dopa-dioxygenase基因进行分析，可以得到上述三个序列均包括4，5-Dopa-dioxygenase所特有的结构，即LigB、C0G3384、PRK10628、Extradiol_Dioxygenase_3B_like> HPCD_like、CarBb> PCA_45_Doxase B_like、PRK13364、Extradiol_Dioxygenase_3B_like superfamily 等保守结构域(见图 4)。这表明以上3个基因均为4，5-Dopa-dioxygenase基因。将序列SEQ ID NO: I推测的翻译蛋白序列SEQ ID NO:2进行功能预测，所发明基因同样具有以上三个基因的相同CDs ( LigB、C0G3384、PRK10628、Extradiol_Dioxygenase_3B_like> HPCD_like、CarBb> PCA_45_Doxase B_like、PRK13364、Extradiol_Dioxygenase_3B-like superfamily),对这些结构域进行功能研究,发现蛋白序列SEQ IDNO: 2 具有 extradiol aromatic ring-opening dioxygenase 和 extradiol ring-cleavagedioxygenase 的功倉又属于 Extradiol_Dioxygenase_3B-like superfamily 超家方矣％ (见图5)。这表明所发明基因与已有的光叶子花(Bougainvillea glabra)和紫茉莉(Mirabilisjalapa)的4，5-Dopa-dioxygenase基因所翻译蛋白具有相同的保守区和结构域，因此理论上已经足以得出SEQ ID NO: I为新的4，5-Dopa-dioxygenase基因。实施例2和3中所用软件及网络资源简介■ DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应用程序EditSeq、GeneMan > GeneQuest、MapDraw > MegAlign、PrimerSelect、Protean、和 SeqManII。■ GeneQuest可以发现注释DNA序列中的基因，并提供相关的参数，包括0RF、拼接位点、转录因子结合位点、重复序列、限制性内切酶酶切位点等。通过应用“methods”命令，序列的各项相关信息和参数可以以图形的形式展示出来。■ EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进行阅读校对。■ MapDraw可以制作简单的线性图到有注释的环形图，在展示限制性酶切位点的同时，还可以同时展示序列的feature、开放阅读框及其翻译结果。MapDraw工具主要应用与规划酶切位点和克隆实验，产生详细和充分的结果概括。■ MegAlign提供了比对方法，进行DNA和蛋白质序列的配对和多序列比较。多序列比对可以在MegAlign的工作界面中进行查看和编辑。可以根据队列的结果制作进化树，有关序列距离的数据和残基替代可以作成表格。■ PrimerSelect能够辅助设计引物和探针。输入DNA、RNA或反向翻译的蛋白质模板序列后，PrimerSelect可以在计算序列的各种参数，用户可以通过控制各种参数限定计算结果。在模板处理后，PrimerSelect按照用户定义的参数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛选出模板序列上的最佳弓I物序列。■美国国家生物信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI), http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)■美国冷泉港实验室(Cold Spring Habor Laboratory, CSHL), http://clio .cshl. org/)■欧洲分子生物学信息网(European Molecular Biology Net,EMBnet),http://www. embnet. org/)■欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL),http://www.embl heidelberg.de/)■日本国立遗传研究所(National Insti tute of Genetics,NIG) ,http://www.ddb j. nig. ac. jp/)■北京大学生物信息学中心(Peking University Center of Bioinformatics,PKUCBI), http://www. cbi. pku. edu. cn/)。实施例4、Real-time RT-PCR检测基因SEQ ID NO: I的表达模式为了进一步研究基因SEQ ID N0:1能否具有类似于光叶子花或紫茉莉中4，5-Dopa-dioxygenase表达模式(即在花期的最后时期该基因表达最强，则花荀颜色越鲜艳),通过Real-time RT-PCR检测基因SEQ ID NO: I的表达模式。一、管家基因筛选选用2个基因用来筛选管家基因18S ribosomal RNA基因和Fl-ATPase alphasubunit (atpl)基因.用这2个基因对B. spectabilis ‘Splendens’不同发育时期的cDNA做PCR扩增。扩增体系包括2 μ cDNA,每条引物10 pmol, 10 nmol dNTP, 2 μ IOxPCR缓冲液和I. 25 U Taq酶，最后补水到20 μ 。扩增程序94。C下2分钟，94。C下30秒，56° C下30秒，70° C下I分钟，35个循环。最后70° C延伸10分钟。扩增片断在I. 5%的琼脂糖凝胶上分离(结果如图6所示)。其中左边1-4泳道为atpl在4个时期的扩增，右边1-4泳道为18S rRNA在4个时期的扩增，M为lambda Pst marker。用18Sribosomal RNA基因扩增的片断在B. spectabilis ‘Splendens’四个发育阶段中扩增亮度不一致，不适合用于管家基因。而atpl在B. spectabilis ‘Splendens’四个发育阶段中扩增亮度一致，适合用于管家基因。Vandesompele et al. (2002b)和 Thellin et al. (1999)等就以atpl用作管家基因定量，结果表明在几个植物的不同组织的发育阶段表达稳定。二、标准曲线比较基因在检测样品的表达量的试验中，PCR重复几次是十分必要的。PCR效率的计算是基于标准曲线的计算(Eff = 10~ (-Ι/slope) - I),也是用于计算样品cDNA的浓度。BsDODA基因(即SEQ ID NO: I)所在质粒溶液稀释成5个梯度用于做标准曲线，每个稀释梯度扩增2次。扩增结果显示R2接近0.99，Eff等于I. 1299，表明定量可靠。三、Real-timeRT-PCR 实验结果
Real-time RT-PCR 在 AB17500 (Applied Biosystems)上执行。扩增体系包括12. 5 M-I SYBR Green I Master Mix (Applied Biosystems),上下游引物各 7. 5 pmol>5μ cDNA最后加RNAase-free水至体系25 μ 。PCR条件如下50° C下运行2min，95° C下运行10 min, 95° C下运行15 sec, 60° C下运行I min,共40个循环。做溶解曲线分析的运行条件如下95° C下运行15 sec, 60° C下运行15 sec,然后95° C下运行15 sec。每个样品检测2次。分析阈值和基线的设定参考ABI User Guide。结果表明(一)甜菜色素表达的外观水平比较图8 为材料 B. spectabilis ‘Splendens，和 B. pruviana ‘Mona Lisa，的 4 个不同发育(Bpl、Bp2、Bp3、Bp4 和 Bsl、Bs2、Bs3、Bs4)的表达外观比较图。B. spectabilis‘Splendens’时期I和2花苞着色非常少，时期3和4颜色非常鲜艳，这表明表达趋势呈现 持续增强时期表达4最强，时期I最弱，但是时期I和2变化不大，到时期3有一个飞跃，直到时期4达到最强。相比之下，B. pruviana ‘Mona Lisa’四个时期都有着色,相对而言，时期I和2花苞着色较少，时期3和4颜色非常鲜艳。(二)甜菜色素表达的分子水平比较图 9 为 Real-time RT-PCR 检测 Bougainvillea Spectabilis 4, 5-Dopa-dioxygenase在两个材料(Bougainvillea pruviana 和 Bougainvillea Spectabilis)不同发育时期(Bpl、Bp2、Bp3、Bp4和Bsl、Bs2、Bs3、Bs4)的表达分子比较图。real-time PCR的结果显示B. spectabilis ‘Splendens’在时期I和2该酶的表达量很低，在时期3和4表达量飙升。然而，B. pruviana ‘Mona Lisa’四个时期都有着色，时期I和2花苞着色相对较少，该基因的表达量也低，时期3和4颜色非常鲜艳，该基因的表达量也高。对照实施例5 :紫茉莉(Mirabilis jalapa)中 4，5-Dopa-dioxygenase 的表达模式2009年，Sasaki等使用实施例2_4的相同原理，通过大肠杆菌表达该基因重组蛋白的方法探测了紫茉莉(Mirabilis jalapa)中4，5-Dopa-dioxygenase的表达。结果如图10所示,在花期的5个阶段,4，5-Dopa-dioxygenase在时期I无表达，从时期2开始随着花苞开放程度越来越大颜色越来越鲜艳，其表达量也越来越高，在时期5的表达最强，表明在紫茉莉(Mirabilis jalapa)中，4，5-Dopa-dioxygenase与控制花甜菜素和颜色深浅呈正相关趋势。综合所述,本发明旨在提供一种新的4，5-Dopa-dioxygenase,通过现有技术中对该基因来研究甜菜色素的合成表达，并开发高效、无毒的甜菜色素来源的具有高抗氧化效果的功能型食用色素乃至保健品；也可开发在植物中抗胁迫、抗病虫害、抗过氧化的作用。SEQ ID NO: I基因序列表如下atgggtgggg agaaaaaaat gaagggaaca tactacttgg cacatggtga tccaattatg60tacatcaata aatcaataaa acttaggcac tttttagaag ggtggaaaga gaatgtggta120acggagaaac ctaaatgtat tcttgtgatt tcagctcatt gggatactga tgttcccact180gttaaccttg ttgaacaatg tgataccatc catgattttg atgactaccc tgatcccttg240taccagataa agtatccagc tcctggggct ccaaaattgg caatgaaggt gcaagagcta300ttgaaaggtg gtggattcca atgtgaagtc gatacaaagc gtggacttga ccatgctgca360tggtttccac ttatgttcat gtatcctgaa gctgatattc caatttgtga gctctcaatt420
caaaccagca aggatgggac ccaccactac aatgttggga aagcactttc tcctcttttg 480aatgatgatg ttctcatcat tggctctggt ggagctgttc atccctcaga tgatactcct 540cattttccta atgatgttgc tccttgggct ttggagtttg acaattggct tgaaggtgct600cttcttagtg gaaggtatga agatgtgaaa gaattcaaaa aattggcacc aaattgggag660atatcacatc cagggcaaga gcacttgtac cctttgcatg tggctcttgg ggctgctggc720aacaacgtaa agacagagct tattcatcaa acttgggctg ccaatggcgt ctttggatat780tcctcctaca agttcacttc cacttgaaca ataaattaaa tattcatctt ttcacatttc840aataatttcc ttcttgtgtt tgctttttct ggtaatcgaa ttcccgcggc cgccatggcg900
gc902SEQ ID NO:2氨基酸序列表如下Ala Thr Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala151015Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Ala Thr Ala202530Cys Thr Ala Cys Thr Thr Gly Gly Cys Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr354045Gly Ala Thr Cys Cys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Thr Ala Cys Ala505560Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala65707580Ala Cys Thr Thr Ala Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr Ala859095Gly Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala100105110Ala Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala115120125Ala Cys Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr130135140Gly Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr145150155160Gly Gly Gly Ala Thr Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys Cys165170175Cys Ala Cys Thr Gly Thr Thr Ala Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr Thr180185190Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Thr Ala Cys Cys Ala195200205Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Gly Ala210215220Cys Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Cys Cys Thr Thr Gly
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Gly Gly Cys Gly Gly Cys900。
权利要求
1.一种控制三角梅甜菜色素合成途径最末端的新基因BsDODA(BougainvilleaSpectabilis 4, 5-Dopa-dioxygenase),具有或选自 SEQ ID NO: I 的序列。
2.权利要求I所述基因所编码的功能蛋白，其具有或选自SEQID N0:2的蛋白序列，或具有或选自SEQ ID NO: I的基因序列所编码的蛋白序列。
3.权利要求I所述基因，或权利要求2所述的功能蛋白，在研究或调控三角梅甜菜色素表达中的用途；或，利用该基因，开发高效、无毒的甜菜色素来源的具有高抗氧化效果的功能型食用色素乃至保健品的用途；或开发在植物中抗胁迫、抗病虫害、抗过氧化的作用。
全文摘要
本发明公开了一种4,5-Dopa-dioxygenase基因，该基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1。本发明还公开了相应的蛋白质多肽序列为SEQIDNO:2。本发明的基因的表达使甜菜色素合成从而赋予甜菜色素代谢植物的花苞具有颜色。本发明基因在调控三角梅甜菜色素表达中起作用；利用该基因，开发高效、无毒的甜菜色素来源的具有高抗氧化效果的功能型食用色素乃至保健品；也可开发在植物中抗胁迫、抗病虫害、抗过氧的作用。
文档编号C12Q1/68GK102827852SQ201210333378
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者徐夙侠, 林春松, 黄青云 申请人:向华