一种链霉素发酵生产l-多巴黑色素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，采用链霉菌T2-10菌株进行生产，包括如下步骤：取链霉菌T2-10菌株接种于液体培养基中，27-31℃，250-290rpm振荡培养24h制成种子液；按1％接种量将种子液接种于液体培养基中，27-31℃，250-290rpm振荡培养72-96h制成发酵液；将发酵液于4℃下，8000rpm离心15min去掉菌体等不溶物后，发酵清液采用大孔吸附树脂分离纯化，并用甲醇洗脱，烘干后即得L-多巴黑色素结晶。本发明提供的方法易于操作，生产的L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴含量较高，在食品和医疗等方面具有重要的实用价值。
【专利说明】—种链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一种链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，本发明还涉及生产的L-多巴黑色素的理化性质。
【背景技术】
[0002]天然黑色素在动、植物及微生物中均可产生。而动、植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等因素的影响，提取的色素价格昂贵，应用受到局限。微生物如放线菌、真菌和细菌均可产黑色素。微生物所产黑色素一般是由体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成L-多巴，再经一系列氧化过程而形成，属于氨基酸的衍生物，且无毒、无害。
[0003]酪氨酸酶(EC1.14.18.1，Tyrosinase)，又被称为多酚氧化酶，是一种含铜的金属酶，主要参与L-多巴黑色素的合成过程:(I)催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴；(2)氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后形成L-多巴黑色素。酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能，是L-多巴黑色素生物合成途径中的关键酶。L-多巴是一种重要的生物活性物质，可以通过血脑屏障，在脑组织中脱羧形成一种重要的神经递质——多巴胺。因此L-多巴可研制成治疗老年常见病一帕金森氏病以及其它疾病如肝昏迷、一氧化碳中毒、心力衰竭等的良药。
[0004]放线菌是土壤中的优势菌群，除极少数致病菌外，大多数放线菌具有重要的生物学意义。链霉菌是一种重要的次生代谢物产生菌种，利用链霉菌发酵生产L-多巴黑色素，具有周期短、成本低廉、生产工艺简单，便于操作，适于工业化生产等优点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在 于提供一种链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，本发明采用链霉菌(Str印tomycessp.) T2-10发酵生产L-多巴黑色素，还涉及所产L-多巴黑色素的理化性质。
[0006]本发明提供的技术方案为:
[0007]一种链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，采用链霉菌(Streptomycessp.)T2-10 (CGMCC N0.7449)菌株进行生产。
[0008]优选的是，所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法中，采用链霉菌(Streptomycessp.) T2-10 (CGMCC N0.7449)菌株进行生产还包括如下步骤:
[0009](I)种子液制备:
[0010]取所述链霉菌T2-10菌株接种于液体培养基中，27-3rC，250-290rpm振荡培养24h制成种子液；
[0011]⑵发酵培养:
[0012]按1%接种量将所述种子液接种于所述液体培养基中，27-3rC，250-290rpm振荡培养72-96h制成发酵液；
[0013](3) L-多巴黑色素的提取与纯化:[0014]将所述发酵液于4°C下，SOOOrpm离心15min去掉菌体及其他不溶物后，发酵清液采用大孔吸附树脂分离纯化，并用甲醇洗脱，50-60°C烘干后即得L-多巴黑色素结晶。
[0015]优选的是，所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述液体培养基各组分的质量百分比为:燕麦粉1.0%，可溶性淀粉3.0%，豆柏粉0.3%，大米粉0.5%，葡萄糖
0.5%,酵母粉 0.2%,酵母膏 0.1%, KNO30.2%，K2HPO40.1 %，NaCl0.1 %，MgSO40.05%和CaCO30.3%。
[0016]优选的是，所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述种子液和发酵液的培养条件为29°C，260rpm振荡培养。
[0017]优选的是，所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述大孔吸附树脂型号为X-5，粒径范围0.3~1.25rmm。
[0018]优选的是，所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述烘干条件为60°C烘4h。
[0019]优选的是，所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法中，所述L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴含量较高。
[0020]本发明的有益效果:
[0021]本发明提供一种生产L-多巴黑色素的方法，本发明使用链霉菌T2-10产L-多巴黑色素，对该菌株的发酵条件进行优化，发酵生产的L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴的含量较高；并且其生产工艺简单，操作方便；链霉菌T2-10发酵生产的L-多巴黑色素在食品、医疗和保健等方面具有重要的实用价值，并显示出广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为发酵温度对产L-多巴黑色素的影响图；
[0023]图2为转速对产L-多巴黑色素的影响图；
[0024]图3为本发明所述生产L-多巴黑色素的流程图；
[0025]图4为本发明所述L-多巴黑色素OD4citol值与质量浓度的关系；
[0026]图5为本发明所述L-多巴标准曲线图；
[0027]图6为本发明所述L-多巴黑色素的紫外-可见吸收光谱图；
[0028]图7为本发明所述L-多巴黑色素的红外光谱图；
[0029]图8为本发明所述链霉菌T2-10发酵液中酪氨酸酶活性变化；
[0030]图9为本发明所述链霉菌T2-10发酵液中OD4citol值的变化。
【具体实施方式】
[0031]下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法和试剂如无特别说明均为常规方法，所述原材料和设备如无特别说明均能从公开商业途径而得。
[0032]本发明中用于生产L-多巴黑色素的链霉菌的分类命名为链霉菌(Streptomycessp.)T2-10,该菌株属于放线菌株，已于2013年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7449。
[0033]本发明所述生产L-多巴黑色素的方法:[0034]I材料与方法
[0035]1.1液体培养基:燕麦粉10g，可溶性淀粉30g，豆柏粉3g，大米粉5g，葡萄糖5g，酵母粉 2g，酵母膏 lg，KN032g, K2HPO4Ig, NaCllg，MgSO40.5g 和 CaC033g，溶于蒸馏水中定容至1000mL后，，调节pH为7，112°C灭菌20min后备用。
[0036]1.2发酵条件确定:
[0037]发酵的温度和转速 会直接影响发酵产物的产量，因此需要寻找最适的产L-多巴黑色素的条件。
[0038]1.2.1发酵温度筛选:
[0039]将链霉菌T2-10菌株接种于装有50mL液体培养基(pH7.0)的250mL三角瓶中，于250rpm，分别放入27 °C >28 °C >29 °C >30 °C >31 V振荡培养培养96h后，离心取上清，测0D400nm值。结果如图1所示，温度明显影响黑色素的产出，29°C时，黑色素产量最大。因此，29°C是本试验发酵产L-多巴黑色素的最适温度，并且从图1中也可以看出在27-31°C范围内，所述链霉菌T2-10都能发酵生产L-多巴黑色素。
[0040]1.2.2发酵转速筛选:
[0041]将链霉菌T2-10菌株接种于装有50mL液体培养基(pH7.0)的250mL三角瓶中，分别于250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm，29°C振荡培养培养96h后，离心取上清，测OD4citol值。结果如图2所示，转速为260rpm时，产黑色素的浓度最大。因此，260rpm是本试验发酵产L-多巴黑色素的最佳转速，并且从图2中也可以看出在250-290rpm范围内，所述链霉菌T2-10都能发酵生产L-多巴黑色素。
[0042]1.3产L-多巴黑色素方法:
[0043]如图3所示，有如下步骤:
[0044]1.3.1种子液制备:
[0045]取链霉菌T2-10菌株接种于装有50mL液体培养基(pH7.0)的250mL三角瓶中，于260rpm, 29°C振荡培养24h制成种子液；
[0046]1.3.2发酵培养:
[0047]取7mL种子液，接种于装有200mL液体培养基(pH7.0)的1000mL三角瓶中，于260rpm, 29°C振荡培养96h得到发酵液。
[0048]1.3.3L-多巴黑色素的提取与纯化:
[0049]所述发酵液于温度4°C，SOOOrpm离心15min，去掉菌体和其他不溶物；采用大孔吸附树脂(型号X-5，粒径范围0.3~1.25mm)分离纯化，并用甲醇洗脱；60°C烘干4h，即得纯化的L-多巴黑色素结晶。
[0050]1.4L-多巴黑色素的理化性质研究
[0051]本发明所述链霉菌T2-10发酵液及不同L-多巴黑色素溶液中OD4citol值的测定:
[0052]如图4所示，测定不同时期(0、24、48、72、96h)发酵液和不同L-多巴黑色素溶液中的OD4tltlnm值以反映L-多巴黑色素的质量浓度。
[0053]1.4.1 溶解性
[0054]取提纯的L-多巴黑色素晶体分别溶解到pH值3、5、7、9的水及普通有机溶剂中，均按质量浓度为0.1mg.mL-1的量加入L-多巴黑色素，并充分振荡；以不加L-多巴黑色素的溶剂作为空白对照，测定所有溶液的OD4citol值，结合溶液的颜色变化，比较L-多巴黑色素在不同溶液中的溶解性。
[0055]1.4.2热稳定性[0056]将质量浓度为0.1mg.ml/1的L-多巴黑色素中性水溶液(pH值为7)置于60°C加热24h后，快速冷却至室温，测定加热前后OD4citol值的变化。
[0057]1.4.3抗氧化性
[0058]取0、0.5,1.0,1.5mL质量分数为10%的次氯酸钠溶液，分别加入到IOmL质量浓度为0.1mg.mL-1ρΗ值为7的L-多巴黑色素中性水溶液中，反应10min后测定OD4tltlnm值。
[0059]1.4.4紫外-可见吸收光谱
[0060]将所产L-多巴黑色素配成浓度为0.1mg -mL-1的水溶液，以蒸馏水作空白对照，在190-600nm进行紫外-可见吸收光谱分析。
[0061]1.4.5红外吸收光谱
[0062]将所产L-多巴黑色素按1:100比例加入KBr，混匀并压片，在红外光谱仪4000-400cm_1区间进行红外扫描分析。
[0063]1.5链霉菌T2-10所产L-多巴黑色素中L-多巴含量的测定:
[0064]1.5.1盐酸溶液配制:
[0065]取浓盐酸9mL，加水适量使成1000mL,摇匀得盐酸溶液。
[0066]1.5.2L-多巴标准液的配制及标准曲线绘制:
[0067]用盐酸溶液配制成0.1mg.ml/1的L-多巴标准液，然后用盐酸溶液稀释成0.01、
0.02、0.03、0.04、0.05、0.06mg.πι?Λ测定OD280nm值，绘制L-多巴标准曲线，结果如图5所
/Jn ο
[0068]1.5.3L-多巴黑色素溶液配制:
[0069]取L-多巴黑色素样品，称取0.lg，研细，置于IOOmL容量瓶中，加盐酸溶液适量，充分振荡使溶解，用盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，即得L-多巴黑色素溶液，测定OD28tol值，根据L-多巴标准曲线，计算L-多巴黑色素中L-多巴的含量。
[0070]1.6链霉菌T2-10发酵液中酪氨酸酶活性测定
[0071]在5mL试管中加入ImL L-多巴标准液及L 9mL0.1M的PBS缓冲液(pH值为6.8)，充分混匀，于30°C温育IOmin后，分别加入0.1mL不同时期0、24h、48h、72h、96h的发酵液，立即充分混匀；以高温灭活发酵液作为对照组，测定OD475nm值，通过OD475nm值随时间的增长直线斜率求得酪氨酸酶活性(ε =3700cm^.moF1.L)。
[0072]2结果与分析
[0073]2.1L-多巴黑色素的理化性质
[0074]2.1.1 溶解性
[0075]如表1所示，本发明得到的所述L-多巴黑色素溶于中性(pH值为7)和弱碱性(pH值为9)水,其颜色为棕褐色,微溶于pH值小于5的酸性溶液；难溶于普通有机溶剂(如乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚)，但微溶于乙酸。本发明中所述L-多巴黑色素有较好的水溶解性和热稳定性，可以更好地应用于饮料、糕点等食品及药品行业。
[0076]表1所述L-多巴黑色素的溶解性[0077]
【权利要求】
1.一种链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，采用链霉菌(Streptomycessp.) T2-10 (CGMCC N0.7449)菌株进行生产。
2.如权利要求1所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，采用链霉菌(Str印tomycessp.)T2-10(CGMCC N0.7449)菌株进行生产还包括如下步骤: (1)种子液制备: 取所述链霉菌T2-10菌株接种于液体培养基(pH7.0)中，27-3rC，250-290rpm振荡培养24h制成种子液； (2)发酵培养: 按I %接种量将所述种子液接种于所述液体培养基中，27-31°C，250-290rpm振荡培养72-96h制成发酵液； (3)L-多巴黑色素的提取与纯化: 将所述发酵液于4°C下，SOOOrpm离心15min去掉菌体及其他不溶物后，发酵清液采用大孔吸附树脂分离纯化，并用甲醇洗脱，50-60°C烘干后即得L-多巴黑色素结晶。
3.如权利要求2所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述液体培养基各组分的质量百分比为:燕麦粉1.0%，可溶性淀粉3.0 %，豆柏粉0.3 %，大米粉0.5%,葡萄糖 0.5 %，酵母粉 0.2%，酵母膏 0.1 %，KNO30.2 %，K2HPO40.1 %，NaCl0.1 %，MgSO40.05%和 CaCO30.3%。
4.如权利要求2所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述种子液和发酵液的培养条件为29°C，260rpm振荡培养。
5.如权利要求2所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂型号为X-5，粒径范围0.3~1.25mm。
6.如权利要求2所述的链霉素发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述烘干条件为60°C烘4h。
7.如权利要求2所述的链霉菌发酵生产L-多巴黑色素的方法，其特征在于，所述L-多巴黑色素水溶解性和热稳定性较好且其中L-多巴含量较高。
【文档编号】C12P1/04GK103540617SQ201310541008
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】唐选明, 丁洋, 李淑英, 聂莹 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所