可扩大的灵长类动物多能干细胞聚集体悬浮培养物及其分化的制作方法

可扩大的灵长类动物多能干细胞聚集体悬浮培养物及其分化的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可扩大的灵长类动物多能干细胞聚集体悬浮培养物及其分化。本发明涉及从未分化的或分化的胚胎干细胞单细胞悬浮液制备未分化的或分化的胚胎干细胞聚集体悬浮培养物的方法，以及其分化的方法。
【专利说明】可扩大的灵长类动物多能干细胞聚集体悬浮培养物及其分
化
[0001 ] 关于联邦政府赞助的研究或开发的声明
[0002]本发明研发期间所进行的部分工作利用了来自国立卫生研究院批准号为5R24RR021313-05的美国政府基金。美国政府享有本发明的某些权利。
发明领域
[0003]本发明涉及实质上无血清和饲养层的悬浮细胞聚集体组合物，以及用于分化该细胞聚集体悬浮液的方法。
[0004]发明背景
[0005]迄今为止,对于哺乳动物多能细胞(pluripotent cell)如本文所描述的人胚胎干细胞(hESC)，还没有提供大规模生产方法(“扩大的”)的有效系统。为了体外维持hESC处于未分化状态，一般将hESC维持在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上，并且通过人工机械解离(例如，显微解离)和转移单独的克隆碎片(pieces)来传代。这些方法对于不需要大规模生产未分化的hESC或分化的hESC的探讨性研究是足够的，基因靶向、药物开发、体外毒理学、将来的临床应用需要改进的方法以用于稳定地大规模扩增hESC，包括酶促传代。
[0006]可以实施hESC的酶促扩增，但这些方法具有技术缺陷，因为hESC的存活依赖于细胞-细胞相互作用以及 旁分泌信号和自分泌信号。因此，与以单细胞存在相比，hESC更喜欢这种细胞微环境。此外，据报道，hESC的酶促解离可以导致异常核型以及导致基因和基因外改变。因此，在长期培养周期中提供高度支持性培养环境，同时允许未分化的hESC或分化的hESC稳健地大规模扩增(即，生产过程),而不危害多能性(pluripotency)、专能性(multipotency)或遗传稳定性是必需的。
[0007]人多能细胞为研究人发育早期以及在诸如糖尿病和帕金森病的若干疾病状态中的治疗干预提供了独特的机会。例如，衍生自hESC的产胰岛素细胞的使用相对于目前利用供体胰腺细胞的细胞治疗方案将提供巨大的改进。目前糖尿病的细胞疗法治疗利用来自供体胰腺的细胞，受限于移植所需的高质量胰岛细胞的不足。一例I型糖尿病患者的细胞疗法需要移植约8χ108个胰腺胰岛细胞(Shapiro et al.，2000，NEngl J Med343:230-238;Shapiro et al., 2001a, Best Pract Res Clin EndocrinolMetabl5:241-264; Shapiro et al., 2001, British Medical Journal322:861)。这样,一次成功的移植需要至少两例健康供体器官以获得足够的胰岛细胞。
[0008]因此，hESC代表研究早期胚胎内多能细胞生物学和分化的机制的强大模型系统，以及为哺乳动物的基因操纵和由此带来的商业、医学和农业应用提供了机会。此外，hESC的适当增殖和分化能够潜在地用于生成无限制的适于移植的细胞来源，以用于治疗由细胞受损或功能失调导致的疾病。其他多能细胞和细胞系，包括国际专利申请W099/53021所述的早期原始外胚层样(EPL)细胞、体内或体外衍生的ICM/上胚层、体内或体外衍生的原始外胚层、原始生殖细胞(EG细胞)、畸胎癌细胞(EC细胞)以及通过去分化或通过核转移衍生的多能细胞，会共享这些特性和应用的部分或全部。国际专利申请W097/32033和美国专利第5，453，357号描述了包括来自除啮齿动物以外物种细胞的多能细胞。人ES细胞描述于国际专利申请W000/27995和美国专利第6，200, 806号中，以及人EG细胞描述于国际专利申请 TO98/43679 中。
[0009]人们对调节ES细胞多能性和分化的生化机制了解很少。然而，可以得到的有限的经验数据(和大量轶事证据)表明，在体外培养条件下持续维持多能ES细胞依赖于细胞外环境中细胞因子和生长因子的存在。
[0010]尽管人ESC提供了起始材料的来源，从其发展大量高质量的分化细胞用于人细胞疗法，这些细胞必须在以下条件中获得和/或培养:符合管理临床安全性和功效的预期法规性指导方针。这些指导方针可能需要利用所有组分均符合cGMP来源的培养基。这种化学限定/GMP标准条件的开发对于促进使用hESC和衍生自hESC的细胞以用于人治疗目的是必需的。
[0011]此外，基于hESC的细胞替代疗法的最终应用，需要开发使符合法规性指导方针的大规模培养和分化条件成为可能的方法。尽管几个研究组已经报道了简化的hESC生长条件，这些研究仍有显著的局限性。然而迄今为止，多能细胞的成功分离、长期克隆维持、遗传操纵和种系传递是普遍困难的。
[0012]大多数用于干细胞的细胞培养条件仍在培养基中包含血清替代物(KSR) (Xu etal., 2005Stem Cells, 23:315-323;Xu et al., 2005Nature Methods, 2:185-189;Beattieet al., 2005Stem Cells, 23:489-495;Amit et al., 2004Biol.Reprod., 70:837-845;Jameset al.，2005Development, 132:1279-1282)。KSR 包含牛血清白蛋白(BSA)的粗制组分，而不是高纯来源。其他研究组仅进行了短期研究，因此并不清楚它们的条件是否能够维持长期的多能性(Sato et al., 2004, Nature Med.，10:55-63;U.S.Patent PublicationNos.2006/0030042和2005/0233446)。其他研究组已经表明在含有FGF2、活化素A和胰岛素的化学限定培养基中多能性的长期维持，但细胞生长在包被有人血清的平板上，这些血清在细胞平板接种前被“冲 洗掉”(Vallier et al., 2005J Cell Sc1.，118 (Ptl9):4495-509)。尽管FGF2是所有这些培养基中的组分，但并不清楚其是否提供了初级或次级自我更新信号(Bendall et al.2007Nature448:1015-1027);特别是如在一些制剂中是否必需使用高浓度的 FGF2 (高达 100ng/mL, Xu et al., 2005Nature Methods, 2:185-189)。
[0013]此外，所有这些研究组在培养基中都添加了 μ g/mL水平的胰岛素，或者由于使用KSR引入胰岛素。胰岛素通常被认为在葡萄糖代谢和“细胞存活”信号转导中通过结合胰岛素受体发挥作用。然而在高于生理浓度的水平，胰岛素还能够以较低效率结合IGFl受体，并通过PI3激酶/AKT途径提供经典的生长因子活性。KSR或这些其他培养基条件中这种高水平胰岛素(yg/mL水平)的存在/需要表明，主要活性是通过结合到由hESC表达的 IGFl 受体来引发(Sperger et al.，2003PNAS, 100 (23): 13350-13355)。其他研究组已经注意到IGFlR的完全互补物以及细胞内信号转导途径成员在hESC中的表达，其可能预示着该途径的功能活性(Miura et al., 2004Aging Cell, 3:333-343) ?胰岛素或IGFl可以引发hESC自我更新所需的主要信号，如通过以下事实所提示的:所有目前开发的用于培养hESC的条件都包含胰岛素、KSR提供的胰岛素或者血清提供的IGFl。为了支持这一概念，已经表明如果PI3激酶在hESC培养物中被抑制，细胞则分化(D’ Amour et al.，2005Nat.Biotechnol., 23:1534-41;McLean et al., 2007Stem Cells25:29-38)。[0014]最近的出版物概括了 hESC的人源化限定培养基(Ludwig et al.，NatureBiotechnology, 2006 年 I 月 I 日在线公布，do1: 10.1038/nbtll77)。然而，这一最新制剂包括几种被认为影响hESC增殖的因子，包括FGF2、TGFi3、LiCl、Y -氨基丁酸和吡啶酸。注意，这一最新限定的细胞培养基也包含胰岛素。
[0015] 申请人:此前报道了基于胰岛素/IGFUheregulin、活化素A信号转导的组合的hESC的自我更新信号转导示例。参见Wang et al.2007，Bloodll0:4111 - 4119。在该文章中我们发现，外源FGF2信号是多余的且不是必需的(Schulz&Robins2009，同上)Schulz&Robins2009, (In:Lakshmipathy et al.eds., Emerging Technology Platforms for StemCells.John ffiley&Sons., Hoboken, NJ, pp.251-274) ；Heregulin 是 EGF 生长因子家族的成员。该家族有至少14个成员，包括但不限于EGF、TGF^、肝素结合-EGF(hb-EGF)、神经调节蛋白-β (还称为heregulin-β (HRG-β )、神经胶质生长因子以及其他)、HRG-α、双调蛋白、乙胞素(betacellulin)和外调蛋白。所有这些生长因子包含EGF结构域，并且通常首先表达为跨膜蛋白，其通过金属蛋白酶(特别是ADAM)蛋白加工生成可溶性胞外域生长因子。EGF家族成员以不同亲和力与ErbBl、2、3和4细胞表面受体的同源-或异源-二聚体相互作用(Jones et al., FEBS Lett, 1999，447:227-231)。EGF、TGFa 和 hbEGF 以高亲和力(1-1OOnM范围)结合ErbBl/1 (EGFR)同源二聚体和ErbBl/2异源二聚体，而HRG-β以极高亲和力(<1ηΜ范围)结合ErbB3和ErbB4。活化的ErbB受体通过PI3激酶/AKT途径以及还通过MAPK途径转导信号。ErbB2和ErbB3是hESC中最高度表达的生长因子之一 (Sperger et al.，2003PNAS，100:13350-13355)，先前已表明 HRG-β 支持小鼠原始生殖细胞的扩增(Toyoda-Ohno et al.，1999Dev.Biol.，215 (2): 399-406)。此外，ErbB2 的超表达和随后不适当的活化与肿瘤发生有关(Neve et al., 2001Ann.0ncol., 12 (Suppll):S9-13;Zhou&Hung, 2003Semin.0ncol., 30(5Suppll6):38-48;Yarden, 20010ncology, 61Supp12:1-13)。人ErbB2 (染色体17q)和ErbB3 (染色体12q)存在于据观察在一些hESC中作为三体聚集的染色体上(Draper et al., 2004Nat.Biotechnol., 22:53-4; Cowan et al., 2004NEngl.J.Med.,350 (13):1353-6`;Brimble et al., 2004Stem Cells Dev, 13:585-97;Maitraet a I.，2005Nat.Genet.37:1 099-1 03;Mita Iipova et al., 2005Nat.Biotechnol.23:19-20;Draper et al., 2004Stem Cells Dev., 13:325-36;Ludwig etal., Nature Biotech, 2006 年 I 月 I 日在线公布，do1: 10.1038/nbtll77)。
[0016]ErbB2 和 ErbB3(Brown et al., 2004Biol.Reprod., 71:2003-11;Salas-Vidal&Lomeli,2004, Dev Biol., 265:75-89)表达在小鼠胚泡中，尽管并不特异性局限于内细胞团(ICM),而 ErbBl、EGF 和 TGF β 表达在人胚泡中(Chia et al., 1995Development, 1221 (2):299-307)。HB-EGF 在人 IVF 胚泡培养中具有增殖效应(Martin et al.，1998Hum.Reprod., 13:1645-52;Sargent et al., 1998Hum.Reprod.13(Suppl4):239-48),对生长在15%血清中的小鼠ES细胞具有适度的额外效应(Heo et al.，2006, Am.J.Phy.Cell Physiol.，290: C123-33，Epub2005Augl7)。移植前和移植后早期的发育看起来在 ErbB2-/-，ErbB3-/-，神经调节蛋白 1-/-(Britsch et al., 1998Genes Dev.，12:1825-36)，ADAM17-/-(Peschon, et al.，1998Science,282:1281-1284)和ADAM19-/-(Horiuchi, 2005Dev.Biol., 283 (2):459-71)无效胚胎中不受影响。因此，hESC中通过ErbB受体家族转导信号的重要性至今并不清楚。[0017]神经调节蛋白-1(NRGl)是展示多重剪接和蛋白加工变体的大基因。这产生了大量的蛋白同种型，其在本文统称为神经调节蛋白。神经调节蛋白主要表达为细胞表面跨膜蛋白。细胞外区域包含免疫球蛋白样结构域、糖类修饰区域和EGF结构域。以前已经对NRGl表达同种型做过综述(Falls, 2003Exp.Cell Res.，284:14-30)。已表明，细胞膜金属蛋白酶ADAM17和ADAM19将神经调节蛋白-1的跨膜形式加工为可溶性神经调节蛋白/heregulin。HRG-α和-β是神经调节蛋白切割的胞外结构域，包含EGF和其他结构域。因为EGF结构域负责ErbB受体的结合和活化，因此仅包含该结构域的重组分子就能够展示该蛋白基本上全部的可溶性生长因子效应(Jones et al., 1999FEBS Lett.，447:227-31)。此外，存在神经调节蛋白的经加工的跨膜同种型，其被认为在邻近细胞中通过EGF结构域与ErbB受体的相互作用触发近分泌(juxtacrine)信号转导。
[0018]在hESC研究进展中在培养物中维持多能性方面的重要发展还将阐明符合预期的管理临床安全和功效的法治性指导方针的培养基和细胞培养条件。尽管最好的结果是化学限定的hESC培养基的可利用性，但如果其生产符合GMP标准，化学上未限定的组分是可接受的。因此，需要鉴定用于培养和稳定能够用于治疗目的的多能干细胞群的方法和组合物，其中所述培养组合物的限定和/或生产符合GMP标准。
[0019]生产能够在移植后起作用的定向祖细胞或分化细胞类型，是基于hESC的治疗研究潜力的主要前景。使用分步方案，尤其与本文、 申请人:此前的专利和非专利出版物中所述的基本上相似的4-阶段分步方案，本文中也称为灵长类动物的多能干细胞(pPSC)例如，hESC或iPSC是可分化细胞，其可在第4阶段结束时定向分化为混合的胰腺型细胞群。所述细胞混合物至少包含通常称为“胰腺祖细胞”，或“胰腺内胚层”或“胰腺上皮细胞”的细胞，二者也称为“PE”或“PDX1-阳性胰腺内胚层”或“胰腺内胚层细胞”或“PEC”或其等同物。
[0020]PEC细胞组合物已经得以充分的表征，如 申请人:此前的专利和非专利申请所描述，包括但不限于，Kroon et al.2008Nature Biotechnology26:443_52,美国专利第7，534，608号、第7，695，965号和第7，993，920号(名称:体内制备胰岛素的方法(METHODSFOR MAKING INSULIN IN VIVO))，以及第8，278，106号(名称:源自人多功能干细胞的胰腺细胞的封装(ENCAPSULATI ON OF PANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENTSTEM CELLS))，这些都以引用的方式全部并入本文。使用流式细胞仪，从PEC的多于10个不同发育组(lots)定量20多个样品，显示了如下的细胞类型。细胞混合物约50%(范围33-60%)由表达NKX6-1而非嗜铬粒蛋白(CHGA)的细胞组成。约44%(范围33-62%)的聚合-激素内分泌细胞表达CHGA。已表明CHGA阳性细胞在体内移植或植入后发育并成熟为表达胰高血糖素的细胞。约7%(范围1.3-13%)表达I3DXl的同时不表达CHGA或NKX6-1(仅为I3DXl群)。混合物或群体中非常少量的细胞，约1%(范围0.27-6.9%)不表达上述任何标志物:既非roxi，也非NKX6-1或CHGA(或三阴性细胞)。因此，PEC或其等同物是指这类细胞的混合物或群体。PEC组合物或群体还更详细地描述于实施例27和表12。Kroon etal.2008,(同上)；Schulz et al.2012，(同上);其内容通过引用的方式全部并入本文。
[0021]植入的PEC (包封或未包封的)通过一种机制在体内产生功能性的胰岛样结构，该机制看上去主要涉及胰腺祖细胞重新定向为内分泌谱系，然后进一步成熟为响应葡萄糖的β -细胞。因此，在小鼠中这样的移植能够感知血糖，对加工后的人胰岛素的计量释放产生响应，并预防链脲霉素(STZ)-诱导的高血糖症。参见Kroon et al.2008，(同上)。[0022]尽管已从hESC衍生出其他候选的胰腺谱系，它们都没有在体内显示出实质上的移植后功能，如同长期响应葡萄糖的人C-肽分泌和预防STZ-诱导的高血糖症所限定的。没有在动物模型中显示出功能，就很难估计这些替代方案的可扩大性或临床潜力。参见 Cai J.et al.2009J Mol Cell Biol2:50-60; Johannesson et al.2009PLoS0ne4:e4794;Mfopou et al.2010Gastroenterologyl38:2233-2245;Ungrin etal.201IBiotechnol Bioeng.Dec2.do1:10.1002/bit.24375;Clark et al.2007BiochemBiophys Res Commun356:587-593; Jiang et al.2007Cell Resl7:333-344;以及 Shim etal.2007Diabetologia50:1228-1238，其通过引用全部并入本文。
[0023]本文所描述的发明是继 申请人:此前所证明的之后进行的，即使用限定培养基的无饲养层条件能够支持单细胞传代和hESC的大量培养。参见Schulz&Robins2009，
(同上)；和美国专利第8，278，106号(名称:源自人多功能干细胞的胰腺细胞的封装，ENCAPSULATION OFPANCREATIC CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS)，它们均通过引用的方式全部并入本文。基于hESC的技术进展到临床试验的关键是相当的可扩大性的证明。提高扩增效率的改善也将节省时间并节约生产费用，以及使随培养时间发生群漂移的可能性最小化。参见Maitra et al.2005Nat Genet37:1099-1103，其通过引用的方式全部并入本文。重要的是，使用本文所述的滚瓶按比例缩放，例如与hESC的低温储藏一起提供了确定和一致的用于产品生产的材料，以用于近期和长期的研究和开发战略。
[0024]发明概述
[0025]本发明涉及包含基础盐营养液和ErbB3配体的组合物，该组合物实质上无血清。
[0026]本发明还涉及包含基础盐营养液的组合物以及用于在可分化的细胞中刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶活性的手段。
`[0027]本发明涉及培养可分化细胞的方法，该方法包括将可分化的细胞接种于细胞培养表面，给可分化的细胞提供基础盐营养液以及提供特异结合ErbB3的配体。
[0028]本发明涉及培养可分化的细胞的方法和用于在可分化的细胞中刺激ErbB2_定向的酪氨酸激酶活性的手段，该方法包括将可分化的细胞接种于细胞培养表面，并给可分化的细胞提供基础盐营养液。
[0029]本发明还涉及培养可分化细胞的方法，该方法包括给在消化前包含在培养室中的可分化细胞层提供消化液，其中消化将细胞层分散为单个细胞。消化后，将单个细胞置于含有可分化细胞培养液的新组织培养室中，其中可分化细胞培养液包含基础盐营养液和ErbB3配体。一旦培养，将单个可分化的细胞置于允许单个细胞生长和分裂的条件下。
[0030]本发明涉及用于通过以下方式从多能hES贴壁培养物生成hES细胞悬浮聚集体的方法:在允许以未分化状态扩增的贴壁生长培养条件下培养hES ;将贴壁hES培养物解离为单细胞悬浮培养物；使单细胞悬浮培养物与允许通过搅动单细胞悬浮培养物形成hES衍生细胞悬浮聚集体的第一分化培养条件接触，直至单细胞悬浮培养物形成hES衍生细胞悬浮聚集体的这一时间段，由此生成hES衍生细胞悬浮聚集体。在优选的实施方案中，单细胞悬浮培养物的搅动通过以约80rpm至160rpm的旋转来实施。
[0031 ] 本发明还涉及用于通过以下方式从hES衍生单细胞悬浮液生成hES衍生细胞悬浮聚集体的方法:在允许以未分化状态扩增的贴壁生长培养条件下培养hES细胞；使未分化的hES与适于分化hES细胞并导致贴壁hES衍生细胞形成的第一分化培养条件接触；将贴壁hES衍生细胞解离为单细胞悬浮培养物；使单细胞悬浮培养物与允许通过搅动单细胞悬浮培养物形成hES衍生细胞悬浮聚集体的第二分化培养条件接触，直至单细胞悬浮培养物形成hES衍生细胞悬浮聚集体的这一时间段，以及由此生成hES衍生细胞悬浮聚集体。在优选的实施方案中，单细胞悬浮培养物的搅动通过以约80rpm至160rpm的旋转来实施。
[0032]本发明涉及包含灵长类多能干细胞(pPSC)悬浮聚集体的滚瓶。在本发明的某些方面，所述PPSC聚集体为选自人胚胎干细胞(hESC)、诱导的多能干细胞(iPSC)和/或其他人多能干细胞的细胞。在一个实施方案中，所述滚瓶是不透气的，但根据培养箱或烘箱的能力可以是透气的。
[0033]本发明还涉及产生包含pPSC聚集体的滚瓶的方法，其通过将pPSC与多能干细胞培养条件接触，并搅动培养物直至形成PPSC聚集体，从而在滚瓶中产生PPSC聚集体。在某些实施方案中，所述pPSC培养物的搅动通过以约3rpm、约4rpm、约5rpm、约6rpm、约7rpm、约 8rpm、约 9rpm、约 1 Orpm、约 1Irpm、约 12rpm、约 13rpm、约 14rpm、约 15rpm、约 16rpm、约17rpm、约 18rpm、约 19rpm、约 20rpm、约 21rpm、约 22rpm、约 23rpm、约 24rpm、约 25rpm、约26rpm、约27rpm、约28rpm、约29rpm和约30rpm的旋转来实施。通常,所述pPSC培养物的揽动以约5rpm、约6rpm、约7rpm、约8rpm、约9rpm、约lOrpm、约Ilrpm和约12rpm的旋转来实施。
[0034]本发明的另一方面涉及在滚瓶中使pPSC聚集体分化的方法，其通过将可分化的或未分化的PPSC聚集体与使PPSC聚集体分化的培养条件接触，并搅动所述PPSC聚集体培养物直至形成PPSC衍生聚集体，从而在滚瓶中产生pPSC衍生悬浮聚集体。在一些实施方案中，所述pPSC衍生聚集体悬浮培养物的搅动以约3rpm、约4rpm、约5rpm、约6rpm、约7rpm、约 8rpm、约 9rpm、约 I Orpm、约 I Irpm、约 12rpm、约 13rpm、约 14rpm、约 15rpm、约 16rpm、约17rpm、约 18rpm、约 19rpm、约 20rpm、约 21rpm、约 22rpm、约 23rpm、约 24rpm、约 25rpm、约26rpm、约27rpm、约28rpm、约29rpm和约30rpm的旋转来实施。通常所述pPSC培养物的搅动以约5rpm、约6rpm、约7rpm、约8rpm、约9rpm、约lOrpm、约IIrpm和约12rpm的旋转来实施。
[0035]本发明又一个实施方案涉及方法，其中滚瓶型容器中的液流涉及无需旋转或滚动瓶子的滚动。在一个实施方案中，在没有使用滚动容器的情况下，滚动型运动被基本上重建。在一个实施方案中，例如，通过泵送或使流体以小或无湍流的有序方式平稳流动，赋予灵长类动物多能干细胞培养物流体运动。在这类实施方案中，任何子流通常以与相邻子流并行的方式流动。这种运动方式也被表征为层流(通常用于驱动粘性流体，尤其是那些以低流速流动的流体)或流线流(流体运动的稳定运动)。在又一个实施方案中，流体运动涉及一个或多个挡板，其分配腔室内的液流以产生连续的、均匀的细胞悬浮液。在又一个实施方案中，流体运动涉及导流板(deflector plate)、分配通道和/或流动通道之一或组合。在每个实施方案中，培养容器上包括至少一个或多个密封物(seal)以确保在细胞聚集、生长和分化期间容器内的无菌环境。
[0036]本发明还涉及通过优化多能细胞培养物的细胞密度或改变多种生长因子的浓度来富集或改变得到的hES衍生细胞聚集悬浮液的细胞培养物和/或细胞群的方法，所述多种生长因子例如FGF10、EGF、KGF、头蛋白和视黄酸、凋亡抑制剂、Rho-激酶抑制剂等。
[0037]据此，本申请还涉及以下方面或保护的主题。[0038]主题1.滚瓶，包含悬浮于生理上可接受的培养基中的灵长类动物多能干细胞(pPSC)聚集体培养物。
[0039]主题2.根据主题I所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体的直径为约100-300微米。
[0040]主题3.根据主题I所述的滚瓶，其中所述培养物中基本上无直径大于300μΜ的pPSC 块。
[0041]主题4.根据主题I所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体表达至少一种选自0CT4、NANOG, SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-80 和 Tra-1-60 的标志物。
[0042]主题5.根据主题I所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体为人细胞。
[0043]主题6.根据主题5所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体选自人胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。
[0044]主题7.根据主题I所述的滚瓶，其中所述灵长类动物多能干细胞衍生的悬浮细胞聚集体通过包括以下的方法产生:
[0045]a.提供未分化的pPSC的培养物；
[0046]b.将所述未分化的pPSC接种到滚瓶的能支持所述pPSC的未分化生长的培养基中；以及
[0047]c.低转速搅动所述pPSC以形成pPSC聚集体。 [0048]主题8.根据主题7所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体的直径为约100-300微米。
[0049]主题9.根据主题7所述的滚瓶，其中所述培养物中基本上无直径大于300微米的pPSC 块。
[0050]主题10.根据主题7所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体表达至少一种选自0CT4、NANOG, SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-80 和 Tra-1-60 的标志物。
[0051]主题11.根据主题7所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体为人细胞。
[0052]主题12.根据主题11所述的滚瓶，其中所述pPSC聚集体选自人胚胎干细胞(hESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)。
[0053]主题13.根据主题7所述的滚瓶，其中所述转速为约3至约20rpm。
[0054]主题14.根据主题7所述的滚瓶，其中所述转速为约5至约12rpm。
[0055]主题15.根据主题7所述的滚瓶，其中步骤a中的未分化的pPSC培养物为单细胞pPSC的悬浮液。
[0056]主题16.制备主题I所述的滚瓶的方法，所述方法包括:
[0057]a.提供未分化的pPSC的培养物；
[0058]b.将所述未分化的pPSC接种到滚瓶的能支持所述pPSC的未分化生长的培养基中；以及
[0059]c.低转速搅动滚瓶中的单细胞悬浮液以形成pPSC细胞聚集体，
[0060]从而制备包含悬浮于生理上可接受的培养基中的pPSC聚集体培养物的滚瓶。
[0061]主题17.根据主题16所述的方法，其中所述未分化的pPSC培养物为单细胞pPSC的悬浮液。
[0062]主题18.根据主题16所述的方法，其中所述未分化的pPSC培养物为悬浮于培养基中的解冻pPSC的悬浮液。
[0063]主题19.根据主题16所述的方法，其中所述转速为约3至约20rpm。[0064]主题20.根据主题16所述的方法，其中所述转速为约5至约20rpm。
[0065]主题21.根据主题16所述的方法，其中所述转速为约5至约12rpm。
[0066]主题22.根据主题16所述的方法，其中所述pPSC为人细胞。
[0067]主题23.根据主题22所述的方法，其中所述pPSC选自hESC和iPSC。
[0068]主题24.使滚瓶中的灵长类动物多能干细胞(pPSC)分化的方法，所述方法包括:
[0069]a.提供未分化的pPSC的培养物；
[0070]b.低转速搅动滚瓶的生理上可接受的培养基中的所述pPSC，以形成pPSC聚集体，以及
[0071]c.使滚瓶中的所述pPSC聚集体与能使所述pPSC分化形成分化的细胞聚集体的培
养基接触，
[0072]从而使滚瓶中的pPSC分化。
[0073]主题25.根据主题24所述的方法，其中所述pPSC在无饲养层、无基质和无贴壁生长培养物的环境中分化。
[0074]主题26.根据主题24所述的方法，其中所述转速为约3至约20rpm。
[0075]主题27.根据主题24所述的方法，其中所述转速为约5至约20rpm。
`[0076]主题28.根据主题24所述的方法，其中所述转速为约5至约12rpm。
[0077]主题29.根据主题24所述的方法，其中所述pPSC为人细胞。
[0078]主题30.根据主题29所述的方法，其中所述pPSC选自hESC和iPSC。
[0079]附图简述
[0080]图1 描绘了生长于限定条件(8ng/mL FGF2、100ng/mL LR-1GFl Ung/mL 活化素 A)下的BGOlv中的ADAM19、神经调节蛋白I和ErbBl_3的实时RT-PCR表达分析。显示了 GAPDH和0CT4对照反应。
[0081]图2描绘了利用AG879对BGOlv细胞增殖的抑制。BGOlv细胞接种于6_孔盘中，并在平板接种后 24 小时暴露于 DMSO(A)、50ηΜ-20 μ M AG1478 (B)或 100mM-20 μ M AG879 (C)。培养5天后，将培养物固定并进行碱性磷酸酶活性染色。AG1478在这些浓度(B中显示的20 μ Μ)下看起来不影响增殖，但AG879在5μΜ(0显著减慢细胞生长。
[0082]图3描绘了培养在DC-HAIF中和限定培养基(DC)中的BGOlv细胞的形态学，DC-HAIF 是含有 10ng/mL HRG-β UOng/mL 活化素 A、200ng/mL LR-1GFl 和 8ng/mL FGF2 的限定培养基(A和B)，限定培养基(DC)含有10ng/mL HRG-β、10ng/mL活化素A和200ng/mL 的 LR-1GFl (C 和 D)。
[0083]图4描绘了 ADAM19、神经调节蛋白I和ErbBl_4通过RT-PCR在小鼠ES细胞(A)和MEFs⑶中的表达.[0084]图5描绘了 ErbBl和ErbB2信号转导在小鼠ES细胞中的抑制。将2xl05个小鼠RlES 细胞在 10%FBS, 10%KSR 与 1000U/mL 小鼠 LIF(ESGRO)中接种于 1:1000MATRIGEL? 上。第二天，DMSO (载体对照)、1-50 μ M AG1478或1_50 μ M AG879随新鲜培养基加入。第8天固定培养物，并进行碱性磷酸酶活性染色。DMSO(A)和1-50 μ MAG1478 (B和C)没有明显抑制增殖。AG879在50 μ M显著抑制细胞生长(比较D和F)，以及在20 μ M (E)可能已减缓增殖。
[0085]图6描绘了生长在条件培养基(CM)中的BG02细胞增殖的抑制。(A) 50 μ M AG825抑制生长在CM中的BG02hESC的增殖。(B)AG825抑制hESC中ErbB2Y1248磷酸化。(C)CyT49hESC在生长因子不同组合中连续传代的集落计数。(D)利用BG02细胞(左侧)，IGFl和HRG在hESC增殖中的作用的细胞计数分析。(E)两次重复实验的0CT4/DAPI免疫染色表明，IGFl和HRG相比于ActA/FGF2条件显著增加0CT4+细胞的比例。(F)显示了无生长因子过夜、饥饿然后用DC-HAIF脉冲15分钟或者稳定状态培养物的BGOIDC-HAIF hESC的RTK免疫印迹分析(左侧)。对标准化的相对强度的均值和范围作图(右侧)。
[0086]图7描绘了生长于含有不同生长因子组合的限定条件中的小鼠ES细胞。㈧显示了 2xl05个细胞生长在不同的生长因子组合8天后AP+集落的得分。(B-G)显示了生长在不同生长因子组合的AP+集落的4x放大图像。
[0087]图8描绘了维持在DC-HAIF培养基中的人ES细胞的特征。(A)来自BG02DC-HAIFP25细胞的畸胎瘤分析，证实了向外胚层、中胚层和内胚层的多能分化潜力。(B)培养于15%FCS/5%KSR的已分化的BG02细胞的免疫染色。(C)利用含有47296个转录探针的高密度Illumina Sentrix Human_6Expression Beadchips 在 BG02 细胞中检测到的转录物分布的维恩图，BG02细胞维持在CM (64代)或DC-HAIF (在限定培养基中的10或32代)中。(D)证实BG02DC-HAIF p32细胞的转录图谱的散点图分析与维持在CM (上侧)中的BG02细胞的散点图高度相似，并且在DC-HAIF早期和后期传代培养物中没有显著变化(下侧)。(E)利用Beadstudio软件生成的在不同群中相对基因表达的分级群聚(Hierarchical clustering)系统树图。
[0088]图9描绘了在DC-HAIF培养基中培养在人源化细胞外基质(ECMs)上的细胞的形态。(A)生长在生长因子简化的MATRIGEL?(以1:200稀释)上的CyT49细胞(以1:200稀释)。CyT49细胞还能够生长在包被有(B)全人血清、(C)人纤连蛋白和(D)VITR0GR0?的
组织培养皿中。
[0089]图10描绘了人ES细胞的单细胞传代。(A-D)用ACCUTASE?传代并以约5x105细胞接种于60mm培养皿后，BG 02细胞的分期成像。(A)初次平板接种后1.5小时，显示粘附于培养皿的活细胞。(B)在平板接种后20小时，大多数细胞聚集形成小集落。这些集落到平板接种后第4天通过增殖扩增(C)，以及5-6天的过程形成覆盖整个培养皿的上皮样单层(D)。(E)在DC-HAIF中用ACCUTASE?传代19次的BG02培养物显示的正常雄性核型。
[0090]图11 描绘了利用(A) ACCUTASE?、(B)0.25% 胰酶 /EDTA、(C) TrypLE 或(D)维尔烯(Versene)的人ES细胞的单细胞传代后的细胞形态。
[0091]图12描绘了培养在DC-HAIF中的人ES细胞的大规模生长。(A)扩增至>1010细胞后的BG02细胞的流式细胞术分析。>85%的细胞表达0CT4、CD9、SSEA-4、TRA-1-81。(B)多能性 0CT4、NANOG、REXl、S0X2、UTFl、CRIPTO、F0XD3、TERT 和 DPPA5 的标志物表达的 RT-PCR分析。没有检测到分化的谱系的标志物α-甲胎蛋白(AFP)、MSX1和HANDl。(C)利用人染色体特异性重复的荧光原位杂交(FISH)证实了 hChrl2、17、X和Y正常拷贝数的维持。
[0092]图13描绘了生长在包含HRG-和IGFl但缺乏FGF2的限定培养基中达7代或者大于2个月的hESC BG02细胞的形态(A)和正常核型(B)。
[0093]图14描绘了来自维持在DC-HAIF (32代)或DC-HAI(l(Hf)中的hESC(BG02)的转录物的散点图分析。在两种样品中都检测到了大比例的表达的转录物，转录并没有通过在缺乏外源性FGF2下培养hESC而显著改变。利用所有表达水平>0的检测到的转录物(所有点)，或者利用显示检测置信度水平>0.99 (R2选择，由虚椭圆形显示的点)的转录物生成相关系数(R2)。成角度的线显示了 2-倍差异的均值和极限。
[0094]图15描绘了在不同群的维持在DC-HAIF中的早代和晚代BG02细胞中的相对基因表达的分级群聚系统树图。细胞紧密聚集(~0.0075)，并与维持在条件培养基(CM)(~
0.037)的BG02和BG03细胞保持接近相似。维持在DC-HAI中的BG02细胞还与其他检测的hESC群紧密聚集。作为图15的解释，CM是条件培养基；DC是限定培养基，DC-HAIF如上文定义；ap是ACXUTASE?单细胞传代；DC_HAI与本文定义的DC-HAIF相同，除了没有FGF2外。
[0095]图16描绘了培养在96孔和384孔板中的DC-HAIF中的BG02细胞的形态和碱性磷酸酶染色。生长在96孔板的一孔中的BG02细胞(104细胞/孔)的(A)相衬成像(phasecontrast imaging)和(B)碱性磷酸酶染色。生长在384孔板的一孔中的BG02细胞(103细胞/孔)的(C)相衬成像和(D)碱性磷酸酶染色。
[0096]图17描绘了生长于DC-HAIF悬浮培养中的BG02的暗场图像。显示了第2天和第6天的培养物。利用4x放大捕获图像。
[0097]图18描绘了在DC-HAIF中的贴壁和悬浮培养物的生长率。将1x106BG02细胞接种于贴壁和悬浮培养的平行孔中，在第1-6天进行细胞计数。
[0098]图19描绘了悬浮和贴壁hESC的qPCR分析。悬浮(S.hESC)和贴壁(hESC)培养生长的BG02细胞显示了可比较水平的0CT4，并且缺乏S0X17表达。分化为定形内胚层(DE)的贴壁细胞以及分化为 悬浮的定形内胚层(S.DE d3)的悬浮hESC两者均展示了预期的0CT4的显著下调和S0X17表达的上调。
[0099]图20描绘了在Y27632存在下、在悬浮培养中hESC聚集的增强。将2x106个BG02细胞在6孔托盘中接种在3mL DC-HAIF或DC-HAIF+Y27632中，托盘置于在IOOrpm旋转平台上的孵育器内。在第I和第3天捕获聚集体的图像。
[0100]图21描绘了悬浮聚集体在Y27632存在下的RT-PCR分析。对扩增的培养物实施RT-PCR 以评价多能性标志物的表达。检测到 0CT4、NAN0G、REX1、S0X2、UTF1、CRIPT0、F0XD3、TERT和DPPA5的表达，而分化的谱系AFP、MSXl和HANDl的标志物没有检测到。
[0101]图22A-N是条形图，显示了标志物基因0CT4(图面A),BRACH (图面B)、S0X17(图面C)、F0XA2 或 HNF3 β (图面 D) ,HNFl β (图面 E) ,PDXl (图面 F)、ΝΚΧ6.I (图面 G)、ΝΚΧ2.2 (图面 H)、INS (图面 I)、GCG (图面 J)、SST (图面 K)、S0X7 (图面 L)、ZICl (图面 Μ)、AFP (图面N)、HNF4A(图面O)和PTFlA(图面P)的表达模式，这不是穷尽的列举，仅是可以用于鉴定多能人胚胎干(hES)细胞(阶段0，d0(0天))、定形内胚层细胞(阶段I ;d2(第2天))、PDXl-阴性前肠内胚层细胞(阶段2 ；d5) ,PDXl-阳性内胚层细胞(阶段3，d8)、胰腺内胚层细胞(阶段4 ；dll)、胰腺内分泌前体细胞和/或激素分泌细胞(阶段5;dl5)的标志物。
[0102]图23为显示细胞悬浮聚集体相对于培养时培养基总体积(mL)的直径范围(微米)的图。
[0103]图24A-D是条形图，显示了 hES衍生细胞中的标志物基因I3DXl (图面A)、NKX6.1 (图面B)、NGN3 (图面C)和NKX2.2 (图面D)的表达模式，该表达模式与衍生它们的hES细胞培养物的细胞密度有关。
[0104]图25显示了多能细胞的细胞聚集体在第O天(d0)时和分化细胞聚集体在第2天、第5天、第8天和第12天(分别为d2、d5、d8和dl2)时的直径。对细胞聚集体大小进行了测量并绘图，显示了最小值、最大值、第二和第三四分位数以及中值。在每一天都显示了由IxlO6细胞/mL (左边)和2xl06细胞/mL (右边)形成的细胞聚集体的图。
[0105]图26A-D是条形图，显示了滚瓶式容器中多种指出的标志物基因的表达模式。每张图的左边样品表示6孔盘中形成的第O天(d0)细胞聚集体(多能细胞标志物对照)。由棒标示的样品表示(从左至右)--第O天时的未分化的聚集体以及第2天、第5天、第8天和第12天时的分化聚集体。黑线，IxlO6细胞/mL的滚瓶；黑色虚线，2xl06细胞/mL密度的滚瓶；灰线，6孔盘。
[0106]图27A-D是条形图，显示了如实施例27的表11和表12中所述的较大滚瓶式容器中的多种指出的标志物基因的表达模式。左边样品表示6孔盘hESC聚集和分化(对照；图27A);显示了第O天、第2天、第5天、第8天和第12天时透气(V)或不透气的(NV)490cm2滚瓶(约1.2L容积)中的分化。由于培养物损失，没有收集最后的490V样品的第2天的样品(最右栏)。每个滚瓶分化都使用了相同的d0对照(标有星号)。
[0107]发明详述
[0108]与先前已知的基于将单独的细胞接种在多聚物支架、基质和/或凝胶的组织工程学方法相比，本文描述的方法使用从多能hES单细胞悬浮液或hES衍生的(分化的)单细胞悬浮液形成的细胞聚集体悬浮液作为组织形成的基础材料。细胞聚集体经常包含成百上千个单独的细胞，其通过共同促成最终分化产物的连接粘附和细胞外基质而连接。在这方面，细胞聚集体可以定义为，相对于更传统的工程化组织提供了许多性能优势的一种组织类型。
[0109]在本发明的一个实施方案中，提供了用于从多能干细胞培养物或hES衍生细胞培养物的单细胞悬浮液产生hES聚集体悬浮液的方法。多能干细胞可以最初培养在成纤维细胞饲养层上，或者它们可以是`无饲养层的。解离hESC以及在人饲养层细胞上培养hESC的方法描述于题目为 “METHODS FOR THE CULTURE OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS ON HUMANFEEDER CELLS (在人饲养层细胞上培养人胚胎干细胞的方法)”的美国第7，432，104号专利中，该专利通过引用的方式以其整体并入本文。直接制备的或从培养于饲养层上的hESC启动的多能ES细胞聚集体悬浮培养物避免了对制备hESC单层的需求，例如，如在贴壁培养物中。这些方法详细描述于实施例17和18中。
[0110]本发明的其他实施方案提供了直接在分化培养基内产生细胞聚集体悬浮液的方法，分化培养基例如含有试剂的分化培养基，所述试剂优选TGF β家族成员，其能够活化TGF^受体家族。这种试剂包括但不限于活化素.(Activin) Α、活化素B、⑶F-8、⑶F-1l和Nodal。在分化培养基中产生细胞聚集体悬浮液的方法不同于本文描述的其他方法，其提供了在多能干细胞培养基，例如StemPro中产生细胞聚集体悬浮培养物。
[0111]本法明的其他实施方案提供了产生细胞聚集体悬浮液的方法，该悬浮液从分化的hES细胞培养物(也被称为“hES衍生的细胞培养物”或“hES衍生的细胞”)形成，例如，在前面 D’ Amour et al.2005,(同上)和 D’ Amour et al.2006 (NatureBiotech262006:1392-1401)中描述的来自阶段1、2、3、4和5的细胞。因此，制备本文描述的细胞聚集体的方法并不限于hES或hES衍生细胞的任一多能或专能阶段，而是使用方式和对细胞类型优化的需要会决定哪种方法是优选的。这些方法详细描述于实施例19-22中。[0112]在本发明的另一实施方案中，提供了用于调控得到的细胞组合物的方法，如通过改变不同生长因子的浓度，调控胰腺内胚层细胞、胰腺内分泌细胞和/或rox1-内胚层细胞的比例。这些方法详细描述于实施例21中。
[0113]除非另外指出，本文使用的术语应该按照本领域技术人员的常规用法来理解。除了以下提供的术语的定义，分子生物学中的常用术语的定义还可以在 Rieger et al., 1991Glossary of genetics: classical and molecular,5thEd.，Berlin:Springer-Verlag;以及在 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel et al., Eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.和John ffiley&Sons, Inc.间的联合企业(1998Supplement)中找到。应理解,如本说明书和权利要求书中所用的，“a(—个)”或“an(—个)”可以意指一个或多个，取决于它使用的语境。因此，例如，提及“细胞(a cell)”可以指可以利用至少一个细胞。
[0114]此外，出于本说明书和随附的权利要求书的目的，除非另外指明，本说明书和权利要求书使用的所有表示成分的量、材料的百分比或比例、反应条件的数字以及其他数值都应该理解为在所有情形下通过术语“约”可被改变。因此，除非被相反地指出，以下说明书和所附的权利要求书列出的数值参数是近似值，可以根据本发明寻求的期望特性而变化。至少，不是试图将等同值教义的应用局限于权利要求书的范围，每一数值参数应该至少结合报道的有意义的位数以及通过应用平常的四舍五入技术来理解。
[0115]如本文所用，“约”是指一个作为“约”提及的数字包括所列举的数字加上或减去所列举数字的1-10%。例如，“约” 100个细胞根据情况可指95-105个细胞或少至99-101个细胞。无论本文中何时出现，数值范围如“1-20”是指在该给定范围内的每个整数；例如，“1-20个细胞”是指I个细胞、2个细胞、3个细胞等直至并包括20个细胞。当“约”修饰一个用非整数表示的范围时，其指所列举的数字加上或减去所表示的相同程度的有效数字的1-10%。例如，约1.50-2.50mM可指少至1.35mM或多至2.75mM或在0.01增量之间的任何量。
[0116]本发明提供了用于 从hES衍生的单细胞悬浮液产生hES衍生细胞聚集体的方法。因为多种机械和非生理因素影响培养的细胞的运动和聚集，流体机械微环境与最佳的细胞聚集体活力和性能相关，以及提供可以用于扩大的标准化变量，需要表征在多种培养容器、平皿、锥形瓶、生物反应器、瓶子等中生长或分化的细胞的运动，以及表征多种培养基条件对细胞的影响，如果有的话。这些因素中的一些包括但不限于剪切速率和剪切应力、细胞密度和多种生长因子在任一细胞培养基中的浓度。
[0117]剪切速率和剪切应力是定义系统内流体剪切的机械特征。剪切速率被定义为给定距离内流体的速率，并被表示为sec'剪切速率与剪切应力成比例，其中剪切速率(Y) =剪切应力(t)/粘度(μ)。剪切应力被定义为切向作用于细胞表面的流体剪切力，并被表示为每单位面积的力(达因/cm2或N/m2)。能够通过搅动的液体流过静态细胞、搅动的细胞流经静态液体或者通过细胞移入搅动的、动态的流体环境来产生剪切应力。流体粘度通常以泊(poise)测量,其中I泊=1达因sec/cm2=100厘泊(cp)。水是已知的粘性最小的流体之一，其粘度为0.01cp。培养基中的真核细胞典型悬浮液的粘度在25°C温度下为1.0至
1.1cp。密度和温度都能影响流体的粘度。
[0118]流体速率还决定流动是否是层流或湍流。当粘滞力占优势时，发生层流，其特征为平滑的，在低粘度时甚至成流线型。相反，在湍流时高速率和惯性力占优势，湍流的特征为在跨越时空的流动中出现润流、镟润和混乱的波动。称为雷诺数(Reynold’s number) (Re)的无因次值通常用于定量层流或湍流的存在。雷诺数是惯性力与粘性力的比率，并被定量为(密度*粘度*长度值)/(粘度)。Re〈2300时层流占优势，而当ReMOOO时，湍流占优势。基于与流体速率的这种关系，雷诺数以及由此流体流动是层流或湍流的程度与悬浮液中细胞经历的剪切速率和剪切应力成正比例。然而，能够在层流和湍流环境中都产生高剪切应力条件。最初，液体倾向于抵制运动，最接近固体表面的流体经历了吸引力，该吸引力在直接邻近表面产生了无流动的边界层或区。这产生了从表面到流体流中心的流体速率梯度。速率梯度的陡度是液体移动的速度和边界层到最高流体速率区的距离的函数。当经过容器或容器周围的液体流动率增加时，流动的速率克服了液体的粘度，并且平滑、层式梯度破坏，产生了湍流。Thomas等证明，湍流条件下的细胞裂解最经常发生在局部高剪切应力和高能量损耗率的区域。参见，Thomas et al.(1994)Cytotechnologyl5:329-335。这些区域随机出现，但经常发现于速率梯度最高的边界层。这些流体速率随机的波动能够产生非常高的剪切应力区域，其最终能够对基于细胞培养的生产系统的扩大具有负面影响。因此，需要能够通过调控在哺乳动物细胞培养生产扩大系统中的剪切力的主要来源来维持这种系统中细胞密度和活力的方法。
[0119]按照 Henzler (HenzIer, 2000，Particle stress in bioreactors, In Advancesin Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T.Ed.Springer-Verlag, Berlin)和 Colomer et al.(Colomer, J.et al.2005.Experimental analysis of coagulation ofparticles under low-shear flow.Water Res.39:2994)提供的方法,计算了旋转 6 孔平皿中大体积流体的流体机械特性。无因次应力(Dimensionless Stress)等于瑞流常数*(聚集体直径/Kolmogorov’s Microscale)"瑞流指数。剪切应力等于无因次应力*流体密度*(运动粘度*功率输入)~0.5。剪切速率等于剪切应力/运动粘度。为了功率输入和Kolmogorov’ s Microscale的计算，需要每一旋转率下的雷诺数,其等于(旋转率*瓶径)~2/粘度。因为功率输入和Kolmogorov’s Microscale都是雷诺数的函数，所有剪切应力和剪切速率计算随旋转率变化。
[0120]而且，剪切应力和剪切速率是无因次应力的函数，其取决于形成的聚集体的直径，因此预期聚集体经历的剪切应力和剪切速率随着旋转时间增加。对于100-200 μ m的聚集体直径，以及60-140rpm的旋转速度，实施例17显示了实例计算。这些方法用于提供大体积流体随时间的平均剪切的估值。然而，预期血管壁的剪切应力由于边界效应会是最高的。为了评估壁剪切应力，Ley等提出6孔平皿中的壁剪切应力等于旋转半径*(密度*动态粘度* (2*pi*旋转率)~3)~0.5。利用这种方法，计算旋转速度为60rpm至140rpm的壁剪切应力，并显示在实施例18中。注意，与大体积流体中的聚集体经历的时均剪切应力不同，发生在壁的剪切应力独立于聚集体直径。
[0121]培养细胞密度对于组织功能也是关键的因素，并且在传统的2-维组织(例如，粘附的工程构建体)中难于实现和/或优化。实施例20更为详细地描述了细胞密度对分化的影响。细胞聚集体通过呈现更准确地反映体内细胞密度和构象的有组织的3维(3D)架构可以克服这一局限性。因此，细胞实现它们预期结构的时间周期可以显著减少和/或变得更为一致和有效。而且，3D聚集体形式的细胞可以分化以及更好地发挥作用，因为该架构比贴壁培养更类似于正常的生理。此外，与该生产过程有关的机械困难与例如贴壁培养中的机械困难相比较不易破坏悬浮培养物中自由浮动的细胞聚集体。
[0122]典型生产规模的悬浮培养还利用培养基的连续灌注作为维持细胞活力同时最大化细胞密度的方法。因此，培养基更换提供给培养物流体剪切，其对贴壁细胞和悬浮的聚集体的影响不同。当培养基切线流过细胞表面时，固定的贴壁细胞经受流体剪切应力。与之相比，悬浮的聚集体在聚集体表面经历显著减小的剪切应力，因为聚集体自由滚动以响应施加的剪切力。预期延长的剪切应力对粘附的ES细胞是有害的，悬浮的聚集体形式对于最佳的存活和功能是优选的。因此，基于对产生多能干细胞和/或衍生自多能干细胞的专能祖细胞的有效生产过程的需要，以及上述观测到的有关剪切速率和剪切应力的力学，本发明第一次提供了用于产生悬浮形式的、特别是细胞聚集体悬浮形式的多能干细胞和/或多能干细胞衍生的专能祖细胞的生产方法。[0123]如本文所用的，“单细胞悬浮液”或其等同物指通过任一机械的或化学手段的hES单细胞悬浮液或hES衍生的单细胞悬浮液。存在几种用于解离细胞簇以从原代组织、粘附的培养细胞和聚集体形成单细胞悬浮液的方法，例如物理力(机械解离，诸如细胞刮擦器、通过针孔移液管研磨、细针穿刺、涡旋解聚和通过精细尼龙和不锈钢网筛的强制过滤)、酶(酶促解离诸如胰蛋白酶、胶原酶、蕲蛇酶(Acutase)等)或者两者的组合。此外，能够支持hESC的单细胞解离的方法和培养基用于扩增、细胞分选和多孔板测定的限定接种，以及能够使培养程序和克隆扩增自动化。因此，本发明的一个实施方案提供了用于生成稳定的单细胞酶促解离hES或hES衍生细胞培养系统的方法，所述hES或hES衍生细胞培养系统能够支持未分化的多能hES或分化的hESC的长期维持和有效扩增。
[0124]如本文所用滚瓶(roller bottle/rolling bottle) ”或其等同物是指适于围绕其轴线旋转的圆柱形容器。这些容器包括但不限于，通过Corning、Fisher Scientific和其他生产商销售的滚瓶，以及例如能够在其侧壁上旋转的鼓形、桶形和其他瓶形容器。本文所述的滚瓶不必一定是圆柱形或具有圆形横截面。例如它们可为宽度恒定的非圆形封闭曲线。在一个实施方案中，所述曲线可为鲁洛三角形或具有圆形角的鲁洛三角形，如美国专利第5，866，419号所述，其通过引用全部并入本文。圆形横截面的滚瓶并非是提供平稳旋转的唯一形状或几何体，因为存在无数种这类曲线，它们均在本发明考虑的范围。然而，工业上并不经常遇到这类曲线，因为用于旋转瓶子的大部分机器要求垂直于该曲线运行的水平轴保持在固定位置，其不用于非圆形旋转器因旋转时其轴有前后转换运动。相比圆形横截面型滚瓶，除了如其他圆柱形滚瓶通常的圆形运动，该额外的运动或旋转可增强气体交换。
[0125]典型的圆柱形滚瓶包括底壁、顶壁和在底壁与顶壁之间延伸的圆柱形侧壁。顶壁包括开口以提供进入该滚瓶内部的入口。此类滚瓶的内表面提供了用于细胞相互作用和/或贴附的活性表面。因此，牛津生化词典提供的解释是，滚瓶为用于培养单层贴壁细胞的圆柱形容器。的确，滚瓶适于大量细胞如贴壁细胞的生长，或适于生产细胞副产品如细胞分泌的药用物质。滚瓶的圆柱形侧壁可为平滑的或定制图案的，而图案基本上从底壁延伸至顶壁以增加细胞生长的表面积，并且当瓶子围绕侧壁的轴转动时有助于液体流至瓶子的所有内表面。
[0126]无论滚瓶的横截面为何(圆形或非圆形的)，都将液体生长培养基引入并容纳于滚瓶中。瓶子的旋转运动使得内表面被液体培养基润湿，从而促进细胞的生长。使用合适设备的旋转仪来旋转本发明的滚瓶。
[0127]通常将滚瓶构造为玻璃的、不锈钢的或透明塑料的如聚苯乙烯、聚氨酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚烯烃如聚丙烯、具有乙二醇添加剂的聚对苯二甲酸乙二酯、乙二醇-1，4-环己烷二甲醇对苯二酸共聚酯等。优选透明材料，因为能够通过将瓶子置于倒置显微镜下监控细胞生长。
[0128]在医药、生化和医学邻域用于一些处理过程(如细胞生长和感染、异源糖蛋白生产、疫苗制备和高密度植物细胞培养)的人工和自动化滚瓶系统已经应用了 40多年。参见 Tanaka et al.1983, Biotechnol.Bioeng.25:2359; Tanakal987, ProcessBiochem.Aug., 106;Hong, et al.1989,Biotechnol.Prog.5:137;Elliotl990, Bioprocess Tech.10:207;Tsao1992，Annals N.Y.Acad.Sc1.665:127;PenneIl&MiI stein1992, J.0f Tmmun.Meth.146:43;01ivas et al., 1995, Tmmun.Meth.182, 73(1995);Singhvi etal.1996, Cytotechnology22:79;以及Kunitake et al.1997，Biotechnology52:3289,其通过引用全部并入本文。此外，对于工业规模生产细胞培养产物(即疫苗)，即使当使用基于单元操作的系统时，在将细胞转移至用于最终生长期的微载体培养之前，滚瓶中的细胞被频繁传代。参见Edy, 1984, Adv.Exp.Med.Biol.172:169，其通过引用全部并入本文。
[0129]到目前为止，滚瓶广泛用于培养贴壁细胞可归因于几个因素。该方法基于:(i)水平的圆柱形容器装有足够体积的培养基或流体且轴向地旋转；由于滚瓶的扩大是长度的函数，无需扩大研发或发明，这导致缩短了工业化的研发时间线并较快地将新产品推向市场；
(ii)滚瓶系统使得能有恒定的流体-气体接触，即由于轴向的旋转，任何时候均有至少一薄层的流体或培养基随着旋转而覆盖瓶子的内表面；该层允许增加流体-气体交换，并且随着瓶子旋转气体返回位于滚瓶底部的培养基池中的细胞；(iii)在大规模培养中维持无菌条件持续延长的时间是可能的，因为一个或多个滚瓶的污染不会导致整个批次的污染；(iv)精确控制营养物和废物产物水平是可能的；以及(V)直接监测细胞是相对简单的，例如，确定某些细胞标志物以确保例如在1-4阶段后细胞的有效分化和适当的特化。
[0130]然而不想局限于使用滚瓶或滚子式容器培养三维细胞聚集体，意图还有其它用于制备本发明细胞聚集体的手段，但不使用通过滚瓶或在例如鼓上旋转的圆柱形容器产生的运动。用于聚集PPSC的运动类型通常可通过例如雾化容器或腔室以产生更多的层流来产生。该运动也可通过具有一个入口和出口来产生，以帮助流体培养基或甚至细胞本身的流入和流出，并产生类似于本文描述的滚瓶所实现的运动。该运动还可通过使用一个或多个流量分配器或其组合来实现。例如，这样的流量分配器可包括挡板以在所述腔室内分配流体或培养基的流动，从而产生三维细胞聚集体的连续均匀的混合物。在另一个实例中，流量分配器可为一个或多个导流板、分配通道和/或流动通道的组合，其产生类似于滚瓶中所见的流体运动而不必发生于滚瓶型圆柱形容器或腔室中。因此，以无湍流方式产生流体运动的替代性手段，也产生足够低的剪切力以促进细胞碰触，并使得细胞能彼此粘附而形成本文所述的细胞聚集体。
[0131]滚瓶中生长的粘附或贴壁细胞的某些特性也具有缺点。例如，自然的贴壁细胞生长需要大量表面积供细胞贴附，而滚瓶可用于生长的表面积有限。为所有目的，例如细胞种植或接种、细胞生长和/或病毒繁殖和扩增，在滚瓶中进行混合的常规方法是以均匀的速率朝一个方向旋转。大多数用于培养粘附或贴壁细胞的滚瓶处理过程的标准旋转频率为约0.125-5rmPo对于这些培养，重要的是所述细胞尽快与滚瓶的侧面接触，因为只有附着于容器壁后细胞随后才能增殖并形成细胞片层。细胞缓慢附着于容器内壁导致细胞低活力和/或种植不均，因而导致在滚瓶的表面上的不均匀生长。而且，低效的混合限制了细胞的生长，因为细胞无法随着瓶子旋转而获得充足的养分(例如，氧气)或从浸没的表面贴附的细胞片层中充分移除毒素(例如，二氧化碳)。令人感兴趣的是，这些缺点对于使用滚瓶来聚集、生长、扩增和分化可分化的悬浮多能细胞并不关键。
[0132]鉴于上述特性以及 申请人:自己公开的用于在6-孔盘等当中制备hES细胞聚集体的方法，本领域技术人员还不会转而使用滚瓶来制备多能干细胞聚集体。参见Schulz etal.2012，Stem Cells7:l_17, e37004 以及美国专利第 8，153，429 号和第 8，008，075 号，其通过引用全部并入本文。例如，Schulz et al.2012,(同上)，教导了通过使用圆形或径向运动、移动或旋转，多能干细胞可有效地聚集，所述圆形或径向运动、移动或旋转被施加于主涡流上，并基于旋转形式将细胞拖入培养容器中心更高的局部密度处，例如将细胞拖入6-孔盘的孔的中心或锥形瓶中心或生物反应器中心。该径向涡流在滚瓶中无法实现，因为其性质，滚瓶以其侧壁而非底座旋转，因此，将方法从包括中心涡流运动的系统转变至不包括中心涡流运动的系统如本文所述的滚瓶，这并不直观。
[0133] 申请人:使用其他类型运动研究了静态培养，包括研究摇晃、搅拌和离心hES细胞，而这些运动形式无法形成hES细胞聚集体或可分化的细胞聚集体。而且，确实在这些条件下形成的这些hES或hES细胞-衍生的聚集体无法在体内产生功能性的葡萄糖响应的细胞类型，这为任何成功生产PEC的方法的最终检测。参见至少Kroon et al.2008，(同上)和Schulz et al.(2012)，(同上)。因此，不能够说仅运动或移动就足以形成多能干细胞或hES细胞悬浮聚集体或可分化的细胞聚集体，因为并非如此。这些研究(数据未显示)表明，不仅仅是流体运动和该运动产生的力促进了细胞聚集体形成所需的粘附接触，其导致单细胞多能干细胞转变为稳定的细胞-细胞聚集体。
[0134]如上所简述，滚瓶的旋转与6-孔盘、锥形瓶等围绕中心涡流发生的旋转极为不同。在滚瓶中，当瓶子以其侧壁旋转时大多数培养物体积保留在瓶底，且随着瓶子旋转一薄层流体或培养基覆盖于瓶子的内表面。该薄的流体层随瓶子的旋转而增加了气体交换，从而全面增加了培养基的氧气水平；即一旦该薄层培养基返回大多数培养基所在的瓶底，其携带了增加量的氧气。然而并不直观的是该运动，尤其是当以本领域标准的用于粘附细胞的很低的速度(例如，0.125-5rpm)旋转时，将允许充足的细胞-细胞接触或碰触，同时维持足以使得灵长类动物多能干细胞(PPSC)聚集体形成(更不用说可分化细胞聚集体的分化)的低剪切力。
[0135]由于两种方式之间的转速不同，使用滚瓶来聚集、培养、传代、扩增和分化细胞也与6-孔盘、锥形瓶、生物反应器不同。6-孔盘、锥形瓶、生物反应等例如使用约80、85、90、95、100、105、110、115和120rpm的更高转速，这是至少为了在培养中防止细胞聚集体结块或形成簇或更大的细胞团块所要求的。注意，结块的细胞簇(例如，300 μ m或更大的大聚集体)不应该与大体上为球形、尺寸更小(约100-200 μ m)且均匀的细胞聚集体混同。相反，滚瓶中PPSC的聚集、生长、传代、扩增和分化是在约3、4、5、6、7、8、9和IOrpm的相对低的转速下进行的。这些较低的转速并不产生与6-孔盘、锥形瓶、生物反应器等当中发生的相同程度的剪切力，且鉴于 申请人:此前的经验(参见Schulz et al.2012，同上)，预期在这些条件下会成功形成细胞聚集体。
[0136]使用滚瓶进行多能干细胞聚集、培养、传代、扩增和分化相比其他细胞培养容器的优点为，一旦在最小的滚瓶中得到优化，其方法将与在更大的滚瓶中非常相似地起作用而无需其他实质性发明。例如，通过使用具有相同标准横截面但实质上更大容积的更长瓶子，或使用成组的瓶子，用同样的瓶子直径、直径/体积比率和旋转速度可以按比例扩大总培养物质。滚瓶长度(按比例)的增加并不影响细胞聚集或分化过程。因此，按比例扩大细胞处理过程或生产，从490cm2滚瓶(直径11.12cm ;长17.30cm，包括盖)至850cm2滚瓶(直径11.63cm;长27.36cm，包括盖)至1750cm2滚瓶(直径11.73cm ;长53.16cm，包括盖)或更大，除了本文的描述并不涉及实质上或大的修改。
[0137]由于至少以上理由，滚瓶中细胞生产的可扩大性，不同于在6-孔盘、锥形瓶、生物反应器等的旋转平台系统。例如，为了获得IxlO6细胞/mL的IL多能干细胞培养物，需要约30个6-孔盘。用另一种方式表述，不是使用80个6-孔盘(共480个孔)，本领域技术人员仅需要4，850cm2的滚瓶。本领域技术人员应理解，滚瓶需要更少的操作和劳动是生产的改善。此外，当在不同规模下使用旋转平台时，为了实现聚集必须调整容积、速度和旋转半径。例如，在锥形瓶中可实现灵长类动物PSC聚集，但在约150rpm的相对高的转速下发生得最好，这会引起太多湍流和剪切力而导致细胞死亡增加(数据未显示)。仅将瓶子或罐置于摇动的平台不产生本文描述的细胞悬浮聚集体(数据未显示)。摇动没有产生合适的流体运动来支持恰当的细胞-细胞接触和粘附，且可能产生了太多湍流和剪切力而导致细胞死亡增加。类似地，方形瓶和15cm玻璃罐由于类似原因而不是按比例扩大pPSC聚集体形成的合适培养容器(数据未显示)。而且，仅细胞-细胞接触不会导致PPSC聚集体形成，因为当将hES细胞的单细胞悬浮液离心后回收细胞团时，没有观察到细胞聚集体(数据未显示)。因此，发现真正具有可支持高效和一致的细胞聚集(包括一致的聚集体直径)的合适流体运动的可扩大系统并非是显然或常规的，其困难明显超过本领域技术人员的期望或预期。事实上，出人意 料的是，常规用于大规模培养粘附和贴壁细胞类型的滚瓶，配合速度高达30倍的降低，就将提供生产本文所描述的pPSC聚集体和分化的合适条件。
[0138]如本文所用的，术语“接触”(即，使细胞，例如可分化的细胞与化合物接触)意在包括在体外共同孵育化合物和细胞(例如，将化合物添加至培养的细胞)。术语“接触”并不意在包括细胞向限定的细胞培养基的体内暴露，所述限定的细胞培养基包含ErbB3配体，以及任选地TGF-β家族的成员，这可以在个体内天然发生(即，暴露可以作为天然生理过程的结果发生)。使细胞与包含ErbB3配体以及任选的TGF-β家族成员的限定的细胞培养基接触的步骤可以以任何合适的方式进行。例如，可以在贴壁培养或在悬浮培养中处理细胞。应当理解，与限定培养基接触的细胞还可以用细胞分化环境进一步处理以稳定细胞或分化细胞。
[0139]如本文所用的，术语“分化”指比其来源的细胞类型更为分化的细胞类型的产生。因此该术语包括部分分化和终末分化的细胞类型。衍生自hESC的分化的细胞通常称为hES衍生细胞，或hES衍生细胞聚集体培养物，或hES衍生的单细胞悬浮液，或hES衍生细胞贴
壁培养物等。
[0140]如本文所用的，术语“基本上(substantially) ”指大范围或程度，例如，上下文中的“基本上相似”用于描述一种方法与另一种方法大范围或程度相似或不同。然而，如本文所用的，术语“基本上无”，例如“基本上无”或“基本上无污染物”，或者“基本上无血清”或“基本上无胰岛素或胰岛素样生长因子”或其等同物，意指溶液、培养基、补加剂、赋形剂等至少98%、或至少98.5%、或至少99%、或至少99.5%、或至少100%无血清、污染物或其等同物。在一个实施方案中，提供了不含血清，或者100%无血清的，或者基本上无血清的限定培养基。相反，如本文所用的，术语“基本上相似的”或其等同物意指组合物、处理过程、方法、溶液、培养基、补加剂、赋形剂等与在本文说明书先前描述的或在以其整体并入本文的以前描述的处理过程或方法中的那些有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相似。
[0141 ] 在本发明的某些实施方案中，术语“富集的”指包含超过约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的期望的细胞谱系的细胞培养物。
[0142]如本文所用的，术语化合物的“有效量”或其等同物指化合物的浓度在限定培养基的其余组分存在下足以使培养物中的可分化细胞在缺乏饲养层细胞以及缺乏血清或血清替代物的情况下稳定超过一个月。本领域技术人员可以容易地确定该浓度。
[0143]如本文所用的，术语“表达”指细胞中多核苷酸的转录或多肽的翻译，使得该分子在表达该分子的细胞中的水平比在不表达该分子的细胞的水平显著地高。测量分子表达的方法是本领域技术人员公知的，以及包括但不限于Northern印迹(RNA印迹)、RT-PCR、原位杂交、Western印迹(蛋白质印迹)和免疫染色。
[0144]如本文所用的，当指细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群时，术语“分离的”指基本上与细胞的天然来源分开，使得细胞、细胞系、细胞培养物或细胞群能够在体外培养。此外，术语“分离”用于指从两种或更多种细胞组中物理选择一种或多种细胞，其中基于细胞形态和/或不同标志物的表达来选择细胞。
[0145]通过参考以下本发明优选实施方案的详细描述和其中包括的实施例，可以更容易地理解本发明。然而，应理`解，在本发明的组合物和方法被公开和描述前，本发明并不局限于特定的核酸、特定的多肽、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定的条件或特定的方法等，因为，这些当然可以变化，并且其中众多的改进和变型对本领域技术人员是显而易见的。
[0146]用于克隆、DNA分离、扩增和纯化、用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶反应的标准技术以及多种分离技术是本领域技术人员已知和经常应用的。大量标准技术描述于 Sambrook et al.，1989“Molecular Cloning”(分子克隆)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, Plainview, New York;Maniatis et al.,1982 “MolecularCloning，，(分子克隆),Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NewYork;Wu(ed.) 1993Meth.Enzymo1.218, Part I;Wu(ed.) 1979Meth.Enzymo1.68;Wu etal., (ed.) 1983Meth.Enzymo1.1OOandlOl;Grossman and Moldave(eds.) 1980Meth.Enzymol.65;Miller(ed.) 1972 “Experiments in Molecular Genetics”(分子遗传学实验)，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York;Old andPrimrose, 1981 “Principles of Gene Manipulation”(基因操作原理)，University ofCalifornia Press, Berkeley;Schleif&Wensink, 1982 “Practical Methods in MolecularBiology”(分子生物学实践方法)；Glover(ed.) 1985 “DNA Cloning” Vol.1 and II，IRLPress, Oxford, UK;Hames and Higgins (eds.) 1985 “Nucleic Acid Hybridization，，(核酸杂交)，IRL Press, Oxford,UK;以及 Setlow and Hollaenderl979 “GeneticEngineering !Principles and Methods”(基因工程:原理和方法)，Vols.1-4, PlenumPress, New York。其中使用的缩略词和术语被视为本领域的标准，并常用于专业学术期刊中，诸如本文引用的那些。
[0147]本发明涉及包括基础盐营养液和有效量的ErbB3配体的组合物和方法，该组合物实质上不含血清。本发明的组合物和方法用于培养细胞，特别是可分化的细胞。应当理解，在培养可分化细胞的不同点，可以将多种组分添加至细胞培养物，以使培养基能够包含除本文描述的组分外的组分。然而，考虑在制备培养物期间或培养可分化细胞期间的至少一个点，限定培养基包含基础盐营养液和用于活化ErbB2-定向的酪氨酸激酶的手段。
[0148]尽管本文描述的基础盐营养液被应用于维持hESC的细胞生长和活力，在本发明的其他实施方案中，维持多能细胞的多能性或用于多能细胞分化的可选的干细胞培养基以基本上相似的方式发挥作用，这些培养基包括但不限于KSR(Invitrogen)、或无异种成分 KSR(xeno-free KSR, Invitrogen)、StemPro? (Invitrogen), mTeSR?l (StemCellTechnologies)和 HEScGRO(Millipore)、基于 DMEM 的培养基等。
[0149]在另一实施方案中，在细胞外基质蛋白(ECM)，例如MATRIGEL不存在和/或存在的情况下，将hESC培养在本文描述的限定培养基中。无ECM下培养的人ES细胞包含约0.5至10%人血清(hS)或来自300K和/或IOOK截止离心柱(Microcon)的hS滞留部分。可以通过以下方式制备hES细胞聚集体悬浮液:直接将hESC孵育在含有hS或hS滞留部分的培养基中；或者将培养容器与hS或hS滞留部分在37°C孵育约30分、I小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时和24小时后。在含有hS或hS滞留部分的培养基中的hESC的接种效率与培养在PCT/US2007/062755描述的DC-HAIF中的或者培养在利用MATRIGELTM作为ECM的DC-HAIF培养基或者其他类似基质中的hESC所观察的接种效率是可比较的。用于在基本上无血清的限定培养基中培养hESC的方法描述于2007年10月19日提交的题目为 “METHODS AND COMPOSITIONS FOR FEEDER-FREE PLURIPOTENT STEM CELL MEDIACONTAINING HUMAN SERUM(用于含人血清的无饲养层多能干细胞的方法和组合物)”的序列号为11/8875,057的美国专利 申请中，该美国申请通过引用的方式以其整体并入本文。
[0150]仍在另一实施方案中，将hES细胞聚集体悬浮液培养在基本上无血清且还无外源添加的成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中。这与美国专利7，005，252 (Thomson)不同，该美国专利需要在无血清但含有外源添加的生长因子包括FGF的培养集中培养hESC。
[0151]能够通过细胞外信号跨膜转导来实施细胞调节，所述细胞外信号跨膜转导进一步调节细胞内的生物化学途径。蛋白磷酸化代表细胞内信号从分子到分子传播的一个过程，最终引起细胞反应。这些信号转导级联受到高度调节，并且经常重叠，如通过许多蛋白激酶以及磷酸酶的存在所证实的。据报道，在人类，蛋白酪氨酸激酶已知在包括糖尿病、癌症的多种疾病状态的发展中都具有重要作用，并且也与种类多样的先天性综合征有关。丝氨酸苏氨酸激酶，例如，Rho激酶，是一类如果受到抑制，能够与人疾病包括糖尿病、癌症和多种炎症性心血管病症和AIDS有关联的酶。迄今为止，鉴定/设计的大多数抑制剂在ATP结合位点起作用。这种ATP竞争性抑制剂通过它们靶向ATP结合位点更不保守区已经显示出选择性。
[0152]小GTP结合蛋白的Rho激酶家族包含至少10个成员，包括RhoA-E和G、Racl和2、Cdc42以及TC10。抑制剂通常称为ROK或ROCK抑制剂，并且它们在本文可互换使用。RhoA、RhoB和RhoC的效应器结构域具有相同的氨基酸序列，并且看起来具有相似的细胞内靶标。Rho激酶作为Rho的主要下游媒介起作用，并以两种同种型存在:a (R0CK2)和β (ROCKl)。Rho激酶家族蛋白在其N-末端结构域具有催化(激酶)结构域、在其中间部分具有卷曲螺旋结构域以及在其C-末端结构域具有推定的pleckstrin同源(PH)结构域。ROCK的Rho-结合结构域位于卷曲螺旋结构域的C-末端部分，且Rho的GTP结合形式的结合导致激酶活性的增加。Rho/Rho-激酶-介导的途径在多种激动剂起始的信号转导中发挥重要作用，所述多种激动剂包括血管紧张素I1、血清素、凝血酶、内皮素-1、去甲肾上腺素、血小板衍生的生长因子、ATP/ADP和细胞外核苷酸以及尾加压素II。通过它的靶标效应器/底物的调节，Rho激酶在包括平滑肌收缩、肌动蛋白细胞骨架组织、细胞粘附和运动性以及基因表达的多种细胞功能中发挥重要作用。通过Rho激酶蛋白在介导被认为与动脉硬化发病有关的多种细胞功能中所起的作用，该激酶的抑制剂还可以用于治疗或预防多种动脉硬化心血管疾病，并与被认为促进动脉硬化的内皮收缩和内皮渗透性增加有关。因此，在本发明的一些实施方案中，将促进和/或支持细胞存活的试剂添加至多种细胞培养基中，例如，Rho-激酶抑制剂Y-27632、法舒地尔(Fasudil)以及H-1152P和ITS (胰岛素/转铁蛋白/硒；Gibco)。这些细胞存活试剂部分通过促进解离的hES细胞或hES衍生培养物，例如前肠内胚层、胰腺内胚层、胰腺上皮、胰腺祖细胞群等，特别是解离的胰腺内胚层和胰腺祖细胞群的重新联接发挥作用。hES或hES衍生细胞的存活增加的实现不依赖于这些细胞是否从细胞悬浮聚集体产生或从贴壁平板培养物(有或无细胞外基质、有或无血清、有或无饲养层)产生。增加这些细胞群的存活促进和改善了利用细胞分选仪的纯化系统，因此使细胞的回收得以改善。利用诸如Y27632的Rho激酶抑制剂可以允许hES衍生细胞类型的扩增以及促进它们在连续传代解离的单细胞的存活或从冷冻保存物的存活。尽管已经在hES和hES衍生细胞培养物上检测了诸如Y27632的Rho激酶抑制剂，但Rho激酶抑制剂可以应用于其他细胞类型，一般地例如，上皮细胞，包括但不限于肠、肺、胸腺、肾以及如神经细胞类型的着色的视网膜上皮。
[0153]如本文所用的，术语“`可分化细胞”用于描述能够分化为至少部分成熟的细胞或者能够参与细胞分化例如与能够至少分化为部分成熟细胞的其他细胞融合的细胞或细胞群。如本文所用的，“部分成熟的细胞”、“祖细胞”、“不成熟细胞”、“前体细胞”、“专能细胞(multipotent cell) ”或其等同物还包括终末分化的那些细胞,例如,定形内胚层细胞、PDXl-阴性前肠内胚层细胞、PDXl-阳性胰腺内胚层细胞，PDXl-阳性胰腺内胚层细胞还包括rox1-阳性前胰腺内胚层细胞和rox1-阳性胰腺内胚层尖细胞。所有上述细胞都是这样的细胞，其展示来自相同器官或组织的成熟细胞的诸如形态学或蛋白表达的至少一种表型特征，但还能够分化为至少一种其他细胞类型。例如，正常的成熟肝细胞通常表达诸如白蛋白、纤维蛋白原、α-1-抗胰蛋白酶、凝血酶原凝血因子、转铁蛋白和诸如细胞色素P-450S的解毒酶等。因此，如本发明定义的，“部分成熟的肝细胞”可以表达白蛋白或另一种或多种蛋白，或者开始呈现正常的成熟肝细胞的外观或功能。
[0154]与通过以前已知方法制备的大小和形状都可以变化的细胞聚集体相比，本文描述的细胞聚集体和方法具有窄的大小和形状分布，即，细胞聚集体在大小和/或形状方面基本上是均一的。细胞聚集体的大小均一性对于分化性能和培养物同质性是关键的。将基本的传质分析应用到聚集体，预期氧气和营养素向大聚集体中心的扩散与向较小聚集体的扩增会减缓，假定渗透性相等。由于聚集的ES细胞向胰腺谱系细胞的分化依赖于特定生长因子的暂时应用，与细胞聚集体的均一(体积和形状)培养物相比，具有不同直径聚集体混合物的培养物可能是去同步的。这种细胞聚集体的混合物产生异质类型，并且可以导致差的分化性能以及最终不适合生产、扩大和制备。本文使用的细胞聚集体能够具有多种形状，诸如，例如球形、圆柱形(优选具有相同的高度和直径)或者棒状等。尽管可以使用其他形状的聚集体，但在本发明的一个实施方案中，细胞聚集体是球形或圆柱形通常是优选的。在另一实施方案中，细胞聚集体是球形并且在大小和形状方面基本是均一的。例如，如果细胞聚集体的大小不同或不是均一的，可靠地生产和进行大规模细胞处理会是困难的。因此，如本文所用的，短语“基本上均一的”或“大小和形状基本上均一的”或其等同物指聚集体均一性的散布不超过约20%。在另一实施方案中，聚集体均一性的散布不超过约15%、10%或5%。
[0155]尽管每一聚集体中细胞的确切数目不是关键的，但本领域技术人员应当认识到，每一聚集体(和因此的每一聚集体的细胞数目)的大小受限于氧气和营养素扩散到中心细胞的能力，以及该数目还可以取决于细胞类型和该细胞类型的营养需求而变化。细胞聚集体可以在每一聚集体包含最小数目的细胞(例如，两个或三个细胞)，或者可以在每一聚集体包含成百上千个细胞。通常，细胞聚集体在每一聚集体包含几百到几千个细胞。出于本发明的目的，尽管细胞聚集体的大小取决于细胞类型通常为约50微米至约600微米，但该大小可以小于或大于这一范围。在一个实施方案中，细胞聚集体的大小为约50微米至约250微米，或者为约75微米至约200微米，以及优选地，它们的大小约为100微米至150微米。与之相比，悬浮存在的圆柱形或非球形细胞聚集体是基于短轴和长轴(例如，X、Y和Z)的直径不相等的那些聚集体。这些非球形细胞聚集体的大小倾向于更大，直径和高度为约500微米至600微米。然而，在本文描述的方法中，这些非球形hES细胞聚集体一旦开始分化(如果它们尚没有分化)就变为球形。非球形细胞聚集体包括但不限于圆柱形和立方形细胞聚集体，但大小和 形状仍是均一的。
[0156]许多细胞类型可以用于形成本文描述的细胞聚集体。通常，取决于待工程化的三维构建体的类型(例如，包括胰腺、肝脏、肺脏、肾脏、心脏、膀胱、血管等的多种器官结构)，细胞类型的选择会变化。例如，如果三维结构是胰腺，则细胞聚集体会有利地包含通常在胰腺中发现的一种或多种细胞类型(例如，诸如胰岛素、胰高血糖素、胃饥饿素(ghrelin)、生长抑素类型细胞的内分泌细胞，以及内皮细胞、平滑肌细胞等)。基于期望的三维组织或器官的类型，本领域技术人员能够选择适当的细胞聚集体的细胞类型。合适的细胞类型的非限定性实例包括干细胞(例如，成体干细胞和胚胎干细胞)、收缩性或肌细胞(例如，横纹肌细胞和平滑肌细胞)、神经细胞(例如，神经胶质细胞、树突状细胞和神经元)、结缔组织(包括骨、软骨、分化为骨形成细胞和软骨细胞的细胞以及淋巴组织)、薄壁组织细胞、上皮细胞(包括形成腔和血管或通道的衬里的内皮细胞、外分泌性分泌上皮细胞、上皮吸收细胞、角化上皮细胞(例如，角质细胞和角膜上皮细胞)、细胞外基质分泌细胞、粘膜上皮细胞、肾上皮细胞、肺上皮细胞、乳腺上皮细胞等，以及未分化的细胞(诸如胚胎细胞、干细胞和其他前体细胞)等。
[0157]本文描述的细胞聚集体可以是同质细胞的聚集体或异质细胞的聚集体。如本文所用的，“同质细胞的”、“单一细胞的”细胞聚集体或其等同物指多个细胞悬浮聚集体，其中每一细胞聚集体包含基本上为单一细胞类型的多个活细胞，例如，用于制备本文描述的hES细胞聚集体的方法可以基本上是同质细胞的，基本上由多能hESC组成、基本上由定形内胚层细胞、前肠内胚层细胞组成、基本上由胰腺内胚层细胞组成，其还可以包括rox1-阳性前胰腺内胚层细胞、PDXl-阳性胰腺内胚层细胞、PDXl-阳性胰腺内胚层尖细胞、胰腺内分泌前体细胞、胰腺内分泌细胞等。
[0158]如本文所用的，术语“实质上(essentially) ”或“基本上(substantially) ”指存在于任一细胞聚集体悬浮类型中的组分或细胞最低允许(de minimus)量或量减少,例如，本文描述的细胞悬浮聚集体是“实质上或基本上同源的”、“实质上或基本上同质细胞的”或由“实质上hESC”、“实质上或基本上定形内胚层细胞”、“实质上或基本上前肠内胚层细胞”、“实质上或基本上PDXl-阴性前肠内胚层细胞”、“实质上或基本上PDXl-阳性前胰腺内胚层细胞”、“实质上或基本上PDXl-阳性胰腺内胚层或祖细胞”、“实质上或基本上PDXl-阳性胰腺内胚层尖细胞”、“实质上或基本上胰腺内分泌前体细胞”、“实质上或基本上胰腺内分泌细胞”等组成。
[0159]基本上同质细胞的细胞聚集体悬浮培养物中的一些是例如hES衍生细胞聚集体悬浮培养物，其包含培养的总hES衍生细胞的少于约50%的hESCs、少于约45%的hESCs、少于约40%的hESCs、少于约35%的hESCs、少于约30%的hESCs、少于约25%的hESCs、少于约20%的hESCs、少于约15%的hESCs、少于约10%的hESCs、少于约5%的hESCs、少于约4%的hESCs、少于约3%的hESCs、少于约2%的hESCs或少于约1%的hESCs。以另一方式陈述，hES衍生细胞聚集体悬浮培养物，例如rox1-阴性前肠内胚层、PDX-阳性前胰腺内胚层细胞、PDXl-阳性胰腺内胚层或祖细胞、PDXl-阳性胰腺尖细胞、胰腺内分泌祖细胞和胰腺内分泌细胞，包含至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%。
[0160]如本文所用的，“异质细胞的”、“多细胞的”或其等同物指细胞聚集体，由此，每一单独细胞聚集体包含至少为两个、三个、四个、五个、六个或更多细胞类型的多个细胞，或者至少一种细胞类型和非细胞组分，例如细胞外基质(ECM)物质(例如，胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和/或蛋白聚糖)。这种ECM组分可以由细胞天然分泌，或可选地，细胞可以通过任何本领域已知的方法进行遗传操纵以改变诸如选择素、整合素、免疫球蛋白和钙粘素等的ECM物质和/或细胞粘附分子的表达水平。在另一实施方案中，天然的ECM物质或模拟ECM物质的任一合成组分可以在聚集体形成过程中并入聚集体。例如，制备本文描述的hES衍生细胞聚集体诸如胰腺上皮或胰腺内胚层细胞聚集体(或4期细胞聚集体)的方法基本上由胰腺上皮或内胚层细胞组成，但还可以存在小细胞数目的其他非胰腺上皮类型细胞，或者其他内胚层祖细胞，以及甚至胰腺内分泌性分泌细胞(例如胰岛素分泌细胞)。
[0161]为了清楚起见，本文描述的以及通过本文描述的悬浮方法制备的同质-或异质-细胞的聚集体不是本领域和其他人描述的称为胚状体(EBs)的细胞聚集体。胚状体与本文描述的细胞聚集体是明 显不同的，因为EBs是分化的和未分化细胞的细胞聚集体，其出现在ES细胞在单层培养中生长过度时，或维持在非限定培养基的悬浮培养物中或通过非定向方案(即随机分化)向多生殖层组织分化时。相反，实施例17和20详细讨论的本发明酶促解离贴壁平板培养的hESC以制备单细胞悬浮液，然后将这些细胞聚在一起形成细胞聚集体；然后利用这些细胞聚集悬浮培养物用于分化，基本上如在前面D’ Amour etal.2005，(同上)，&D’Amour et al.2006，(同上)中描述的。EBs和本发明的细胞聚集体间的其他差异在下文进一步讨论。
[0162]仍有其他方法描述了制备胚状体(EBs)。如本文使用的，术语“胚状体”、“聚集体”或其等同物指分化的和未分化的细胞的聚集体，其出现在当ES细胞在单层培养中生长过度时，或维持在非限定培养基的悬浮培养物中或通过非定向方案向多胚层组织分化时。换句话说，EBs不是从本文描述的多能干细胞的单细胞悬浮液形成的，也不是从hES衍生的专能细胞的贴壁培养物形成的。这些特征本身使本发明清楚地区别于胚状体。
[0163]胚状体是不同细胞类型的混合物，通常来自通过形态学标准可以区分的几个胚层。胚状体通常指由细胞群组成的形态学结构，其大部分衍生自经历非定向分化的胚胎干(ES)细胞，即如当未分化的细胞在无限定生长因子下暴露于高浓度的血清时出现的那些。在适合EB形成的培养条件下(例如，从小鼠ES细胞移除白血病抑制因子，或者其他的类似阻断因子)，ES细胞增殖并形成开始分化的小细胞团。首先，对应于人ES细胞分化的约1-4天，小细胞团在外层形成内胚层细胞层，并被视为“简单的胚状体”。其次，对应于人ES细胞分化后的约3-20天，形成“复杂的胚状体”，其特征在于外胚层和中胚层以及衍生组织的广泛分化。如本文所用的，EBs包括简单和复杂的EBs，除非上下文另外要求。胚状体何时在ES细胞培养中形成常规由本领域技术人员通过例如肉眼检测形态学来确定。取决于培养条件，约20个细胞或更多的细胞的漂浮团被认为是EBs。参见，例如，Schmitt et al.(1991)Genes Dev.5, 728-740;Doetschman et al.1985J.Embryol.Exp.Morph.87:27-45。该术语还指衍生自原始生殖细胞的等同结构，其为从胚胎性腺区提取的原始细胞；参见，例如Shamblott, et al.1998Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95:13726。原始生殖细胞，本领域中有时还称为EG细胞或胚胎生殖细胞，当用适当的因子处理时，形成多能ES细胞，胚状体可以衍生自所述多能ES细胞；参见，例如美国专利第5，670，372号和Shamblott, et al.，(同上)。 [0164]存在多种制备EBs的方法,例如，Ng et al.2008Nature Protocols3:468-776 描述的旋转胚状体(spin embryo id bodies)和从接种在微图案细胞外基质岛上的单细胞悬浮液制备的 EBs,描述于 Bauwens et al2008, Stem Cells26:2300-10，Epub2008Jun26。然而，这些方法对于hESC和hES衍生细胞的大规模制备(生产)而言成本过高且效率较低，因为它们在扩大制备实际启动前需要过多步骤。例如，Bauwens et al.，在能够选择细胞以开始悬浮培养之前，首先必须将hESC接种在生长因子降低的MATRIGELTM上。该方法的时间和成本使它繁杂，因为需要定制的微图案组织培养板。此外，Ng等应用的方法对于大规模生产hESC和hES衍生细胞而言也没有成本效益，因为使用离心机以便生成更均一的EB。这些方法受到表面积约束的限制，这也影响到它们的可扩大性。最后，在所有这些方法学中，细胞聚集体不是如本发明这样从多能干细胞的单细胞悬浮液中制备。
[0165]不像本发明描述的细胞聚集体，胚状体是如下的细胞聚集体:其由来自三个胚层的众多细胞类型组成，并通常通过将未分化的ES细胞的聚集体暴露于诸如20%胎牛血清的非定向的分化信号而建立的。该定向方法得到的是细胞类型的混合物，其用来在体外模拟正常的胚胎发育。尽管该方法在用于检测胚胎发育的基础研究水平是有用的，但它不适于任何大规模的细胞治疗生产过程,其中细胞产量、群体同一性、群体纯度、批次同一性、安全性、细胞功能和商品成本主要的考虑因素。而且，不管用于从胚状体纯化给定细胞类型的任何富集策略，分化方案都没有提供会产生大群单细胞类型的定向方法。随后，污染物群体会一直占据优势，并且会阻碍纯化特定群体的任何努力。以前所有建立和分化ES细胞聚集体的工作在它们的方法学中具有以下组成部分的一个或多个:1)利用小鼠而不是人ES细胞，2)依赖离心聚集细胞的的强迫聚集方案而不是正常的细胞粘附过程，3)细胞大块在静态条件下的聚集，4)非单细胞解离或将细胞从表面刮擦下来以生成聚集体，5)利用15-20%的胎牛血清的细胞聚集体的非直接分化，从而形成胚状体和全胚层的细胞类型，6)在“悬滴”条件下形成，其仅能在小规模下进行。据我们所知，不利用15-20%FCS分化胚状体的唯一研究描述了这样一个方案:其中细胞聚集体通过强迫聚集形成，然后利用适于中胚层的培养基立即分化聚集体(Ng et al.，2005，Blood.106:1601)。然而，在本工作中，研究者们在静态聚集培养10-12天后将胚状体转移到非聚集贴壁培养，使与本申请的比较不相关。与所有以前的工作相比，本申请提出的方法I)将人ES细胞解离为单细胞，然后通过在最优化聚集体直径和细胞存活的改善调控的剪切速率下的旋转培养生成聚集体，2)直接将ES细胞聚集体分化为定形内胚层，然后前肠内胚层，然后前胰腺前肠内胚层，然后胰腺内胚层，以及最后胰腺内分泌细胞。该分化方案高效产生定形内胚层和胰腺谱系群，同时污染群体最小化。而且，与所有其他发表的研究完全相反，该ES细胞聚集和分化的方案不产生胚状体。
[0166]胚状体是分化的和未分化细胞的混合物，通常由来自几个胚层的细胞组成，并且经历随机分化，与之相反，本文描述的细胞聚集体实质上或基本上是同质细胞的，作为例如胚胎细胞、定形内胚层、前肠内胚层、PDXl阳性胰腺内胚层、胰腺内分泌细胞等的多能、专能、双能或单能类型细胞的聚集体存在。
[0167]本发明通过提供能够再现地制备大小和形状基本上均一的细胞聚集体的有成本效益的生产过程或方法解决了上述问题，所述生产过程或方法利用容易地应用于大规模生产的过程。在一个具体实施方案中，利用本发明的细胞培养基，在悬浮培养中扩增可分化细胞。在另一具体实施方案中，可分化细胞可以以悬浮的形式维持和扩增，即，它们保持未分化或被阻止进一步分化。在细胞培养的上下文中，术语“扩增”用其本领域所使用的含义，指细胞增殖，以及增加细胞的数目，优选增加存活细胞的数目。在具体的实施方案中，通过培养超过约I天，即约24小时在细胞悬浮液中扩增细胞。在更具体的实施方案中，通过培养至少1、2、3、4、5、6、7 天或至少2、3、4、5、6、7、8周在悬浮培养中扩增细胞。
[0168]本文描述的分化培养条件和hES衍生的细胞类型与前面D’ Amour et al.2006中描述的那些基本类似。D’ Amour et al.2006描述了 5步分化方案；阶段I (基本上导致定形内胚层产生)，阶段2(基本上导致rox1-阴性前肠内胚层产生)，阶段3(基本上导致PDXl-阳性前肠内胚层产生)，阶段4 (基本上导致胰腺内胚层或上皮或胰腺内分泌祖细胞产生)以及阶段5 (基本上导致激素表达内分泌细胞产生)。重要地，所有这些细胞第一次能够通过本文描述的悬浮方法产生。
[0169]如本文所用的，“定形内胚层(DE) ”指能够分化为肠管细胞或衍生自肠管的器官的专能内胚层谱系细胞。根据某些实施方案中，定形内胚层细胞是哺乳动物细胞，以及在优选的实施方案中，定形内胚层细胞是人细胞。在本发明的一些实施方案中，定形内胚层细胞表达或不能显著表达某些标志物。在一些实施方案中，选自S0X17、CXCR4、MIXLU GATA4、HNF3beta、GSC、FGF17、VWF、CALCR、FOXQl、CMKORl、CRIPl 和 CER 的一种或多种标志物表达在定形内胚层细胞中。在其他实施方案中，选自0CT4、α-甲胎蛋白(AFP)、凝血调节蛋白(TM)、SPARC、S0X7和HNF4 α的一种或多种标志物没有显著表达在定形内胚层细胞中。定形内胚层细胞群和其制备方法还描述于2004年12月13日提交的、题目为“DEFINITIVEENDODERM(定形内胚层)”、申请号为11/021，618的美国专利申请中，该申请整体并入本文。
[0170]本发明的其他实施方案涉及称为“PDX1-阴性前肠内胚层细胞”、“前肠内胚层细胞”或其等同物的细胞培养物和细胞聚集体。PDXl-阴性前肠内胚层细胞也是专能的，并且能够产生多种细胞和组织，包括但不限于胸腺、甲状腺、甲状旁腺、肺/支气管、肝、咽、咽囊、十二指肠和咽鼓管的部分。在一些实施方案中，与非前肠内胚层细胞相比，例如不明显表达这些标志物的定形内胚层或rox阳性内胚层，前肠内胚层细胞表达的S0X17、HNF1B、HNFl a ,FOXAl水平增加。PDXl-阴性前肠内胚层细胞还表达低至零水平的H)X1、AFP、S0X7和SOXl。PDXl-阴性前肠内胚层细胞群以及其制备方法还描述于2006年10月27日提交的、题目为 “PDXl-expressing dorsal and ventral foregut endoderm(F1DXl 表达的背和腹部前肠内胚层)”的、申请号为11/588，693的美国专利申请中，该申请通过引用的方式以其整体并入本文。
[0171]本发明其他的实施方案涉及“rox1-阳性胰腺前肠内胚层细胞”、“PDX1-阳性前胰腺内胚层”或其等同物的细胞培养物。PDXl-阳性前胰腺内胚层细胞是专能的，并且能够产生多种细胞和/或组织，包括但不限于胃、小肠和胰腺。在一些实施方案中，与不明显表达这些标志物的非前胰腺内胚层细胞相比，PDXl-阳性前胰腺内胚层细胞表达的H)X1、HNF6、S0X9和PROXl的水平增加。PDXl-阳性前胰腺内胚层细胞还表达低至零水平的NKX6.1、PTF1A、CPA 和 cMYC。
[0172]本发明的其他实施方案涉及“PDX1-阳性胰腺内胚层细胞”、“PDX1-阳性胰腺祖细胞”、“胰腺上皮”、“PE”或其等同物的细胞培养物。PDXl-阳性胰腺祖细胞是专能的，并且能够在胰腺中产生多种细胞，包括但不限于腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞。在一些实施方案中，与不明显表达roxi和NKX6.1的非前胰腺内胚层细胞相比，PDXl-阳性胰腺祖细胞表达的这些标志物的的水平增加。PDXl-阳性胰腺祖细胞还表达低至零水平的PTF1A、CPA、cMYC、NGN3、PAX4、ARX `和 NKX2.2、INS、GCG、GHRL, SST 以及 PP。
[0173]可选择地，本发明的其他实施方案涉及“rox1-阳性胰腺内胚层尖细胞”或其等同物的细胞培养物。在一些实施方案中，PDX1-阳性胰腺内胚层尖细胞表达的roxi和NKX6.1的水平增加，这与rox1-阳性胰腺祖细胞相似，但与rox1-阳性胰腺祖细胞不同，pdx1-阳性胰腺内胚层尖细胞额外表达的PTF1A、CPA和cMYC的水平增加。PDXl-阳性胰腺内胚层尖细胞还表达低至零水平的NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2、INS、GCG、GHRL, SST以及PP。
[0174]仍然，本发明的其他实施方案涉及“胰腺内分泌前体细胞”、“胰腺内分泌祖细胞”或其等同物的细胞培养物。胰腺内分泌祖细胞是专能的，并且产生成熟内分泌细胞，包括α、β、δ和PP细胞。在一些实施方案中，与其他非分泌祖细胞类型相比，胰腺内分泌祖细胞表达的NGN3、PAX4、ARX和NKX2.2的水平增加。胰腺祖细胞还表达低至零水平的INS、GCG、GHRL、SST 和 PP。
[0175]仍然，本发明的其他实施方案涉及“胰腺内分泌细胞”、“胰腺激素分泌细胞”、“胰岛激素表达细胞”或其等同物的细胞培养物，指从多能细胞如α、β、δ和/或PP细胞或其组合体外衍生的细胞。内分泌细胞可以是多激素或单激素的，例如表达胰岛素、胰高血糖素、胃饥饿素、生长抑素和胰腺多肽或其组合。因此，内分泌细胞能够表达一种或多种胰腺激素，其至少具有人胰岛细胞的一些功能。胰岛激素表达细胞可以是成熟的或不成熟的。基于某些标志物的差异表达或者基于它们的作用能力，例如体外和体内的葡萄糖反应，能够将不成熟的胰岛激素表达细胞与成熟胰腺胰岛表达细胞区分开。胰腺内分泌细胞还表达低至零水平的 NGN3、PAX4、ARX 和 NKX2.2。
[0176]与间质定形内胚层细胞相比，上数细胞类型的大多数是上皮型的。在一些实施方案中，胰腺内胚层细胞表达选自2006年10月27日提交、题目为“PDX1EXPRESSING DOSALAND VENTRAL FORE⑶T ENDODERM(PDX1表达的背和腹部前肠内胚层)”的相关美国专利申请第11/588，693号的表3的一种或多种标志物,和/或一种或多种选自该申请中表4的标志物，以及还有2005年4月26日提交、题目为“PDXl-expressing endoderm (PDX1-表达内胚层)”、申请号为11/115，868的美国专利申请，这两篇美国专利申请通过引用的方式整体并入本文。
[0177]本发明考虑用于可分化细胞的组合物和方法，不管它们的来源或它们的可塑性。细胞的“可塑性”用于本文大致如同本领域所使用的。也就是说，细胞的可塑性指细胞分化为特定细胞类型的能力，所述特定细胞类型存在于来自胚胎、胎儿或发育的有机体的组织或器官中。细胞“越可塑”，则细胞能够分化为的组织越多。“多能细胞”包括细胞及其子代，其可以能够分化为或产生多能、专能、寡能和单能细胞，和/或存在于胚胎、胎儿或发育的生物体的成熟或部分成熟细胞类型中的几种，如果不是全部的话。“专能细胞”包括细胞和其子代，其可以能够分化为或生成专能、寡能和单能组细胞，和/或一种或多种成熟或部分成熟的细胞类型，除了衍生自专能细胞的成熟或部分成熟的细胞类型局限于特定组织、器官或器官系统的细胞。例如，专能造血组细胞和/或其子代具有分化为或生成一种或多种类型的寡能细胞，诸如骨髓祖细胞和淋巴祖细胞的能力，并且还生成通常在血液中存在的其他成熟的细胞组分。“寡能细胞”包括细胞和其子代，其分化为成熟或部分成熟的细胞的能力比专能细胞更为局限。然而，寡能细胞仍可以具有分化为寡能和单能细胞和/或给定组织、器官或器官系统的一种或多种成熟或部分成熟的细胞类型的能力。寡能细胞的一个实例是骨髓祖细胞，其能够最终产生成熟的或部分成熟的红细胞、血小板、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞。“单能细胞”包括具有分化为或产生其他单能细胞和/或一种类型的成熟或部分成熟细胞类型的能力的细胞和其子代。
[0178]如本文使用的，可分化细胞可以是多能的、专能的、寡能的甚或单能的。在本发明的某些实施方案中，可分化细胞是多能可分化细胞。在更具体的实施方案中，多能可分化细胞选自胚胎干细胞、ICM/上胚层细胞、原始外胚层细胞、原始生殖细胞和畸胎癌细胞。在一个具体实施方案中，可分化细胞是哺乳动物胚胎干细胞。在更具体的实施方案中，可分化细胞是人胚胎干细胞。
[0179]本发明还考虑来自动物内任何来源的可分化细胞，只要该细胞是如本文所定义的可分化的。例如，可分化细胞可以获自胚胎或其中的任一原始胚层，获自胎盘或绒毛膜组织，或者获自更成熟的组织诸如成体干细胞，包括但不限于脂肪、骨髓、神经组织、乳腺组织、肝组织、胰腺、上皮、呼吸组织、性腺和肌肉组织。在具体实施方案中，可分化的细胞是胚胎干细胞。在其他具体实施方案中，可分化的细胞是成体干细胞。仍在其他具体实施方案中，干细胞是胎盘-或绒毛膜衍生的干细胞。
[0180]当然，本发明考虑使用来自任何能够产生可分化细胞的动物的可分化细胞。获得可分化细胞的动物可以是脊椎动物或是无脊椎动物、哺乳动物或是非哺乳动物、人类或非人类。动物来源的实例包括但不限于灵长类、啮齿类、犬、猫科、马、牛和猪。
[0181]可以利用本领域技术人员已知的任一方法衍生本发明的可分化细胞。例如，人多能细胞可以利用去分化和核转移方法来制备。另外地，用于本发明的人ICM/上胚层细胞或原始外胚层细胞可以在体内或体外衍生。原始外胚层细胞可以在贴壁培养中产生或在悬浮培养中作为细胞聚集体产生，如W099/53021中所描述的。此外，能够利用本领域已知的任何方法传代人多能细胞，这些方法包括人工传代方法和诸如酶促或非酶促传代的大体积传代方法。
[0182]在某些实施方案中，当利用ES细胞时，胚胎干细胞具有正常的核型，而在其他实施方案中，胚胎干细胞具有异常的核型。在一个实施方案中，大多数胚胎干细胞具有正常核型。预期大于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或大于95%的经检测的细胞分裂中期的细胞会显示正常核型。
[0183]在另一实施方案中，大多数胚胎干细胞具有异常核型。预期大于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或者大于95%的经检测的细胞分裂中期的细胞会显示异常核型。在某些实施方案中，细胞被培养超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20代后，异常核型是明显的。在一个具体实施方案中，异常核型包括至少一个常染色体的三体性，其中常染色体选自染色体1、7、8、12、14和17。在另一实施方案中，异常核型包括多于一个常染色体的三体性，其中多个常染色体的至少一个选自染色体1、7、8、12、14和17。在一个实施方案中，常染色体是染色体12或17。在另一实施方案中，异常核型包括另外的性染色体。在一个实施方案中，核型包括两个X染色体和一个Y染色体。还预期，染色体的易位可以发生，以及这种易位包括在术语“异常核型”中。前述染色体异常和其他染色体异常的组合也包括在本发明内。
[0184]组合物和方法包括基础盐营养液。如本文使用的，基础盐营养液指盐的混合物，其提供给细胞正常细胞代谢所需的水和某些大量的无机离子，维持细胞内和细胞外渗透平衡，提供碳水化合物作为能量源，以及提供缓冲系统以维持培养基在生理PH范围内。基础盐营养液的实例包括但不限于达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco’ sModifiedEagle’ sMedium, DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础伊格尔培养基(Basal EagleMedium, BME)、RPM11640、Ham’s F_10、Ham’s F-12、α -最小必需培养基(a MEM) ,Glasgow's最小必需培养基(G-MEM)和伊思考夫改良达尔伯克氏培养基(Iscove’ s ModifiedDulbecco's Medium)，以及其混合物。在一个特定实施方案中，基础盐营养液是DMEM和Ham’ s Fl2近似50:50的混合物。
[0185]预期组合物还包含微量元素。微量元素可以商购，例如，从Mediatech购买。微量元素的非限定性实例包括但不限于化合物，包括铝、氯、硫酸盐、铁、镉、钴、铬、锗、钠、钾、钙、磷和镁。含有微量元素的化合物的具体实例包括但不限于A1C13、AgN03、Ba(C2H3O2)2,CdCl2、CdS04、CoCl2、CrCl3、Cr2 (SO4) 3、CuS04、柠檬酸铁、Ge02、K1、KBr、L1、钥酸、MnS04、MnCl2、NaF、Na2SiO3, NaVO3, NH4VO3, (NH4) 6Mo7024、NiSO4, RbCl、硒、Na2SeO3、H2Se03、亚硒酸二钠、硒基甲硫氨酸、SnCl2, ZnSO4, ZrOCl2,以及其混合物和盐。如果存在硒、亚硒酸盐或硒基甲硫氨酸，它的浓度为约0.002至约0.02mg/L。此外，还可以存在羟基磷灰石。
[0186]预期氨基酸可以添加至限定培养基。这种氨基酸的非限定实例是甘氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酸、L-谷氨酸/Glutamax、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺一水合物、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、L-胱氨酸2HC1、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐一水合物、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物和L-缬氨酸。在某些实施方案中，氨基酸是L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-缬氨酸以及其混合物。
[0187]还预期，限定培养基能够包含抗坏血酸。优选地，抗坏血酸以约lmg/L至约1000mg/L的起始浓度存在，或者从约2mg/L至约500mg/L,或者从约5mg/L至约100mg/L,或者从约10mg/L至约100mg/L或者约在50mg/L。
[0188]此外，组合物和方法还可以包括其他组分，诸如血清白蛋白、转铁蛋白、L-谷氨酰胺、脂类、抗生素、β-巯基乙醇、维生素、矿物质，可以存在ATP和类似组分。可以存在的维生素的实例包括但不限于维生素 A、B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、D1、D2、D3、D4、D5、E、生育三烯酚、Kl和K2。本领域技术人员能够确定用于给定培养的矿物质、维生素、ATP、脂类、必需脂肪酸等的最佳浓度。补加剂的浓度可以，例如为从约0.001 μ M至约ImM或更高。可以提供的补加剂的浓度的具体实例包括但不限于约0.005 μ Μ、0.01 μ Μ、0.05 μ Μ、0.1 μ Μ、0.5μΜ、1.0μΜ、2.0μΜ、2.5μΜ、3.0μΜ4.0μΜ、5.0μΜ、10μΜ、20μΜ、100μΜ 等。在一个具体实施方案中，组合物和方法包括维生素Β6和谷氨酰胺。在另一具体实施方案中，组合物和方法包括维生素C和铁补加剂。在另一具体实施方案中，组合物和方法包含维生素Kl和维生素Α。在另一具体实施方案中，组合物和方法包括维生素D3和ΑΤΡ。在另一具体实施方案中，组合物和方法包括维生素Β12和转铁蛋白。在另一具体实施方案中，组合物和方法包含生育三烯酚和β_巯基乙醇。在另一具体实施方案中，组合物和方法包含谷氨酰胺和ΑΤΡ。在另一具体实施方案中，组合物和方法包含ω-3脂肪酸和谷氨酰胺。在另一具体实施方案中，组合物和方法包含ω-6脂肪酸和维生素在另一具体实施方案中，组合物和方法包含α -亚麻酸和B2。
[0189]本发明的组合物实质上无血清。如本文所用的，“实质上无血清”指在本发明的溶液中不存在血清。血清不是本发 明的组合物和方法的必需成分。因此，血清在任一组合物中的存在仅应该归因于杂质，例如，来自起始物质或来自原代细胞培养物的残余血清。例如，实质上无血清培养基或环境能够包含少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的血清，其中仍然观察到培养基或环境的目前改善的生物活性维持能力。在本发明的具体实施方案中，实质上无血清的组合物不包含血清或血清替代物，或者仅包含来自分离添加至限定培养基的血清或血清替代物组分的微量血清或血清替代物。
[0190]本发明的组合物和方法还包括用于刺激可分化细胞内ErbB2酪氨酸激酶活性的方法。在一个具体实施方案中，本发明的组合物和方法包括至少一种ErbB3配体的存在。通常，ErbB3配体会结合ErbB3受体，并且与ErbB2受体二聚化。ErbB2受体进而一般负责可分化细胞内的细胞内酪氨酸激酶活性。
[0191]如本文使用的，“ErbB3配体”指能结合ErbB3的配体，ErbB3进而与ErbB2 二聚化，由此活化了 ErbB2/ErbB3异二聚体受体的ErbB2部分的酪氨酸激酶活性。ErbB3配体的非限定性实例包括神经调节蛋白-1 ;神经调节蛋白-1的剪接变体和同种型，包括但不限于HRG-β、HRG-α、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2(GGF2)以及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF);神经调节蛋白_2，神经调节蛋白-2的剪接变体和同种型，包括但不限于NRG2-13，外调蛋白(Epiregulin)和双调蛋白(Biregulin)。
[0192]在一个实施方案中，用于刺激ErbB2_定向的酪氨酸激酶活性的方法包括至少一种 ErbB3 配体,其选自神经调节蛋白-1、Heregulin- β (HRG- β )、Heregulin- a (HRG- α )、Neu分化因子(NDF)、乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)、神经胶质生长因子2 (GGF2)、运动神经元衍生因子(SMDF)、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-2β (NRG2-13)、外调蛋白、双调蛋白以及其变体和功能片段。在另一具体实施方案中，本发明的组合物和方法包括用于刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶活性的多种方法，诸如但不限于利用多种ErbB3配体。
[0193]在本发明的组合物和方法的更具体实施方案中，ErbB3配体是HRG-β或其变体或功能片段。在一个实施方案中，衍生培养添加蛋白、多肽或其变体或功能片段的种类与培养的细胞的种类相同。例如，如果培养小鼠ES细胞，具有与小鼠(mus musculus)HRG-^序列相同的氨基酸序列的HRG-β被用作培养添加剂，以及被视为是“相同种类的”。在其他实施方案中，衍生生物添加剂的种类不同于培养的细胞。例如，如果培养小鼠ES细胞，具有与人HRG-β序列相同的氨基酸序列的HRG-β用作培养基的添加剂，并且被视为“不同种类的”。
[0194]如本文使用的，“功能片段”是与全长多肽发挥相似生理或细胞效应的全长多肽的片段或剪接变体。功能片段的生物效应在范围或强度上不必与全长多肽相同，只要观测到相似得生理或细胞效应即可。例如，HRG-β的功能片段能够可检测地刺激ErbB2-定向的酪氨酸激酶。
[0195]如本文所用的，术语 “变体”包括嵌合的或融合的多肽、同系物(homolog)、类似物、直向同源物、和旁系同源物。此外，参考蛋白或多肽的变体是其氨基酸序列与参考蛋白或多肽至少约80%相同的蛋白或多肽。在具体实施方案中，变体与参考蛋白或多肽至少约85%、90%、95%、95%、97%、98%、99%甚或100%相同。如本文所用的，术语“对应于(correspond(s)to) ”和“对应于(corresponding to) ”当涉及序列比对时,意指参考蛋白或多肽,例如野生型人或小鼠神经调节蛋白-1内列举的位置，以及与参考蛋白或多肽上的位置对齐的修饰的蛋白或多肽中的那些位置。因此，当目标蛋白(subject protein)或多肽的氨基酸序列与参考蛋白或多肽的氨基酸序列对齐时，“对应于”参考蛋白或多肽序列的某些列举位置的序列是与参考序列的这些位置对齐但并不必然位于参考序列的这些精确数值位置的那些序列。用于确定序列间的对应氨基酸的比对序列的方法在下文有描述。
[0196]例如，具有与参考氨基酸序列(例如，编码TGF-β的序列)至少约95% “相同”的氨基酸序列的多肽被理解为指该多肽的氨基酸序列与参考序列相同，除了该氨基酸序列可以在编码参考TGF-β的参考氨基酸序列的每100个氨基酸中包括多达约5个修饰。换句话说，为了获得具有与参考氨基酸序列至少约95%相同的氨基酸序列的肽，参考序列的多达约5%氨基酸残基可以被缺失或由另一氨基酸取代，或者可以将多达参考序列的总氨基酸约5%的多个氨基酸插入参考序列。参考序列的这些修饰可以发生在参考氨基酸序列的N-末端或C-末端位置，或者发生在那些末端位置的任一处，单独散置在参考序列的氨基酸间，或者参考序列内的一个或多个邻近组(contiguous group)中。
[0197]如本文所用的，“同一性(identity)”是核苷酸序列或氨基酸序列与参考核苷酸或氨基酸序列相比的同一性度量。一般而言，对比序列以获得最高阶匹配。“同一性”本身具有本领域认可的含义，并且能够利用发表的技术来计算。(参见，例如，ComputationalMolecular Biology (计算分子生物学)，Lesk, Α.Μ.，ed.，Oxford University Press, NewYork (1988) ; Biocomputing:1nformatics And Genome Pro jects (生物计算:信息和基因组项目)，Smith, D.W.，ed.，Academic Press, New York(1993);Computer Analysisof Sequence Data(序列数据的计算机分析)，Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G.,eds., Humana Press, New Jersey(1994);von Heinje, G.，Sequence Analysis InMolecular Biology (分子生物学的序列分析)，Academic Press (1987);以及 SequenceAnalysis Primer (序列分析引物)，Gribskov, M.and Devereux, J., eds., M StocktonPress, New York(1991))。尽管存在测量两个多核苷酸或多肽序列间同一'I"生的几种方法，但术语“同一性”为本领域技术人员所熟知(Carillo, H.&Lipton, D.，Siam J AppliedMath48:1073 (1988))。确定两序列间同一性或相似性常用的方法包括，但不限于在Guideto Huge Computers (巨型计算机指南)，Martin J.Bishop, ed., Academic Press, SanDiego(1994)and Carillo, H.&Lipton, D., Siam J Applied Math48:1073(1988)中公开的那些。计算机程序还可以包含计算同一性和相似性的方法和算法。确定两个序列间同一性和相似性的计算机程序方法的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux, etal.1984，Nucleic Acids Researchl2:387)、BLASTP, ExPASy, BLASTN、FASTA (Atschul, etal.1990, J Molec Biol215:403)和FASTDB。确定同一性和相似性的方法的实例讨论于Michaels&Garian, 2000, Current Protocols in Protein Science (蛋白质科学最新方法)，Voll，John Wiley&Sons, Inc.,其通过引用并入本文。在本发明的一个实施方案中,用于确定两个或更多个多肽间同一性的算法是BLASTP。
[0198]在本发明的另一实施方案中，用于确定两个或更多个多肽间同一性的算法是FASTDB,其基于 Brutlag 等的算法(1990，Comp.App.Biosc1.6:237-245，其通过引用并入本文)。在FASTDB序列比对中，查询 序列和目标序列(subject sequence)是氨基酸序列。序列比对的结果是同一性百分比。可以用于计算同一性百分比的氨基酸序列的FASTDB比对的参数包括但不限于矩阵(Matrix)=PAM, k_维(tuple) =2，错配罚分(MismatchPenalty) =1,联合罚分(Joining Penalty) =20,随机组长度(Randomization GroupLength) =0,截止分数(Cutoff Score) =1,空位罚分(Gap Penalty) =5，空位大小罚分(GapSize Penalty)0.05,窗口大小(Window Size) =500或目标氨基酸序列的长度,无论哪个更短。
[0199]如果目标序列由于N-末端或C-末端添加或缺失而不是由于内部的添加或缺失而短或长于查询序列，可以进行人工校正，因为当计算同一性百分比时，FASTDB程序不计算目标序列的N-末端和C-末端截断或添加。对于5’或3’末端截断的目标序列，相对于查询序列，通过将在不匹配/对齐的参考序列的N末端和C末端的查询序列碱基的数目计算为查询序列总碱基的百分比，来校正同一性百分比。FASTDB序列比对的结果确定匹配/对齐。然后从同一性百分比减去对齐百分比以达到最终同一性百分比分数，这通过利用指定参数的上述FASTDB程序来计算。该校正的分数能够用于以下目的:确定对比结果如何彼此“对应”，以及同一性百分比。处于人工调整同一性百分比分数的目的，可以考虑分别延伸超过参考或目标序列的N-或C-末端的查询(受试)序列或参考序列的残基。也就是说，当人工调整同一性百分比得分或对齐数目时，可以计数不与对照序列的N或C末端匹配/对齐的残基。
[0200]例如，将90个氣基酸残基的目标序列与100个残基的参考序列比对，以确定同一性百分比。缺失发生在受试序列的N-末端，因此，FASTDB比对没有显示N-末端前10个残基的匹配/对齐。10个不成对的残基表示序列的10% (N-和C-末端的不匹配残基数目/查询序列的残基总数目)，从而将10%从FASTDB程序计算出的同一性百分比中减除。如果剩余的90个残基完全匹配，则最终的同一性百分比会是90%。在另一实施例中，90个残基的目标序列与100个残基的参考序列比较。这一次，缺失是内部缺失，因此在不与查询序列匹配/对齐的受试序列没有N-或C-末端。在这种情况下，不人工校正通过FASTDB计算的同一性百分比。
[0201]本发明还提供了嵌合的或融合的多肽。如本文所用的，“嵌合”多肽或“融合多肽”包含参考多肽一成员的至少一部分，所述参考多肽可操作地连接到第二不同多肽。第二多肽具有对应于与参考多肽基本上不相同的且衍生自相同或不同的生物体的多肽的氨基酸序列。关于融合多肽，术语“可操作地连接”意指参考多肽和第二多肽彼此融合，以使两序列实现归因于所使用序列的提议的功能。第二多肽可以融合到参考多肽的N-末端或C-末端。例如，在一个实施方案中，融合多肽是GST-1GF-1融合多肽，其中IGF-1序列融合到GST序列的C-末端。这种融合多肽能够促进重组多肽的纯化。在另一实施方案中，融合多肽能够在N-末端包含异源信号序列。在某些宿主细胞中(例如，哺乳动物宿主细胞)，能够通过利用异源性信号序列增加多肽的表达和/或分泌。
[0202]除了片段和融合多肽外，本发明还包括天然存在多肽的同系物和类似物。“同系物”在本文被定义为分别具有相似或“相同的”核苷酸或多肽序列的两个核酸或多肽。同系物包括等位变体、直系同源物、旁系同源物、如下文定义的激动剂和拮抗剂。术语“同系物”还包括由于遗传密码的兼并性而不同与参考核苷酸序列的核酸分子，以及由此编码与参考核苷酸序列编码的多肽相同的多肽。如本文所用的，“天然存在的”指存在于自然界的核酸或氨基酸序列。
`[0203]多肽的激动剂能够保留基本上相同的多肽的生物活性，或多肽的生物活性的子集。多肽的拮抗剂能够抑制天然存在形式的多肽的一种或多种活性。
[0204]在本发明的组合物和方法的另一更为具体的实施方案中，ErbB3配体是HRG-β或其变体或功能片段。ErbB3配体另外的非限定性实例披露于美国第6，136，558,6, 387，638和7，063，961号专利中，这些专利通过引用并入本文。
[0205]基于在其C-末端部分不同的两种变异EGF-样结构域,Heregulins —般被分类为两种主要类型:α和β。然而，这些EGF-样结构域在包含其中的六个半胱氨酸残基的间隔中是相同的。基于氨基酸序列比较，Holmes等发现在EGF-样结构域的第一和第六个半胱氨酸间，HRGs与肝素结合EGF-样生长因子(HB-EGF) 45%相似，与双调蛋白(AR) 35%相同，与TGF- α 32%相同，与EGF27%相同。
[0206]44kDa的neu分化因子(NDF)是人HRG的大鼠等同物。与HRG多肽一样，NDF具有免疫球蛋白(Ig)同源结构域，随后是EGF样结构域，并且缺乏N-末端信号肽。目前，至少有六种不同的成纤维细胞的pro-NDFs，基于EGF样结构域的序列，分类为α或β多肽。基于EGF样结构域和跨膜结构域间的一段可变序列，分类为同种型I至4。因此，看起来，不同的NDF同种型通过可变剪接产生，并且可以实施截然不同的组织特异性功能。参见，欧洲专利第505148号；以及国际专利
【发明者】托马斯·C·斯库尔兹 申请人:韦尔赛特公司