一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶及其应用，属于啤酒酿造【技术领域】。是从大麦麦芽中分离纯化出阿拉伯呋喃糖苷水解酶(Arabinoxylan?arabinofuranohydrolase，AXAH)，将其添加到麦芽汁糖化过程中，使麦汁过滤性能得到改善。本发明方法可提高啤酒的生产效率，降低啤酒生产的成本，特别适合用于改善国产大麦明显的质量不足。
【专利说明】一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于啤酒酿造【技术领域】，涉及一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶及其改善啤酒大麦麦芽过滤性能的方法。
【背景技术】
[0002]大麦麦芽作为啤酒酿造的主要原料，在啤酒酿造中有着举足轻重的作用。而国内部分大麦制得的麦芽与进口优质大麦麦芽相比，品质存在不少缺陷，过滤性能缺陷就是其中之一，如麦芽制得的麦汁过滤困难，易浑浊，浸出率低等，严重制约了其在中国啤酒行业中的应用。
[0003]目前市场上针对于麦芽过滤性能缺陷开发出了多种酶制剂，葡聚糖内切酶、阿拉伯木聚糖内切酶、蛋白酶是主要成分，但是国内啤酒大麦麦芽的过滤性能仍然没有较明显的改观。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种阿拉伯呋喃糖苷水解酶(AXAH)用于提高麦芽汁过滤性能的方法。
[0005]是在麦芽糖化过程中加入阿拉伯呋喃糖苷水解酶。
[0006]所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶添加量为4~8mU/g麦芽。
[0007]所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]目前常用于改善麦芽汁过滤性能有多种酶制剂，例如β-葡聚糖内切酶和阿拉伯木聚糖内切酶，但是现有技术中阿拉伯呋喃糖苷水解酶未有应用，因此，阿拉伯呋喃糖苷水解酶还可以与其他常用酶制剂一起改善麦芽汁过滤性能。
[0009]为了提高阿拉伯呋喃糖苷水解酶作用效果，优选在糖化的初始阶段进行添加，从而使麦芽制得麦汁的过滤性能得到有效的改善方法。
[0010]本发明是在大麦麦芽中分离纯化出阿拉伯呋喃糖苷水解酶(ΑΧΑΗ)，包括如下步骤:
[0011](I)大麦麦芽粗酶液的制备。大麦麦芽粉碎，与pH5.0,0.lmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液以1:4~5混合，4°C浸提过夜，离心取上清液，进行硫酸铵分级沉淀，离心弃上清，用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液复溶沉淀物，将复溶液加到1000Da的透析袋中，pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，离心去除变性蛋白得到粗酶液。
[0012](2)将(I)得到的粗酶液按顺序依次通过阳离子柱、阴离子柱和凝胶柱，使AXAH得到分离纯化。
[0013]①阳离子交换柱层析:
[0014]填料:HiPr印16/10SP FF ;平衡液:ρΗ5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积:IOOmL ;流速4mL/Tub/min ;洗脱液:pH5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液(含lmol/L NaCl);上样:粗酶液，收集穿透峰部分。
[0015]②阴离子交换柱层析:[0016]填料:HiPr印16/10Q FF ;平衡液:pH5.2左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积:60mL ;流速4mL/Tub/min ;洗脱液:pH5.2左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液(含lmol/L NaCl )，线性洗脱IOOmL ;上样:经阳离子交换柱层析穿透部分，浓缩换缓冲液为PH5.2左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上样，收集洗脱峰有酶活部分。
[0017]③凝胶柱层析:
[0018]填料:HiPrepl6/60SephacrylS-100HR ;平衡、洗脱液:ρΗ5.0 左右、50mmol/L 醋酸-醋酸盐缓冲液(含0.15mol/L NaCl);流速0.5mL/Tub/min ;上样:经阴离子交换柱层析吸附有酶活部分，浓缩换缓冲液为PH5.0左右、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上样，收集有酶活峰，并冷冻干燥冻成干粉。
[0019]上述的方法在实际操作中可以是:
[0020]( I)大麦麦芽AXAH粗提液的制备
[0021]取大麦麦芽用EBC-LF麦芽标准粉碎机进行2目粉碎与pH5.0,0.lmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液以1:4~5混合，4°C浸提过夜(中间进行几次搅拌)，用离心机1000Or/min、离心15min，取上清液，进行硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度20~40%之间的沉淀，用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液复溶沉淀物，用排阻1000Da的透析袋透析，pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，离心机10000r/min、离心15min去除变性蛋白，上清即为AXAH粗酶液。
[0022](2)阳离子交换柱层析:填料:HiPrepl6/10SP FF ;柱体积20mL ;平衡液:ρΗ5.0、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积:IOOmL ；流速4mL/Tub/min ;洗脱液:pH5.0、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液(含lmol/L NaCl);上样:硫酸铵分级沉淀处理后的粗酶液；UV280nm检测，收集有酶活部分。
[0023](3)阴离子交换柱层析:填料:HiPrepl6/10Q FF ;柱体积20mL ;平衡液:pH5.2、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积:60mL ；流速4mL/Tub/min ;洗脱液:pH5.2、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液(含0.5mol/L NaCl )，线性洗脱IOOmL ;上样:经阳离子交换柱层析穿透部分，浓缩换缓冲液为pH5.2、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上；UV280nm检测，收集有酶活部分。
[0024](4)凝胶柱层析:填料:HiPrepl6/60Sephacryl S-100HR ;柱体积 120mL ;平衡、洗脱液:pH5.0、50mmol/L 醋酸-醋酸盐缓冲液(含 0.15mol/L NaCl);流速 0.5mL/Tub/min ;上样:经阴离子交换柱层析吸附有酶活部分，浓缩换缓冲液为pH5.0、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上样，UV280nm检测，收集有酶活峰，并冷冻干燥冻成干粉。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
[0026]本发明通过在糖化过程中添加阿拉伯呋喃糖苷水解酶，麦汁的过滤速度和浸出率逐步升高，粘度降低，明显改善麦汁的过滤性能。其作用机理可能是通过去除阿拉伯木聚糖支链，可能改变了阿拉伯木聚糖的空间结构，使得其他酶得到更好的作用，从而加速了阿拉伯木聚糖的降解等，进而使麦汁的过滤性能得到改善。
[0027]本发明中分离的阿拉伯呋喃糖苷水解酶(AXAH)，在麦芽糖化过程中添加，通过自身作用及其与其他酶的协同作用，可更有效的改善麦芽的过滤性能，可用于加快啤酒生产过程、降低啤酒生产成本，也为酶制剂的复配提供新的思路和改进方法，具有较好的产业化应用前景。【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1阿拉伯呋喃糖苷水解酶(AXAH)纯化各阶段SDS-PAGE电泳图谱；
[0029](M:maker ；1:麦芽浸提液；2:硫酸铵沉淀样；3 =HiTrap SP FF柱层析后样；4:HiTrap Q FF柱层析后样；5:Sephacryl S-100HR凝胶柱层析后样)。
【具体实施方式】
[0030]实施例1:AXAH的分离纯化(以大麦麦芽为例)
[0031](I)大麦麦芽AXAH粗提液的制备:取大麦麦芽用EBC-LF麦芽标准粉碎机进行2目粉碎与pH5.0、0.lmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液以1:4~5混合，4°C浸提过夜(中间进行几次搅拌)，用离心机10000r/min、离心15min,取上清液,进行硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度20~40%之间的沉淀，用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液复溶沉淀物，用排阻1000Da的透析袋透析，pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液透析至无硫酸根离子，离心机10000r/min、离心15min去除变性蛋白，上清即为AXAH粗酶液。
[0032](2)阳离子交换柱层析:填料:HiPrepl6/10SP FF ;柱体积20mL ;平衡液:ρΗ5.0、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积:IOOmL ；流速4mL/Tub/min ;洗脱液:pH5.0、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液(含lmol/L NaCl);上样:硫酸铵分级沉淀处理后的粗酶液；UV280nm检测，收集穿透峰部分。
[0033](3)阴离子交换柱层析:填料:HiPrepl6/10Q FF ;柱体积20mL ;平衡液:ρΗ5.2、50mmol/L醋酸-醋酸盐缓冲液；平衡体积:60mL ；流速4mL/Tub/min ;洗脱液:pH5.2、50mmol/L醋酸-醋酸盐 缓冲液(含0.5mol/L NaCl )，线性洗脱IOOmL ;上样:经阳离子交换柱层析穿透部分，浓缩换缓冲液为pH5.2、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上；UV280nm检测，收集洗脱峰有酶活部分。
[0034](4)凝胶柱层析:填料:HiPrepl6/60Sephacryl S-100HR ;柱体积 120mL ;平衡、洗脱液:pH5.0、50mmol/L 醋酸-醋酸盐缓冲液(含 0.15mol/L NaCl);流速 0.5mL/Tub/min ;上样:经阴离子交换柱层析吸附有酶活部分，浓缩换缓冲液为pH5.0、50mmol/L醋酸-醋酸盐后上样，UV280nm检测，收集有酶活峰，经SDS-PAGE及质谱鉴定为AXAH后(表1 )，进行冷冻干燥冻成干粉。
[0035]表1蛋白质质谱分析中基本信息和匹配的肽段序列
[0036]QueryObservedMr(cxpt)Mr(calc)ScorcPeptide
21gg
281556.75141555.74411555,726753K.AFVSEYAVTGNDAGR.C
36Π87.81711786.80981786.794472K.YVAIGNEDCGKENYR.G
条:Φ2 81136.49411135.48681135.525857R.GSAESTWGSVR.A
121178.57711177.56981177.597962K.DILDSLEFAR.G
161280.619 丨1279.61181279,638342R.A AM G HPEPFP VK.Y
251511.67541510.66811510.702786R.FPGGCFVEGSWLR.N
321556.70491555.69761555.7267I OSK.AFVSEYAVTGNDAGR.G
431787.77221786.76491786.794460K.YVA1GNF.DCGKENYR.G
[0037]注:登录号:gi113398412,分子量:72557 ；arabinoxylan arabinofuranohydrolaseisoenzyme AXAH-1 [Hordeum vulgare]。条带2为蛋白质翻译后修饰体。
[0038]大麦麦芽中AXAH活性检测方法如下:采用分光光度计法。反应:酶液和底物4-硝基苯基- a -L-阿拉伯呋喃糖苷，40°C反应30min，然后通过0.5mol/L的碳酸钠溶液中止反应，415nm测定吸光值。每分钟水解生成I μ mo I对硝基酚定义为一个活力单位(U)。
[0039]实施例2 =AXAH添加实验改善过滤性能的效果验证
[0040]检验本发明对大麦麦芽过滤性能的改善，选用江苏单二麦芽进行试验，酶添加三个水平4mU/g，6mU/g和8mU/g，检测项目包括过滤速度、浊度、粘度、浸出率、β -葡聚糖和多聚阿拉伯木聚糖含量。
[0041]麦芽糖化工艺使用协定糖化法，具体为:50g的麦芽粉十200mL46~47°C水+酶样—在不断搅拌下45°C保温30min — 25min内升温至70°C (约Imin升1°C )，+100mL70°C水，在70°C保温60min —在10~15min，冷却到室温一冲洗搅拌器，加水使内容物的称量为450g —项目检测。单二麦芽的常规指标和检测结果见表2和表3。
[0042]由表3可见，通过添加本发明的AXAH且随着AXAH添加量的增加，麦汁的过滤速度和浸出率逐步升高，粘度降低，多聚阿拉伯木聚糖和β_葡聚糖的含量也得到了有效的减少，有效的改善了的过滤性能。
[0043]表2单二麦芽常规指标
【权利要求】
1.阿拉伯呋喃糖苷水解酶AXAH用于提高麦芽汁过滤性能。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，是在麦芽糖化过程中加入阿拉伯呋喃糖苷水解酶。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶氨基酸序列如SEQID N0.1 所示 。
4.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶添加量为4~8mU/g麦芽。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，是在麦芽糖化初始阶段加入4~8mU/g阿拉伯呋喃糖苷水解酶。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，是在麦芽糖化初始阶段加入4mU/g阿拉伯呋喃糖苷水解酶。
7.如权利要求5所述方法，其特征在于，是在麦芽糖化初始阶段加入6mU/g阿拉伯呋喃糖苷水解酶。
8.如权利要求5所述方法，其特征在于，是在麦芽糖化初始阶段加入8mU/g阿拉伯呋喃糖苷水解酶。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述阿拉伯呋喃糖苷水解酶制备方法如下: 1)对大麦麦芽进行粉碎后加入醋酸-醋酸盐缓冲液，进行浸提； 2)低温离心取上清液进行20~40%饱和度的硫酸铵沉淀盐析，然后离心取沉淀用醋酸-醋酸盐缓冲液复溶，再离心取上清液得到含盐粗酶液； 3)将含盐粗酶液置于透析袋中，用醋酸-醋酸盐进行透析，得到去盐的透析液，离心去除变性蛋白得到粗酶液； 4)用蛋白纯化系统，利用阳离子交换柱、阴离子交换柱和凝胶柱纯化粗酶液，得到AXAH纯品。
10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述步骤4)中:采用HiPrepl6/10SPFF20mL强阳离子柱，用一定PH和浓度的醋酸-醋酸盐缓冲液平衡，收集有酶活液体进行超滤浓缩并更换缓冲液为一定PH和浓度的醋酸-醋酸盐，得到部分纯化酶液；采用HiPrepl6/10Q FF强阴离子柱，用一定pH和浓度的醋酸-醋酸盐缓冲液平衡，待紫外吸收和电导基线稳定后，再用含lmol/L NaCl的缓冲液进行线性洗脱，洗脱一定的柱体积，收集有酶活部分进行超滤浓缩，得到进一步部分纯化酶液；采用HiPrepl6/60Sephacryl S-100HR凝胶柱,用一定pH和浓度，含0.15mol/L NaCl的醋酸-醋酸盐缓冲液洗脱，收集有酶活部分，得到AXAH纯品。
【文档编号】C12C7/04GK103571673SQ201310540755
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】李晓敏, 高飞, 陆健, 金昭, 蔡国林, 孙军勇 申请人:江南大学