甘蔗毛细管电泳dna指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法
【专利摘要】一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法，包括以下步骤：1)提取甘蔗叶片总DNA；2)在SSR引物的作用下进行PCR反应；3)PCR扩增产物的毛细管电泳分析；4)利用毛细管电泳产生的电泳峰的位置、高度和面积参数建立甘蔗样本DNA指纹图谱。本发明充分利用了甘蔗DNA中丰富的SSR遗传多样性，DNA指纹图谱信息量大、实用性强、结果准确、稳定、重复性好、灵敏度高，具有十分广阔的应用前景。
【专利说明】甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及甘蔗品种资源鉴定技术，具体地说是一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建及甘蔗品种资源鉴定的方法。
【背景技术】
[0002]甘蔗是我国及世界重要的糖料作物。甘蔗在分类上属于禾本科甘蔗属(Saccharum)0目前，甘蔗品种资源的鉴别主要是依据外观性状。外观性状鉴别过于依赖鉴别人员的经验和感觉，主观性强，可信度较低。同时外观性状受环境影响大，也会导致鉴别错误，加之甘蔗品种的相似度越来越高，导致鉴别越来越困难。由于DNA遗传物质受环境影响小、多态性高，DNA指纹鉴定技术已成为作物品种鉴定最有效的方法，目前在甘蔗品种资源的鉴别方面也开始逐步应用。
[0003]DNA指纹鉴定技术是利用生物体内遗传信息载体DNA对生物物种进行鉴别的方法，近年来已经被广泛地应用于植物品种资源的鉴定。目前应用于构建DNA指纹图谱的分子标记方法主要有:限制性片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphisms, RFLP)分析技术，随机扩增 DNA 多态性(Random Amplified PolymorphicDNA,RAPD)分析技术，扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphisms,AFLP)分析技术,简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)分析技术,单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析技术,在 RAPD 和 RFLP 技术基础上建立了序列特异性扩增区域(Sequence characterized amplified regions, SCAR)、酶切扩增多态序列(Cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS)和DNA扩增指纹(DNA amplifiedfingerprints, DAF)等分析技术。其中Moore等于1991年结合PCR技术创立了 SSR标记技术，SSR也称微卫星DNA，是一类由几个(多为I~6个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10~60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了 SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。与其他分子标记技术相比，SSR具有如下优点:
[0004]1.SSR引物是根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计的，具有很强的特异性；
[0005]2.SSR序列在群体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性；
[0006]3.SSR重复性和稳定性好。
[0007]毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)具有快速、灵敏、分辨率高等优点。CE可以满足SSR分析对扩增产物高分辨率的要求，分辨率可达lbp，精确展现扩增结果的多态性；CE分析得到的电泳峰可以精确的定位PCR扩增产物迁移的位置，即PCR扩增产物的大小；CE分析得到的电泳峰的峰高和峰面积可以精确的反应PCR扩增产物的量。
[0008]近年来，Cordeiro,G.M., Pan, Y.B., Henry, R.J.(2003).Sugarcanemicrosatellites for the assessment of genetic diversity in sugarcane germplasm.Plant Science, 165 (I)，181-189、梁俊，PAN Yong-Baoj 李杨瑞，方锋学.(2010).利用 SSR标记与毛细管电泳对甘蔗属进行的遗传分析.广西植物，30 (I): 106-111，Qi，Y.1，Pan, Y.B.，Laoj F.Y.，Zhang, C.Μ.，Fan, L.N.，He，H.Y.，Liuj R.，Wang, Q.N.，Liuj S.M.，Liuj F.Y., Li, Q.W., Deng,Η.H.(2012).Genetic Structure and Diversity of ParentalCultivars Involved in China Mainland Sugarcane Breeding Programs as Inferredfrom DNA Microsatellites.Journal of Integrative Agriculture，11(11)，1794-1803 ;You, Q., Xuj L., Zheng, Y., Quej Y.(2013).Genetic Diversity Analysis of SugarcaneParents in Chinese Breeding Programmes Using gSSR Markers.The Scientific WorldJournal, 2013.等利用SSR分子标记结合毛细管电泳技术开展甘蔗种质资源遗传多样性等方面的研究。同时，在甘鹿DNA指纹图谱研究方面澳大利亚Piperidis, G.，Rattey, A.R., Taylor, G.0., Cox, M.C., (2004).DNA markers: A tool for identifying sugarcanevarieties.Austral Sugarcane, 8(suppl):1-8 ; 美国 Pan, Y.B.(2010).Databasingmolecular identities of sugarcane(Saccharum spp.) clones constructed withmicrosatellite (SSR)DNA markers.American Journal of Plant Sciences, I(2), 87-94.等研究者使用SSR分子标记结合毛细管电泳技术建立了各自的甘蔗分子身份证数据库。但是，不管是利用毛细管电泳开展甘蔗种质资源遗研究或者DNA指纹图谱方面的研究，所有的这些研究都是利用毛细管电泳峰的有无即数字化后的1、0数据进行分析研究，都没有涉及到毛细管电泳峰特征数据的利用，而本发明则是基于毛细管电泳峰的特征数据的应用。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种可用于甘蔗品种资源鉴别的基于毛细管电泳技术的DNA指纹图谱构建方法及鉴定方法。
[0010]本发明通过以下技术方案达到上述目的:一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括下述步骤:
[0011]I)甘蔗DNA提取:按CT AB、SDS或者DNA提取试剂盒等方法提取甘蔗DNA ；
[0012]2)甘蔗DNA的PCR扩增:以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物；
[0013]3) PCR扩增产物的分析:采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱；
[0014]4)毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积；
[0015]5)毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，将电泳峰高度最高或者电泳峰面积最大的电泳峰的特征数据标准化为1，其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化；
[0016]6)利用对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据标准化值构建甘蔗DNA指纹图谱。
[0017]一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹的鉴定方法，包括下述步骤:
[0018]I)甘蔗样品DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取试剂盒等方法提取甘蔗DNA ；[0019]2)甘蔗样品DNA的PCR扩增:以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物；
[0020]3) PCR扩增产物的分析:采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱；
[0021]4)甘蔗样品毛细管电泳DNA指纹图谱的建立:以上述构建甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法建立甘蔗样品的DNA指纹图谱；
[0022]5)甘蔗样 品鉴定:利用相关分析算法比较样品DNA指纹图谱与甘蔗DNA指纹图谱数据库中DNA指纹图谱的相关性，根据相关系数对甘蔗样品DNA进行鉴定。
[0023]所述甘蔗DNA指纹图谱为甘蔗属甘蔗杂交品种或者种质资源DNA指纹图谱。
[0024]所述的甘鹿DNA的PCR扩增采用的引物为SSR(simple sequence repeat,简单序列重复,也称微卫星)引物。
[0025]本发明的突出优点在于:
[0026]利用SSR分子标记结合毛细管电泳技术构建甘蔗DNA指纹图谱，克服了传统琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率低、灵敏度低、精确度低、结果分析困难等缺点；
[0027]利用毛细管电泳峰的特征数据来构建DNA指纹图谱，比常规应用电泳条带的有无(数字化为1、0数据)等数据带有更多的信息量；应用相关分析算法对待鉴定样品进行鉴定分析，充分反映DNA指纹图谱的特征，结果客观、准确。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]附图1为甘蔗SSR分子标记毛细管电泳图谱及电泳峰特征值。
[0029]图中横坐标为PCR扩增产物的大小，纵坐标为电泳峰高度；电泳峰顶端显示数值，上为电泳峰高度值，下为电泳峰面积。
[0030]附图2为续甘蔗SSR分子标记毛细管电泳图谱及电泳峰特征值。
[0031]图中横坐标为PCR扩增产物的大小，纵坐标为电泳峰高度；电泳峰顶端显示数值，上为电泳峰高度值，下为电泳峰面积。
【具体实施方式】
[0032]以下结合实施案例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0033]实施例1
[0034]本发明所述的甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，包括如下步骤:
[0035]1.甘蔗DNA提取
[0036]将甘蔗叶片在液氮中磨成粉末后，将0.1g的甘蔗叶粉末转移到2mL离心管中，加入500μ L65°C预热的2XCTAB缓冲液，然后于65°C温育30min，中间摇动4_5次，取出离心管冷却后，加入500 μ L氯仿:异戊醇按24:1混合均匀，然后在12000rpm、室温、离心lOmin，转移上清液至新的离心管中，加入2/3体积的异丙醇，混匀，_20°C静置I小时；4°C下1000Orpm离心5min,去上清；加入500 μ L76%乙醇洗漆沉淀2次,室温晾干,加入100 μ LTE buffer 溶解 DNA，_20°C保存。
[0037]2.PCR 扩增
[0038]以甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，本实施案例中使用的SSR引物为SMC1604SA，荧光标记为FAM，引物序列为:
[0039]SMC1604SA-F (5’_3， ) =FAM-AGG GAA AAG GTA GCC TTG G
[0040]SMC1604SA-R (5’_3，):TTC CAA CAG ACT TGG GTG G
[0041]PCR 反应体系为 20 μ L，其中 50ng DNA 模板 I μ L, I XPCR Buffer2 μ L, 3mmolMg2+0.6 μ L，2mmol/each dNTP2 μ L，10 μ mo I SMC1604SA-F 和 SMC1604SA-R 引物各 0.5 μ L,5U/ μ L Taq 酶 0.2 μ L，ddH2013.2 μ L。
[0042]PCR 反应程序为:95°C预变性 5min ;94°C变性 30s，59°C退火 60s，72°C延伸 60s，35个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0043]3.PCR产物毛细管电泳分析
[0044]毛细管电泳仪器为ABI公司PRISM3730测序仪，样品上样处理参照仪器说明要求，毛细管电泳进样电压为_15kV，进样时间为40s，分离电压为_15kV，温度控制为25°C。
[0045]4.甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的建立
[0046]根据步骤3得到的毛细管电泳图谱，挑选符合SSR引物设计目标产物大小和重复单位特征的电泳峰，进行毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积；然后进行毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，将电泳峰高度最高或者电泳峰面积最大的电泳峰的特征数据标准化为I，其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化；最后利用对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据构建甘蔗DNA指纹图谱。如图1，图2，表1，表2所示。
[0047]实施例2
[0048]将本发明的甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱用于某个甘蔗样品的鉴定
[0049]甘蔗品种资源毛细管电泳DNA指纹图谱数据库建立以后，要对某个样品进行鉴定时，首先提取其DNA，并作为DNA模板进行PCR扩增，使用的SSR引物与建立甘蔗品种资源毛细管电泳DNA指纹图谱数据库的引物一致，PCR扩增产物进行毛细管电泳分析，将毛细管电泳峰特征数据进行标准化，应用相关分析方法将待测样品与数据库中的数据进行比较，根据相关系数对待测样品进行鉴定。
[0050]鉴定结果:若待测样品与中数据库中某个甘蔗品种资源的的相关系数3 99%，则可以确定该待测样品身份；若待测样品与数据库中所有甘蔗品种资源的的相关系数都小于95%，则可以确定该待测样品为一个新材料，可以追加到数据库中；若待测样品与数据库中所有甘蔗品种资源的的相关系数在95-99%之间，则需要通过人工辅助判定。
[0051]在实施案例I中甘蔗材料桂糖97-40和P0J2931之间如果通过电泳峰的有无，即
1、0数据来比较则结果为两者100%—致，但是如果应用本发明的鉴定方法通过两种电泳峰标准化特征值的相关系数来判断则发现两者之间的相关系数为r=0.8767，根据鉴定标准则可以将两者区分开来。
[0052]表1为甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱毛细管电泳峰特征原始数据。
[0053]表2为甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱毛细管电泳峰特征标准化数据。
[0054]
【权利要求】
1.一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括下述步骤: O甘蔗DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取试剂盒的方法提取甘蔗DNA ； 2 )甘蔗DNA的PCR扩增:以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物； 3)PCR扩增产物的分析:采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱； 4)毛细管电泳图谱有效特征数据采集，包括对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置、电泳峰的高度、电泳峰的面积； 5)毛细管电泳图谱有效特征数据的标准化，将电泳峰高度最高或者电泳峰面积最大的电泳峰的特征数据标准化为1，其余电泳峰则通过其电泳峰高度与最高电泳峰的比值或者电泳峰面积与最大电泳峰的比值来标准化； 6)利用对应PCR扩增产物的大小的电泳峰的位置及其对应的电泳峰特征数据标准化值构建甘蔗DNA指纹图谱。
2.一种甘蔗毛细管电泳DNA指纹的鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤: O甘蔗样品DNA提取:按CTAB、SDS或者DNA提取试剂盒的方法提取甘蔗DNA ； 2)甘蔗样品DNA的PCR扩增:以提取的甘蔗DNA为模板进行PCR扩增，采用的引物为SSR引物； 3)PCR扩增产物的分析:采用毛细管电泳分析PCR扩增产物，记录毛细管电泳图谱； 4)甘蔗样品毛细管电泳DNA指纹图谱的建立:以所述构建甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法建立甘蔗样品的DNA指纹图谱； 5)甘蔗样品鉴定:利用相关分析算法比较样品DNA指纹图谱与甘蔗DNA指纹图谱数据库中DNA指纹图谱的相关性，根据相关系数对甘蔗样品DNA进行鉴定。
3.如权利要求1所述的甘蔗毛细管电泳DNA指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述甘蔗DNA指纹图谱为甘蔗属甘蔗杂交品种或者种质资源DNA指纹图谱。
【文档编号】C12Q1/68GK103540678SQ201310540631
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】周会, 潘永保, 李杨瑞, 杨荣仲 申请人:广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所