一种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，包括：将经活化的蚜虫拟酵母（Pseudozyma?aphidis）DSMZ70725接入种子培养液中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞；将菌体细胞接入发酵培养基中，于28～30℃条件下发酵培养7～15d，得到发酵液；从发酵液中分离纯化得到甘露糖赤藓糖醇脂；其中，所述的发酵培养基中含有植物油。本发明以植物油为底物，在合适的工艺下，通过微生物细胞转化生产甘露糖赤藓糖醇脂。本发明方法所用底物为可再生资源，产物无毒、环保，所得到的发酵液具有高表面活性；发酵过程中菌丝团小，底物转化充分，粗产物产量大大提高；生产过程安全、简便且易操作，产品品质高，容易实现产业化生产。
【专利说明】一种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵领域，尤其涉及一种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法。
【背景技术】
[0002]表面活性剂是能够显著降低表面张力的两亲性物质，在工农业生产中发挥着重要作用。但现在国内市场应用的表面活性剂大多数是以石油为原料经人工化学合成的，在其生产过程中容易造成环境污染和质量安全等问题，而由微生物转化获得的表面活性剂，即生物表面活性剂则不存在此类问题。因此，生物表面活性剂将成为替代化学合成表面活性剂的选择之一。生物表面活性剂是微生物在代谢过程中分泌的一种有高表面活性的物质，具有生物相容性、生物可降解性、无毒或低毒等特性，此外还具有多样性的结构和生理活性。根据结构特点，生物表面活性剂可分为糖脂类、脂肽和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂等五大类。
[0003]甘露糖赤藓糖醇脂(Mannosylerythritol lipids, MELs)是一种糖脂类生物表面活性剂，与槐糖脂、鼠李糖脂相比，是现今国内研究较少的一类糖脂。MELs不仅具有良好的表面活性、乳化性、生物降解性、较低的临界胶束浓度，还具有许多特殊的生理活性，如抑制微生物生长、诱导细胞变异、可分化人类骨髓性白血病细胞系和黑素瘤细胞、提高基因转染效率、与糖蛋白有很强的配位能力等，可应用于环保、食品、化妆品、医药等行业。
[0004]关于MELs的生物转化研究，国内报道较少。华兆哲等研究假丝酵母Candidaantarctic WHS112利用豆油为唯一碳源，获得了生产甘露糖赤藓糖醇脂的摇瓶发酵优化条件，最适条件为接种量5%~8%(v/v)，氮源为0.2%硝酸钠，温度为25°C，250mL三角瓶装液量为30mL,初始pH6.0 (华兆哲，陈坚，朱文昌，等.假丝酵母(Candida antarcticWSHl 12)生产生物表面活性剂及降解正构烷烃的研究.南京大学学报(自然科学)，1998，32 (2): 149-154)。但是在该优化条件下,MELs的合成产量不高。Rau等研究了由Pseudozymaaphidis DSM70725发酵生产MELs的条`件。在发酵过程中及时补料，并添加甘露糖和赤藓糖醇作为碳源，经过10天的发酵,最高产量可达75g/L (U.Rau, L.A.Nguyen, S.Schulz, etal.Formation and analysis of mannosylerythritol lipids secreted by Pseudozymaaphidis.Appl Microbiol Biotechnol，2005，66:551-559)。
[0005]但是，目前产量仍不高，难以工业化生产，主要原因在于现今所釆用的MELs生产方法存在细胞生长密度大、产物难以分离提取、MELs合成量低、不宜连续生产、原料生产成本闻等缺点。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，解决现有生物法制备甘露糖赤藓糖醇脂工艺不成熟、原料成本高、产物产量低的问题。
[0007]—种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，包括:
[0008](I)将经活化的姆虫拟酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725接入种子培养液中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞；
[0009](2)将菌体细胞接入发酵培养基中，于28~30°C条件下发酵培养7~15d，得到发酵液；
[0010](3)从发酵液中分离纯化得到甘露糖赤藓糖醇脂；
[0011]其中，所述的发酵培养基中含有植物油。
[0012]本发明所使用菌种为姆虫拟酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725,该菌种购于德国菌种保藏中心，Deutsche Sammulung von Microorganismen und Zellkulturen(DSMZ)0
[0013]步骤(1)中，所述的活化为:将蚜虫拟酵母DSMZ70725接种到活化培养基中，于25~30°C培养3~5d ;活化培养基可以为麦芽糖琼脂培养基。优选地，将蚜虫拟酵母DSMZ70725接种到麦芽糖琼脂培养基中，于28°C培养4d，待菌丝体长满平板备用。
[0014]以重量百分比计，所述的种子培养液包括以下成分:葡萄糖4.0~8.0%，硝酸钠0.1~0.5%,硫酸镁0.01~0.05%,磷酸二氢钾0.01~0.05%,酵母粉0.1~1.0%。优选地，所述的种子培养液包括以下成分:葡萄糖4.0%，硝酸钠0.3%，硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.03%，酵母粉 0.1%。
[0015]所述种子培养的培养温度为28~30°C，培养时间为3~5d。
[0016]种子培养完成后，菌体细胞可以通过如下方法分离得到:将培养后的种子液体离心，取菌体细胞，并用浓 度0.9%的氯化钠溶液洗涤2~3次。
[0017]步骤(2)中，以每升发酵培养基计，所述菌体细胞的接入量可以为10~100g ;优选为 IOgo
[0018]所述的植物油可以为大豆油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油、花生油、棉籽油、米糠油、玉米胚芽油、油茶籽油、红花籽油和小麦胚芽油中的至少一种。植物油可以为单种油或不同植物油调配而成的调和油，以其作为生物转化的底物，生产所得的表面活性剂安全无毒、品质优良，而且以可再生资源为转化底物，可以有效减少环境污染，降低生产成本。
[0019]优选地，所述的植物油为大豆油、花生油和菜籽油的混合物，产物产率较高。
[0020]以重量百分比计，所述的发酵培养基包括以下成分:植物油4.0~12.0%，蛋白胨O~1.0%，硝酸钠0.1~1.0%，硫酸镁0.01~0.1%，磷酸二氢钾0.01~0.1%，硫酸锰0.01~0.1%，硫酸铜0.01~0.1%，酵母粉0.1~1.0%。优选地，所述的发酵培养基包括以下成分:植物油8.0%，蛋白胨0.1%，硝酸钠0.3%，硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.03%,硫酸锰0.03%,硫酸铜0.01%，酵母粉1.0%。
[0021]所述的发酵培养基中可以加入已灭菌的玻璃珠，防止菌丝体成团。
[0022]所述发酵培养的培养时间优选为10~15d，使底物能够被充分转化。
[0023]所述的发酵培养为摇床振荡培养，摇床转速为150~220rpm。
[0024]步骤(3)中，所述的分离纯化包括:将发酵液用有机溶剂萃取、分离2~3次，合并有机相，减压浓缩除去有机溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂粗品；采用硅胶柱层析法对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步分离纯化，先用正己烷洗脱，再用氯仿/甲醇进行梯度洗脱，得到甘露糖赤藓糖醇脂。
[0025]本发明以植物油为底物，利用假丝酵母菌，在合适的工艺下，通过微生物静息细胞转化生产生物表面活性剂甘露糖赤藓糖醇脂。[0026]本发明方法生产甘露糖赤藓糖醇脂，所用底物为可再生资源，产物无毒、环保，所得到的发酵液具有高表面活性。发酵过程中菌丝团小，底物转化充分，粗产物产量大大提高。本发明方法生产过程安全、简便且易操作，产品品质高，容易实现产业化生产。
【具体实施方式】
[0027]以下实施例中，所用菌种为Φ牙虫拟酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725。该菌种购于德国菌种保藏中心，Deutsche Sammulung von Microorganismen und Zellkulturen(DSMZ)0
[0028]实施例1
[0029]本实施例中所用的植物油为大豆油。
[0030](I)菌种活化:以灭过菌的麦芽糖琼脂平板为活化培养基，接入冷藏保存的菌株蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725，在28°C条件下活化培养4d，待菌丝体长满平板备用。
[0031](2)种子培养:从平板培养基上挑取IcmX Icm的菌丝块3块接入装有50mL种子培养液的250mL三角瓶中，在28°C、220rpm条件下4d ;将培养好的种子液体离心，取菌体细胞，并用0.9%氯化钠溶液洗涤3次；
[0032]其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0%，硝酸钠0.3%，硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.03%，酵母粉0.1%，蒸馏水。
[0033](3)发酵培养:将菌体细胞按湿重比例10g/L接入装有IOOmL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28°C、220rpm条件下培养IOd ；
[0034]其中，发酵培养基的成分包括:大豆油8.0%，蛋白胨0.1%，硝酸钠0.2%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.03%,硫酸锰0.02%,硫酸铜0.02%,酵母粉1.0%，蒸馏水。发酵培养基中加入已灭菌的玻璃珠。
[0035](4)分离纯化:发酵培养完成后，离心，除去菌体及玻璃珠，得到发酵液；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品，约为80g/L。
[0036]所得到的甘露糖赤藓糖醇脂粗产品，采用硅胶柱层析法进一步分离纯化:将3X40cm的玻璃层析柱洗净烘干，并用氯仿润湿。用氯仿浸泡200~300目硅胶，除去杂质，湿法装柱，用氯仿平衡。粗样品溶于氯仿，缓慢上样，样品先用正己烷洗脱。再用氯仿和甲醇按照比例进行梯度洗脱，即氯仿:甲醇=1:10、5:5和O:1逐步洗脱，控制洗脱速率为0.SmL/min0每管收集10mL。分离后的各组分，用TLC鉴定，相同部分合并。得到较纯样品。
[0037]实施例2
[0038]本实施例中所用的植物油为调和油，按照体积比计算，组成为大豆油:花生油:菜籽油=6:3:1。
·[0039](I)菌种活化:以灭过菌的麦芽糖琼脂平板为活化培养基，接入冷藏保存的菌株蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725，在28°C条件下活化培养4d，待菌丝体长满平板备用。
[0040](2)种子培养:从平板培养基上挑取IcmX Icm的菌丝块3块接入装有50mL种子培养液的250mL三角瓶中，在28°C、220rpm条件下4d ;将培养好的种子液体离心，取菌体细胞，并用0.9%氯化钠溶液洗涤3次；
[0041]其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0%，硝酸钠0.3%，硫酸镁0.03%，磷酸二氢钾0.03%，酵母粉0.1%，蒸馏水。
[0042](3)发酵培养:将菌体细胞按湿重比例10g/L接入装有IOOmL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28°C、220rpm条件下培养IOd ；
[0043] 其中，发酵培养基的成分包括:调和油10.0%，硝酸钠0.3%，硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.03%，硫酸锰0.02%，硫酸铜0.02%，酵母粉1.0%，蒸馏水。发酵培养基中加入已灭菌的玻璃珠。
[0044](4)分离纯化:发酵培养完成后，离心，除去菌体及玻璃珠，得到发酵液；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品，约为88g/L。
[0045]所得到的甘露糖赤藓糖醇脂粗品，采用硅胶柱层析法进一步分离纯化:将3X40cm的玻璃层析柱洗净烘干，并用氯仿润湿。用氯仿浸泡200~300目硅胶，除去杂质，湿法装柱，用氯仿平衡。粗样品溶于氯仿，缓慢上样，样品先用正己烷洗脱。再用氯仿和甲醇按照比例梯度洗脱，即氯仿:甲醇=1:10、5:5和O:1逐步洗脱，控制洗脱速率为0.8mL/min。每管收集10mL。分离后的各组分，用TLC鉴定，相同部分合并。得到较纯样品。
[0046]实施例3
[0047]本实施例中所用的植物油为大豆油。
[0048](I)菌种活化:以灭过菌的麦芽糖琼脂平板为活化培养基，接入冷藏保存的菌株蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis) DSMZ70725，在28°C条件下活化培养4d，待菌丝体长满平板备用。
[0049](2)种子培养:从平板培养基上挑取IcmX Icm的菌丝块3块接入装有30mL种子培养液的250mL三角瓶中，在28°C、220rpm条件下3d ;将培养好的种子液体离心，取菌体细胞，并用0.9%氯化钠溶液洗涤3次；
[0050]其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0%，硝酸钠0.2%，硫酸镁0.02%,磷酸二氢钾
0.02%，酵母粉0.1%，蒸馏水。
[0051](3)发酵培养:将菌体细胞按湿重比例10g/L接入装有IOOmL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28°C、220rpm条件下培养15d ；
[0052]其中，发酵培养基的成分包括:大豆油8.0%，硝酸钠0.3%，硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.03%，硫酸锰0.02%，硫酸铜0.01%，酵母粉1.0%，蒸馏水。发酵培养基中加入已灭菌的玻璃珠。
[0053](4)分离纯化:发酵培养完成后，离心，除去菌体及玻璃珠，得到发酵液；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品，约为80g/L。
[0054]所得到的甘露糖赤藓糖醇脂粗品，采用硅胶柱层析法进一步分离纯化:将3X40cm的玻璃层析柱洗净烘干，并用氯仿润湿。用氯仿浸泡200~300目硅胶，除去杂质，湿法装柱，用氯仿平衡。粗样品溶于氯仿，缓慢上样，样品先用正己烷洗脱。再用氯仿和甲醇按照比例梯度洗脱，即氯仿:甲醇=1:10、5:5和O:1逐步洗脱，控制洗脱速率为0.8mL/min。每管收集10mL。分离后的各组分，用TLC鉴定，相同部分合并。得到较纯样品。
【权利要求】
1.一种甘露糖赤藓糖醇脂的生产方法，包括: (1)将经活化的蚜虫拟酵母(Pseudozymaaphidis) DSMZ70725接入种子培养液中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞； (2)将菌体细胞接入发酵培养基中，于28~30°C条件下发酵培养7~15d，得到发酵液； (3)从发酵液中分离纯化得到甘露糖赤藓糖醇脂； 其中，所述的发酵培养基中含有植物油。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，以重量百分比计，所述的种子培养液包括以下成分:葡萄糖4.0~8.0%，硝酸钠0.1~0.5%，硫酸镁0.01~0.05%,磷酸二氢钾0.01~0.05%，酵母粉0.1~1.0%。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养的培养温度为28~30°C，培养时间为3~5d。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，以每升发酵培养基计，所述菌体细胞的接入量为10~100g。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的植物油为大豆油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油、花生油、棉籽 油、米糠油、玉米胚芽油、油茶籽油、红花籽油和小麦胚芽油中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述的植物油为大豆油、花生油和菜籽油的混合物。
7.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，以重量百分比计，所述的发酵培养基包括以下成分:植物油4.0~12.0%，蛋白胨O~1.0%，硝酸钠0.1~1.0%，硫酸镁0.01~0.1%，磷酸二氢钾0.01~0.1%，硫酸锰0.01~0.1%，硫酸铜0.01~0.1%，酵母粉0.1~1.0%。
8.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养的培养时间为10~15d。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的发酵培养为摇床振荡培养，摇床转速为150~220rpm。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的分离纯化包括:将发酵液用有机溶剂萃取、分离2~3次，合并有机相，减压浓缩除去有机溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂粗品；采用硅胶柱层析法对甘露糖赤藓糖醇脂粗品进一步分离纯化，先用正己烷洗脱，再用氯仿/甲醇进行梯度洗脱，得到甘露糖赤藓糖醇脂。
【文档编号】C12R1/645GK103589764SQ201310540906
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】陈启和, 范琳琳, 董亚晨 申请人:浙江大学